骨髓增生异常综合征患者源成骨细胞表达多种细胞因子并体外维持造血祖细胞存活

为了解骨髓增生异常综合征（MDS）患者成骨细胞的生物学特性,并探讨其对体外造血的支持能力,利用骨髓间充质干细胞多向分化潜能将其诱导分化为成骨细胞,在体外和造血细胞构建二维培养体系,研究其体外支持造血祖细胞生存的作用;同时采用RT-PCR的方法在mRNA水平上分析由骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞细胞因子的表达并与人成骨细胞系hFOB1.19比较。结果发现,来源于MDS患者的成骨细胞在无外源性细胞因子的条件下能够短期维持GM-CFC造血祖细胞的存活。经过RT-PCR证实,人成骨细胞系hFOB1.19表达SCF、IL-6、SDF-1α、G-CSF、GM-CSF等细胞因子,来源于MDS患者和正常人的成骨细胞也能表达上述细胞因子,但却不表达GM-CSF。结论：与正常人相比,MDS患者源的成骨细胞同样能够维持GM-CFC的存活,这可能和成骨细胞表达多种重要的造血相关的细胞因子有关。     

人骨髓间充质干细胞表达多种造血细胞因子

为了研究培养的人骨髓间充质干细胞在造血中的生物作用，采用RT—PCR方法在mRNA水平上分析体外培养的人骨髓间充质干细胞(BM—MSC)造血因子的表达，以及氢化考的松对BM—MSC表达造血细胞因子的影响。结果显示，体外传代培养的正常人、白血病和淋巴瘤等血液病人BM—MSC均能表达SCF，Flt3-ligand TPO,LIF,IL—6和IL—11等重要的造血细胞因子，但不表达G—CSF，GM—CSF和IL-3。不同代数的BM—MSC细胞，造血细胞因子的表达相同。BM—MSC经氢化考的松作用7—21天后，可谤手G—GSFmRNA表达，但不诱导GM—GSF的表达，细胞在形态学上也未发生明显改变。结论：体外培养的正常人和本组血液病病人BM—MSC具有促造血功能。     

间充质干细胞与相关因子

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞及成肌细胞分化的多向潜能，可在造血微环境形成、组织修复及基因治疗中得到应用。多种生长因子如TGF—β，IGF—I，BMP及FGF在MSC分化中发挥不同的促进作用并有协同性；MSC可分泌G—CSF，SCF，LIF，M—CSF，IL—6和IL—11等多种细胞因子支持造血并与某些疾病的发生有关；相关因子作用后的MSC将在基因工程应用中发挥重要作用。     

低危骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞的生物学特性的实验研究

骨髓增生异常综合征的发病机制至今尚未明确，有研究表明MDS患者骨髓基质微环境功能的异常与其发病有关。间充质干细胞是造血微环境的重要成分，本研究拟探讨低危MDS患者间充质干细胞（MSC）的生物学特性及功能．采集低危MDS患者的骨髓标本，分离、培养和扩增MSC，观察细胞形态，进行免疫表型、成骨分化能力鉴定，检测其增殖能力及对体外造血的支持功能；用实时定量RT—PCR法测定MSC中相关细胞因子及化学趋化因子的表达，并与健康供者的MSC进行比较。结果表明：培养低危MDS患者的MSC呈典型的成纤维细胞样，细胞表达SH2（CD105），SH3（CD73），Thy—1（CD90），CD34及CD45均为阴性，诱导后可向成骨细胞分化。其体外扩增能力与与健康供者相比无显著差异（P〉0．05），但体外支持造血功能较后者显著减低（P〈0．05）。实时定量PT—PCR显示SDF—1在低危MDS患者MSC中显著高表达（P〈0.01）。结论：间充质干细胞的功能异常与低危MDS患者骨髓微环境的造血调控失常相关，这为MDS发病机制的认识及治疗提供了新的思路，值得进一步探讨。     

兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及其对不同生长因子的反应

为了研究兔骨髓间充质干细胞（rBM—MSC）的生物学特征及其对不同生长因子的反应，使用贴壁培养法从兔骨髓单个核细胞中获得间充质干细胞（MSC），在光学显微镜和电子显微镜下观察其基本生长行为和生物学特征；使用流式细胞仪检测rBM—MSC的免疫学表型；RT—PCR法检测其胶原表达；诱导rBM—MSC多向分化并使用特异性染色和RT—PCR予以鉴定；最后使用MTT法检测IL—1、3、8和HGF对rBM—MSC生长增殖的影响。结果显示：贴壁生长的rBM—MSC具有典型的成纤维样细胞形态，可传15代以上，第5代rBM—MSC高表达基质受体CD44（32％），低表达造血细胞标记CD45（4．7％）；RT—PCR显示高表达Ⅰ型胶原，弱表达Ⅱ型胶原，不表达X型胶原；在不同的诱导条件下．rBM—MSC可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。rBM—MSC对IL-3最为敏感．10ng／ml的低浓度IL-3可显著促进细胞增殖达32％以上（P〈0．01），而高浓度IL-3能显著抑制其生长。结论：分离培养了rBM—MSC，其生物学特征与人和猕猴等BM—MSC相似的生物学特性，低浓度IL-3可有效促进其增殖。     

多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞生物学特性分析

为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor，SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31；MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能；MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常；MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论：MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。     

间充质干细胞迁移的研究进展

骨髓中主要包括两种多能干细胞,即造血干细胞(hemato-poietic cell,HSC)和非造血干细胞,后者中以间充质干细胞(mes-encbymal stem cell,MSC)为主.MSC具有自我增殖和多向分化的潜能,特定条件下可分化为中胚层和外胚层细胞,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞等.     

三维培养对脐带间充质干细胞表型及造血因子基因表达的影响

本研究探讨三维立体培养条件下脐带间充质干细胞（UC-MSC）的细胞表型变化及部分造血相关因子的基因表达,为下一步研究三维立体条件下的造血扩增及诱导分化提供基础.从脐带中分离出MSC,分别在二维及三维条件下培养,通过流式细胞术检测MSC表面抗原的表达水平,通过成血管试验比较了两种细胞的成血管能力,并通过实时定量PCR检测两种培养条件下造血相关细胞因子的基因表达情况.结果表明：从脐带中成功地分离出了MSC,在三维培养条件下其内皮细胞、内皮祖细胞和间充质原始干细胞的表面标记CD31、CD133和CD271等阳性细胞百分比显著增加,体外成血管能力增强;骨架蛋白β-actin基因在三维培养条件下表达上调,G-CSF、LIF、SCF、IL-1 α、IL-1β、IL-3、IL-7和IL-11等与造血调控有关的细胞因子基因表达也有不同程度的增高,其中LIF、IL-3和IL-7升高尤为明显;免疫调控相关的细胞因子IL-10的表达也增高,而SDF-1和IL-6的表达虽有轻微的降低,但无显著性差异.结论：三维培养条件下UC-MSC的CD31、CD133和CD271表达上调,体外成血管能力增强,并且多个造血相关因子的基因表达水平上调.     

人骨髓间充质干细胞中Toll样受体的表达特征

本研究探讨健康供体骨髓源性间充质干细胞（BM—MSC）中Toll样受体（TLR）的表达特征,,用Ficoll法分离培养健康供体的BM—MSC;流式细胞术（FCM）检测BM—MSC中CD34、CD45、HLA—DR、CD44和CD71的表达;免疫细胞化学法检测爬片BM—MSC细胞中CD71的表达;应用茜素红染色和油红染色检测BM—MSC细胞成骨及成脂诱导情况;半定量RT—PCR法检测TLR1—10mRNA的表达。结果表明,体外分离培养的BM—MSC中CD34、CD45和HLA—DR表达呈阴性．CD44和CD71表达呈阳性;爬片BM-MSC细胞中CD71的表达呈阳性。BM—MSC经成骨和成脂诱导后出现钙沉积和脂滴,茜素红染色和油红染色均呈阳性。BM—MSC中TLR1—10mRNA均有表达,其中TLR2、TLR3、TLR4、TI,R7、TLR8、TLR9均高表达,TLR1、TLR5、TLR6、TLR10均低表达。结论：从健康供体骨髓中分离培养的BM—MSC表达不同水平的TLR1-10111RNA。     

CD34^＋细胞来源的树突状细胞对骨髓间充质干细胞的生物学特性影响

本研究探讨间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）在抑制树突状细胞（dendritic cell,DC）发育过程中生物学特性的变化。将CD34^＋造血干细胞来源的树突状细胞与MSC共培养,用流式细胞术检测共培养后（DC／MSC）的表型变化;RT—PCR检测造血和免疫相关分子的表达;用诱导实验观察其分化潜能的改变。结果表明：DC／MSC不表达CD31、CD34、CD45、CD14、CD86。HLA—ABC、CD29、CD73的表达较对照组明显降低,即对照组与共培养组阳性率分别为93．1％vs13．44％,98．3％vs78．8％,95．3％vs 75．9％。另外,DC／MSC表达TGF—β,M—CSF等细胞因子均有所增加;进一步将DC／MSC向脂肪细胞诱导分化,诱导后细胞内不能形成脂滴,但其仍保持向成骨分化的特性。结论：DC发育对MSC的基本特性产生一定影响,导致MSC表面间质性标志表达减少,分化能力降低,而造血及免疫相关因子表达则增加。     

