人食管癌细胞体外光动力效应主要影响因素的实验研究

目的探讨光动力作用（PDT）对体外培养的人食管癌细胞Eca-109的杀伤效应．初步揭示影响Eca-109细胞光动力疗法杀伤效应的主要影响因素。方法以两种光敏剂血卟啉衍生物（HpD）和光敏素（Photofrin）不同浓度于特定光照剂量（15J／cm^2）下和不同浓度的HpD在三种不同光照能量密度（10J／cm2,30J／cm^2,50J／cm^2）下作用于食管癌Eca-109细胞,光源采用DIOMED630PDT系统,24h后通过MTT法检测细胞生存率,并应用荧光分光光度计RT-5000检测不同浓度HpD作用于Eca．109细胞4h后胞内光敏剂荧光值。结果两种光敏剂不同浓度间细胞生存率均有明显差异,三种不同光照能量密度下不同HpD浓度细胞生存率间亦存在明显差异（P〈0．05）。同一浓度不同光照能量密度的细胞生存率间,前4个低浓度生存率间未见明显差异（P〉0．05）,后4个高浓度生存率间则差异有统计学意义（P〈0．05）。根据荧光分光光度计RT-5000测得的胞内荧光值及标准曲线取得胞内光敏剂浓度,并与孵育浓度进行回归分析,得相关系数r=0．997,即胞内光敏剂浓度与孵育浓度呈正相关。结论特定光源下,光照能量密度、光敏剂的种类及其光敏剂的孵育浓度是影响Eca-109 PDT效应的主要因素。     

应用定量分析法与图像观察法对光敏剂细胞内分布的对比研究

目的 探讨定量分析法在光敏剂亚细胞定位研究中的应用特点,并与图像观察法进行比较. 方法 传代培养A549肺癌细胞,分别与光敏剂血卟啉单甲醚孵共同孵育2,12,24 h.选择四种特异性细胞器荧光探针Rhodamine-123、Lucifer yellow、DiOC6(3)和BODIPY分别标记细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体,倒置荧光显微镜和致冷CCD探测HMME和探针荧光图像.观察细胞中光敏剂和荧光探针各自的荧光图像并分析光敏剂在细胞中的分布特点.定量计算探针荧光高强度区域与细胞区域内的HMME荧光均量比IB/IA. 结果 图像观察法显示,孵育2,12,24 h,细胞内HMME几乎不进入细胞核,而主要弥散分布于细胞质及各细胞器.定量结果显示: A549肺癌细胞内,2 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、溶酶体、线粒体、内质网;12 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、溶酶体、内质网、线粒体;24 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、内质网、溶酶体、线粒体;高尔基体组IB/IA随时间上升. 结论 应用定量分析法较图像观察法更可以准确反映出HMME在细胞内分布随着孵育时间变化的特点.     

HMME-PDT对CNE-2细胞增殖的抑制作用

目的探讨血卟啉单甲醚介导的光动力学疗法(HMME-PDT)对鼻咽癌CNE-2细胞的抑制作用。方法以血卟啉单甲醚为光敏剂,532nm激光为激发光源的光动力学疗法作用于鼻咽癌CNE-2细胞。细胞用5、10、20!g/ml浓度的光敏剂孵育2h后,用0.6、1.2、2.4、4.8、9.6J/cm2剂量的激光照射;激光功率密度为10mW/cm2。MTT法检测在HMME和激光两种变量下PDT对细胞活性的抑制作用;光镜观察PDT作用后细胞形态的变化;免疫组化法检测PCNA的表达。结果在HMME剂量为5!g/ml、10!g/ml及20!g/ml时,细胞的抑制率随着激光剂量从0.6J/cm2增加至9.6J/cm2而逐渐增加;并且和HMME及激光剂量密切相关;光镜观察结果表明PDT组与对照组相比细胞密度明显减少,细胞核浓聚、碎裂。免疫组化结果显示PDT作用后PCNA表达减少。结论HMME-PDT对CNE-2细胞的增殖有明显的抑制作用。     

血卟啉衍生物光动力对两株人结肠癌细胞杀伤实验的对比研究

目的 探讨血卟啉衍生物(HpD)光动力学效应(PDT)对体外培养人结肠癌细胞株LoVo和CoLo205的生物作用.方法 在体外培养的LoVo和CoLo205细胞中分别加入不同浓度的HpD(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μg/ml)孵育6 h,予波长为630 nm的半导体激光进行照射,照射的功率密度为20mW/cm2,照射能量密度分别为2、5、10、20J/cm2,继续孵育24 h,用四唑盐(MTT)比色法测定细胞存活率.荧光分光光度计检测LoVo与CoLo205细胞内HpD荧光强度.结果 HpD-PDT对体外培养的人结肠癌LoVo和CoLo205细胞均有杀伤作用,两者无显著性差异(P＞0.05).其杀伤作用大小与HpD的浓度和激光剂量成正相关(P＜0.01).激光能量为20 J/cm2,HpD的浓度为2.5μg/ml时,其杀伤LoVo、CoLo205细胞的作用最明显;HpD-PDT对LoVo和CoLo205的半数杀伤度(IC50)分别为0.4 μg/ml、0.6 μg/ml,两者无显著性差异(P＞0.05).检测LoVo与CoLo205细胞内HpD荧光强度无显著性差异(P＞0.05).结论 HpD-PDT可有效杀伤体外培养的人结肠癌LoVo和CoLo205细胞,且对两种细胞的杀伤作用无明显差异.     

白藜芦醇体外抑制类风湿关节炎滑膜细胞的增殖及其机制

目的：检测白藜芦醇（Res）体外对类风湿关节炎（RA）滑膜细胞增殖的影响，并探讨其可能机制。方法：用不同浓度Res处理RA滑膜细胞24h后，采用四唑蓝（MTT）法检测滑膜细胞的增殖水平；用缺口末端标记法（TUNEL）和流式细胞仪检测其凋亡百分率；采用Western-blot分析caspase-3酶原的裂解；用比色法测定Res（200μmol／L）处理RA滑膜细胞不同时间及不同浓度的Res处理RA滑膜细胞12h后，caspase-3的相对活性。结果：加入不同浓度Res处理RA滑膜细胞24h后，增殖水平均显著低于对照组（P〈0．01）；对照组与不同浓度Res处理组凋亡细胞百分率比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；用200μmol／LRes分别处理RA滑膜细胞不同时间，caspase-3活性与未处理组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；用不同浓度的Res处理细胞12h，caspase-3活性成浓度依赖性升高：用不同浓度Res处理培养的RA滑膜细胞24h，caspase-3酶原的表达随药物浓度的增加而减少。结论：Res在体外抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖，诱导细胞凋亡，可能与caspase-3的活化有关。     

血卟啉衍生物光动力对两株人鼻咽癌细胞杀伤实验的对比研究

目的 探讨血卟啉衍生物(HpD)光动力学效应(PDT)对体外培养人鼻咽癌细胞株CNE2和C666-1的生物作用.方法 向体外培养的CNE2和C666-1分别加入不同浓度的HpD(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0μg/m)孵育4 h,予波长为630nm的半导体激光进行照射,照射的功率密度为20mW/cm2,照射能量密度分别为2、5、10、20 J/cm2,继续孵育24h,用四唑盐比色法测定细胞存活率.结果 HpD-PDT能有效地杀伤体外培养的人鼻咽癌CNE2和C666-1细胞,其杀伤作用大小与HpD的浓度和激光剂量成正相关(P＜0.01).激光能量为20 J/cm2,HpD的浓度为2.5μg/ml或2.0μg/ml时,其杀伤CNE2、C666-1细胞的作用最明显;HpD-PDT对CNE2和C666-1的半数杀伤度分别为0.7μg/ml、1.2μg/ml,两者存在显著性差异(P＜0.05).相同HpD浓度、激光剂量条件下,C666-1细胞存活率显著高于CNE2(P＜0.05).结论 HpD-PDT对CNE2和C666-1细胞均有杀伤作用,但C666-1细胞对HpD-PDT的敏感性低于CNE2.     