小鼠骨髓间充质干细胞对胚胎干细胞造血分化的影响

骨髓间充质干细胞作为骨髓基质细胞的前体细胞 ,在体外具有一定的造血支持作用 ,与造血干细胞共移植可促进其植入。本研究旨在初步探讨应用小鼠骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养作为一种新的分化体系的可行性。首先分离、培养并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞 ,然后利用扩增培养的骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养 ,通过造血集落培养和RT PCR观察造血分化的特点。结果表明 ,分离、扩增培养至第四代之后的骨髓间充质干细胞形态均一 ,高表达Sca 1,CD2 9,CD4 4和CD10 5 ,而CD34和CD4 5等造血与内皮细胞特异性表面标志呈阴性 ;特异性诱导体系内传代后 (>4代 )的骨髓间充质干细胞可向脂肪细胞和成骨细胞分化。与悬浮分化体系相比 ,骨髓间充质干细胞共培养体系中初始分化的胚胎干细胞含有显著增加的拟胚体形成细胞而没有造血集落形成细胞。此外 ,RT PCR检测发现 :共培养细胞表达胚胎干细胞特异性转录因子Oct 4 ,而造血标记Flk 1,GATA 1和 β H1为阴性。结论 :间充质干细胞在一定程度上抑制了胚胎干细胞的初始分化 ,但是共培养体系来源的拟胚体产生造血集落的能力显著高于悬浮体系     

成年大鼠骨髓多能成体祖细胞的克隆化培养及其鉴定

目的优化培养条件，获得体外克隆化培养的成年大鼠骨髓多能成体祖细胞（rMAPC），并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。方法选择低血清条件培养基全骨髓直接贴壁法初步分离大鼠骨髓干细胞，用极限稀释法进行克隆化培养；用流式细胞术及免疫细胞化学法对克隆化培养的rMAPC进行表型分析，并进行体外成脂肪、成骨及成神经细胞诱导，RT—PCR检测Oct4及三个胚层早期标志物，确定其表型及分化潜能。结果单个细胞来源rMAPC在体外扩增至20代仍保持良好的生长状态；流式细胞术及细胞免疫组化检测结果显示CD71、α—SMA及Vimentin表达阳性；CD34、CD44、CD45表达阴性；细胞周期分析显示S＋G，＋M期细胞约占17％，而处于G0／G1．期的细胞占83％；rMAPC体外可被诱导向脂肪细胞、骨细胞及神经细胞分化；RT—PCR检测到Oct4及三个胚层早期标志物的表达。结论体外克隆化培养的rMAPC能维持良好的干细胞生物学特性。     

骨髓内皮细胞条件培养液促进小鼠胚胎干细胞向造血分化

为观察骨髓内皮细胞条件培养液(BECM)和(或)细胞因子(VEGF SCF EPO)对小鼠胚胎干细胞(ESC-D3细胞)生成造血干／祖细胞的促进作用，先将ESC-D3细胞形成4天胚状体(Day 4 embryoid body,4dEB)，再诱导4dEBs生成造血干／祖细胞。实验分4组，第1，2和3组分别为BECM VEGF SCF EPO，BECM和VEGF SCF EPO组，第4组为自发分化对照组。检测各组造血干／祖细胞特异抗原、造血转录因子表达以及造血集落的形成。结果显示，BBCM和(或)细胞因子诱导生成的细胞均表达造血干／祖细胞抗原(c-kit,Sca-1,Thy-1和CD34)和造血转录因子(c—myb，SCL和β-H1)基因mRNA，培养后可产生HPP-CFC和BFU-E。从诱导ESC-D3细胞生成造血干／祖细胞的数量和生成的集落总数看，BBCM联合细胞因子组诱导效率均显高于单用组和对照组。结论：骨髓内皮细胞条件培养液能显促进胚胎干细胞早期造血分化，且骨髓内皮细胞条件培养液与细胞因子联合时效果更强。     