吡咯里西啶生物碱Jacoline对人正常肝L-02细胞内谷胱甘肽含量及还原酶活性的影响

目的：探讨吡咯里西啶生物碱Jacoline对人正常肝L-02细胞内谷胱甘肽含量及谷胱甘肽还原酶（Glutathione Reductase，GR）活性的影响。方法：①采用DTNB法检测100μmol／L Jacoline与L-02细胞孵育24、48、72h后以及不同浓度Jacoline与L-02细胞孵育72h后对L-02细胞内谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量及其GSH／GSSG的影响。②采用NADPH法检测100μmol，L Jacoline作用24、48、72h后对L-02细胞内GR活性的影响。结果：①DTNB比色法显示，100μmol，L Jacoline与L-02细胞孵育不同时间，谷胱甘肽和GSH含量随着时间的增加而减少，GSH／GSSG的比例也随时间的延长而减少；不同浓度的Jacoline与L-02细胞作用72h后，谷胱甘肽和GSH含量以及GSH／GSSG随浓度的增加而减少；②100μmol／L Jacoline与L-02孵育不同时间，GR的活性随着时间的增加而升高。结论：Jacoline对L-02细胞内谷胱甘肽和GSH含量、GSH／GSSG以及GR还原酶的活性有明显影响。     

酞菁锌介导的光动力学疗法对骨髓净化的实验研究

目的 研究酞菁锌光敏剂(ZnPcS2P2)介导的光动力学疗法(PDT)对模拟慢性粒细胞白血病缓解骨髓的净化作用。方法 采用荧光分光光度法检测K562细胞及正常细胞内的光敏剂含量。锥虫蓝拒染法、MTT比色法、克隆形成实验检测不同浓度ZnPcS2P2介导的PDT对K562细胞增殖能力的影响。正常混合集落形成细胞(CFU-Mix)、粒一单核系造血祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFu-E)等集落形成实验检测ZnPcS2P2 PDT对正常造血祖细胞的影响。巢式PCR方法检测酞菁锌介导的：PDT作用前后混有不同比例K562细胞的骨髓细胞的bcr-abl mRNA表达。结果 (1)与ZnPcS2P2共孵育5h,K562细胞与骨髓正常单个核细胞(MNC)内的ZnPcS2P2含量分别为10．1、2．2(ng／5x10^5细胞),二者比值达到最高值。(2)0．25μg／ml ZnPcS2P2孵育5h后,用670nm激光以53mW／cm^2的功率密度、2．1J／cm^2的能量密度照射对K562细胞集落形成的抑制率为91．1％,而对正常CFU-Mix、CFU-GM、CFU-E等集落形成的抑制率分别为18．0％、18．6％、17．8％。(3)0．25μg／ml ZnPcS2P2介导的PDT可完全杀灭按1：100至1：1000比例混入骨髓正常MNC中的K562细胞。结论 ZnPcS2P2介导的PDT能选择性杀伤K562细胞,有希望成为新的高效而简便的慢性粒细胞白血病骨髓净化手段。     

中药HB对喉癌Hep-2细胞的抑制作用及其机制研究

目的：研究蜈蚣提取物HB对喉癌Hep-2细胞生长的抑制作用及其作用机制。方法：MTT法观察不同浓度的HB对Hep-2细胞的生长抑制情况,采用激光扫描共聚焦技术分析HB作用Hep-2细胞48h后细胞内钙,DNA含量的变化情况。结果：Hep-2细胞用10μg/ml,100μg/ml的HB处理72h后,细胞存在活率显著降低;用10μg/ml,和20μg/ml的HB处理Hep-2细胞48h后,细胞内钙含量显著升高（P＜0．001）,DNA含量显著降低（P＜0．001）,结论：中药HB在体外对Hep-2细胞的生长有明显的抑制作用,机制与降低细胞内DNA含量,细胞内钙超载有关。     

流式细胞技术检测细胞内雌激素受体方法的探讨

目的 建立一种灵敏度高、特异性强的细胞内雌激素受体检测方法。方法 通过加入不同的试剂浓度及改变细胞渗透剂等，观察细胞内雌激素受体的表达。结果 随加入抗休浓度的增加，细胞内雌激素受体表达增加，用0．5％，Saponin溶液穿透细胞膜较用0．1％Tritonx-100，雌激素受体水平明显为高（P＜0．01）。结论 在用流式细胞技术检测细胞内雌激素受体时，加入抗体的最佳浓度为45μg/ml；细胞渗透剂以用0．5％Saponin溶液为宜。     

Hematoporphyrin 3-or 8-monomethyl ether:a promising candidate for tumor photodynamic therapy

Presented are methods for preparation,photosensitizing potential,photoinactivationof human cancer cells in vitro,efficacy of photodynamic therapy(PDT)of transplanted animaltumor and related data of preclinical and toxicological tests of a new single porphyrin compoundhematoporphyrin monomethyl ether(HMME).The results of experiments indicated that in com-parison with the mixed porphyrin preparation(HpD)now used in clinical practice,HMMEproved to be of higher photosensitizing potential,stronger photodynamic effects,lower toxicitynonmutagenicity and nonteratogenicity,furthermore it can be selectively uptaken into tumor tis-sue in mice.It may be considered a new ideal drug candidate for tumor photodynamic therapy.     

青蒿琥酯对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的影响

目的：观察青蒿琥酯对类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）的动物模型-胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）大鼠滑膜细胞的影响,探讨其对RA的作用机制。方法：雄性Wistar大鼠皮内注射Ⅱ型胶原,建立CIA大鼠模型,然后取其滑膜组织用胶原酶消化法进行原代培养。取3~5代的传代细胞,进行后续实验。流式细胞仪检测青蒿琥酯和甲氨喋呤对滑膜细胞凋亡率的影响,电镜观察青蒿琥酯作用下滑膜细胞的形态。结果：青蒿琥酯高、中浓度可导致滑膜细胞的凋亡率增加（P〈0.05）,电镜下可以观察到青蒿琥酯引起滑膜细胞凋亡。结论：青蒿琥酯对实验性RA的作用与诱导滑膜细胞凋亡有关。     

雷公藤单体T4对IL—1刺激引起的类风湿患者关节滑膜成纤 …

目的 探讨雷公藤单体Ｔ４对经ＩＬ－１刺激的体外培养的类风湿关节炎（ＲＡ）患者的关节滑膜成纤维细胞增殖和产生ＩＬ－６的影响。方法 关节滑膜组织来自行关节置换术或滑膜切除术的类风湿患者。滑膜组织经体外消化使细胞分散后,传代培养,以培养３代后的滑膜成纤维细胞为对象,先给予ＩＬ－１刺激,再加入雷公藤Ｔ４单体。结果 Ｔ４可抑制由Ｉ－１刺激的滑膜成纤维增殖,但不影响ＩＬ－６的产生。结论 Ｔ４的上述作用可能是其     

HpD-激光治疗口腔颌面部恶性肿瘤

本文报告血卟啉的光动力疗法治疗口腔颌面部恶性肿瘤的效果。经随诊1～13个月,其中特效14例,显效2例。所有病人均按4～5mg/kg进行HpD静脉滴注,注射后48～72小时用红色的染料激光(波长630nm)在肿瘤部进行照射,产生了光动力效应。肿瘤光照的激光功率剂量时间以200～250mw/cm~2,每照射1个光点为20分钟,按肿瘤病变的大小分点照射,在16例中15例是一次治疗,二次治疗的1例,有一例在治疗后5个月复发为纤维肉瘤。在并发症中仅有一例是太阳光照射后面部水肿,很快得到治愈。该项治疗对口腔颌面部,还可避免毁容及致残,尤其在早期治疗可以得到较好的疗效。     