人脐血造血干/祖细胞体外定向诱导分化过程中端粒酶的表达

探讨脐血造血干/祖细胞体外诱导分化过程中端粒酶的表达,为造血干细胞产品的临床应用提供一个监测细胞增殖潜能和安全性的指标。用源自人脐血的CD34~+细胞及不同细胞因子组合(SCF+IL-3+IL-6+G-CSF,SCF+IL-3+IL-6+EPO)在体外进行诱导分化;用TRAP聚丙烯酰胺凝胶电泳法、TRAP-ELISA法检测CD34~+细胞及诱导分化细胞的端粒酶活性;用Western印迹法在蛋白水平检测端粒酶催化亚基hTERT的表达,用RT-PCR在细胞转录水平检测端粒酶催化亚基hTERT mRNA的表达。结果显示,在体外诱导分化14-21天为细胞生长峰值,细胞总数可增加(1006.4±103.2)倍,随着培养时间的延长,细胞数量不再增加。CD34~+细胞低度表达端粒酶活性和hTERT基因,在细胞诱导分化过程中端粒酶活性及hTERT表达逐渐升高,细胞诱导14天后端粒酶活性及hTERT表达下降,28天端粒酶活性及hTERT基因检测不出。结论:利用CD34~+细胞在体外定向诱导分化出的大量细胞,不具有无限增殖的特性,可安全地应用于临床,且利用端粒酶的检测可为临床应用诱导分化细胞的时机提供依据。     

Lymphoid and myeloid differentiation of fetal liver CD34+lineage- cells in human thymic organ culture

In this article, we report that the human fetal thymus contains CD34bright cells (< 0.01% of total thymocytes) with a phenotype that resembles that of multipotent hematopoietic progenitors in the fetal bone marrow. CD34bright thymocytes were CD33-/dull and were negative for CD38, CD2, and CD5 as well as for the lineage markers CD3, CD4, and CD8 (T cells), CD19 and CD20 (B cells), CD56 (NK cells), glycophorin (erythrocytes), and CD14 (monocytes). In addition, total CD34+ lineage negative (lin-) thymocytes contained a low number of primitive myeloid progenitor cells, thus suggesting that the different hematopoietic lineages present in the thymus may be derived from primitive hematopoietic progenitor cells seeding the thymus. To investigate whether the thymus is permissive for the development of non-T cells, human fetal organ culture (FTOC) assays were performed by microinjecting sorted CD34+lin- fetal liver cells into fragments of HLA- mismatched fetal thymus. Sequential phenotypic analysis of the FTOC- derived progeny of CD34+lin- cells indicated that the differentiation into T cells was preceded by a wave of myeloid differentiation into CD14+CD11b+CD4dull cells. Donor-derived B cells (CD19+CD20+) were also generated, which produced immunoglobulins (IgG and IgM) when cultured under appropriate conditions, as well as functional CD56+CD3- NK cells, which efficiently killed K562 target cells in cytotoxicity assays. These results demonstrate that the microinjection of fetal liver hematopoietic progenitors into fetal thymic organ fragments results in multilineage differentiation in vitro.     

六亚甲基二乙酰胺诱导HL-60细胞分化及其分子机制的研究

本研究探讨六亚甲基二乙酰胺（HMBA）对髓系白血病HL-60细胞分化的作用及其分子机制。应用MTT比色法观察不同浓度HMBA在不同时间点对细胞增殖的抑制作用，采用Wright—Giemsa染色观察细胞形态学变化，运用流式细胞仪测定细胞分化抗原CD11b的表达，并进行细胞周期分析，半定量RT—PCR分析c-myc、mad1、p21、p27、hTERT、HDAC1基因mRNA的表达。结果表明：HL-60细胞经不同浓度（0．5、1、2mmol/L）HMBA处理后细胞增殖受到较明显的抑制，并随时间延长、剂量增大抑制作用明显增强。HL-60细胞经2mmol／L HMBA处理后，细胞形态学上趋于分化成熟，细胞停滞于G0／G1期；CD11b表达显著增高；c-myc、hTERT mRNA表达显著下调，mad1、p21、p27mRNA表达显著上调，而HDAC1 mRNA表达无明显变化。结论：HMBA能诱导HL-60细胞分化，其分子机制可能是通过调节c-myc／mad1开关引起p21、p27上调，并且下调hTERT mRNA表达，与HDAC1活性抑制无关。     

两种人羊膜细胞的表型鉴定和分化潜能测定(英文)