NPS R-467对甲状旁腺细胞分泌甲状旁腺激素的作用

目的 观察钙受体（CaR)激动剂NPS R－467对严重继发性甲状旁腺功能亢进（SHPT）患者甲状旁腺细胞分泌甲状旁腺激素（PTH）功能的影响。方法 对严重SHPT患者手术切除的甲状旁腺组织进行细胞培养。在培养90min时加入NPS R－467及其异构体NPS S－467,后者作为阴性对照。药物的终浓度分别为25、50和100nmol/L,用放免法检测加药15、30、60min后培养上清液中PTH的分泌量。结果 加药15min后,NPS R－467组和阴性对照组PTH的分泌值非常接近,约为1．8ng/10^5细胞。随后NPS S－467组PTH的测定值呈上升趋势,加药60min后达2．3ng/10^5细胞,而PS R－467组在加药30min后降为对照组的80％,加药60min后降为对照组的60％,不同剂量组间NPS R－467的效应无明显差异。结论 CaR激动剂NPS R－467能明显抑制重症SHPT患者甲状旁腺细胞PTH的分泌,可能将成为治疗甲状旁腺功能亢进的有效药物。     

血卟啉衍生物-激光杀伤恶性肿瘤的动物实验

近几年,应用光敏技术诊治恶性肿瘤,引起国内外的广泛重视。光敏技术是利用光敏剂,经光照射产生光动力效应杀伤细胞(亦称光敏效应)。血卟啉衍生物Hematopor-Phyrin—Derivative,HpD)是目前常用的光敏剂。光源采用复合光—白光或激光。此组合又称为血卟啉衍生物光动力治疗(简称HpD-PdT)。在载瘤(S_(180))小鼠尾静脉注入长春制血卟啉衍生物(16mg/kg)后隔72小时,用630um波长长春制染料激光器(382J/cm~2)照射,验证在此条件下杀伤动物恶性肿瘤的效应,结果显著。     

心肌球培养基血清浓度优化研究

目的 通过比较含有不同胎牛血清浓度的心肌球培养基分离培养大鼠心肌干细胞(CSCs)的效果,探讨最优的心肌干细胞血清培养浓度.方法 选取15只健康新生Wistar大鼠(出生1天龄),无菌条件下取出心脏,经胰酶和Ⅱ型胶原酶反复消化后,种植于培养瓶中,应用含20%胎牛血清的完全培养基培养组织块源性心脏祖细胞(CPCs),将所得的培养外植物源性细胞(EDCs)随机分为A、B、C 3组,各组5瓶细胞(25 mL塑料培养瓶),分别应用含10%、11%、15%不同浓度胎牛血清的心肌球生长培养基培养,培养至第三代CSCs时行细胞表面抗原C-kit染色,鉴定C-kit阳性CSCs占所获得细胞的比率,比较所得的细胞数量,生长周期和生长曲线.结果 从新生大鼠心肌组织中成功分离培养出CSCs,C-kit阳性率87%.培养后所得细胞数量以细胞倍增水平(PDL)表示,各组细胞PDL呈匀速递增,PDL水平和其递增速率(生长曲线所示)比较:B组>C组>A组.应用含11%胎牛血清的心肌球生长培养基培养EDCs获得的CSCs,与其他两组相比,具有生长周期短(P<0.05),生长数量多的特点(P<0.05).结论 含11%胎牛血清浓度是心肌球生长培养基培养原代大鼠心肌干细胞的最优血清培养浓度.