本研究旨在分离、培养和表型鉴定两种人羊膜细胞并分析其多向分化潜能。羊膜中可分离出来源于外胚层的羊膜上皮细胞和来源于中胚层的羊膜间充质细胞。用流式细胞术和免疫荧光法对其进行表型鉴定,同时用免疫荧光法分析其多向分化潜能。结果表明:两种人羊膜细胞阳性表达HLA-A,B,C和间充质干细胞的标志(CD29,CD73,CD44,CD59,CD90,CD105,CH166),不表达造血干细胞的标志(CD31,CD34,CD45,HLA-DR),弱表达协同刺激分子(CD40,CD40L,CD80,CD86),且这些表型的表达量在第3-7代都维持稳定。免疫荧光法显示羊膜上皮细胞表达角蛋白19,不表达波形蛋白,而羊膜间充质细胞则相反。对其多向分化潜能测定显示,羊膜间充质细胞更好地向心肌细胞分化,而羊膜上皮细胞更好地向神经细胞分化。结论:从羊膜中可分离出羊膜上皮细胞和羊膜间充质细胞,两种细胞的表型相似,多向分化潜能却不同。羊膜上皮细胞具有更好的外胚层分化潜能,而羊膜间充质细胞更好地向中胚层分化。此结论对细胞治疗有很好的指导作用。     

人骨髓和脐带来源间充质干细胞体外支持造血能力的比较研究

本研究分离鉴定人骨髓和脐带来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）,比较两种间充质干细胞体外支持长期造血的能力。用密度梯度离心或酶消化方法分离骨髓和脐带间充质干细胞,通过贴壁培养的方法进一步纯化Msc。检测骨髓和脐带MSC的表型以及成脂、成骨分化潜能。通过LTC—IC（long—term culture—initiating cells）实验,检测骨髓和脐带间充质千细胞体外支持长期造血的能力,并在培养的第3、5、7周分析两种MSC组悬浮细胞的表型。结果表明,骨髓和脐带间充质干细胞体外培养时均呈纺锤形、贴壁生长,2种MSC均表达CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166和HLA—ABC,不表达HLA—DR、CD34和CD45。化学染色证实,2种MsC体外能分化为脂肪细胞和成骨细胞。LTC—IC实验第5周脐带间充质干细胞组CFC（colony forming cell）的产率与骨髓间充质干细胞组比较无统计学差异（P〉0．05）;第6、7、9周,脐带MSC组CFC的产率均低于骨髓MSC组（P〈0．05）。第3、5、7周悬浮细胞表型检测结果显示,随着培养时间的延长,2种MSC组CD34和CD117的阳性率均明显下降,而CD33、CD13、CD11b的阳性率逐渐上升。结论：从人骨髓和脐带组织中成功分离并鉴定出间充质干细胞,脐带间充质干细胞能够在体外支持长期造血,但其造血支持能力弱于骨髓间充质干细胞。     

恶性血液病细胞中tankyrase表达与端粒酶活性关系研究

为研究以白血病为主的恶性血液病细胞中端粒酶活性正向调控基因tankyrase的表达与端粒酶活性的关系并初步探讨tankyrase对端粒酶活性调控的机理和意义 ,以实时定量RT PCR技术对髓细胞系白血病细胞株K5 6 2 ,HL 6 0 ,U937,NB4 ,THP 1,HEL ,Dami,T淋巴细胞性白血病细胞株 6T CEM ,Jurkat和B细胞淋巴瘤细胞株Raji中tankyrase的表达进行检测 ,同时检测端粒酶逆转录酶hTERT的表达确定端粒酶活性 ,并以经磁珠分离的正常人CD3 ,CD19 和CD33 细胞和 10份正常人骨髓单个核细胞做对照。结果发现 :tankyrase在恶性血液病细胞株中的表达明显高于正常对照 (U =19,P <0 .0 1) ,其中髓系白血病细胞株中的表达高于正常人CD33 细胞 ,T淋巴细胞性白血病细胞株和B细胞淋巴瘤细胞株中的表达分别高于正常人CD3 和CD19 细胞。髓系恶性血液病细胞株tankyrase的表达 (0 .0 0 32± 0 .0 0 10 )明显低于淋系恶性血液病细胞株的表达 (0 .0 12± 0 .0 0 16 ) (F =2 3,P <0 .0 1)。Tankyrase与hTERT的表达呈正相关 (相关系数为 0 .395 ,P <0 .0 5 )。结论 :tankyrase在恶性血液病细胞株中呈高表达 ,与端粒酶活性呈正相关 ,提示tankyrase可能是恶性血液病中端粒酶活性增高的原因之一。