布鲁氏菌bp26和OMP10基因的原核表达和鉴定

目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP10和bp26基因的表达、克隆与测序,并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁氏菌基因组中获得OMP10和bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序,克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,构建重组质粒PGEX-4T-1/OMP10和PGEX-4T-1/bp26,在大肠杆菌中将该蛋白表达。用western-blot分析重组表达的GST-OMP10和GST-bp26的免疫学特性。结果成功构建了PGEX-4T-1/OMP10和PGEX-4T-1/bp26原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了OMP10和bp26基因,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。结论布鲁氏菌外膜蛋白OMP10和bp26基因的成功表达,它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。     

布鲁氏菌外膜蛋白的研究进展

近十余年来,国外对布鲁氏菌(以下简称布氏菌)外膜蛋白成分(OMPM)的研究已逐步深入,目前已进入了应用方面的研究。现仅就这方面的研究进展予以综述。提取方法一、从物理破碎的菌细胞中提取将细菌在室温下解冻,加入1mg/100mlDNA 酶和 RNA 酶,再将细菌通过高压挤压     

布鲁氏菌17.3kDa蛋白的表达及其免疫学评价(英文)

目的获得布鲁氏菌保护性抗原17.3kDa重组蛋白并以此构建亚单位疫苗。方法用PET32a(+)原核表达载体表达17.3kDa蛋白纯化后加氟氏佐剂肌肉注射免疫小鼠,三免后测定免疫功能进行免疫效果的评价。结果ELISA、WesternBlot检测到免疫鼠体内有特异性抗体产生,蛋白苗所诱导产生的IgG1抗体远远高于IgG2a;通过细胞因子和CD分子测定表明重组蛋白以诱发ThⅡ型免疫为主。结论所表达的布鲁氏菌17.3kDa蛋白苗具有诱导特异性细胞和体液免疫应答的能力,可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗或诊断抗原,有进一步研究的意义。     

华支睾吸虫3个半胱氨酸蛋白酶N端短片段原核表达及其抗原性分析

目的 通过克隆和表达获得华支睾吸虫3个半胱氨酸蛋白酶N端短片段重组蛋白并分析其抗原性。方法 以pET-28a-CsCP1-3重组质粒为模板进行目的片段CsCP1a-3a PCR扩增,构建pET28a-CsCP1a-3a表达载体,并转化至BL21(DE3)大肠埃希菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE分析;表达产物经变性、纯化及复性,与华支睾吸虫感染大鼠血清行Western blot分析。结果 成功构建pET28a-CsCP1a-3a重组质粒;SDS-PAGE分析显示,重组蛋白CsCP1a-3a以包涵体形式表达;重组蛋白CsCP1a-3a可被华支睾吸虫感染后第4、5周大鼠血清识别。结论 重组蛋白CsCP1a-3a具有较好抗原性,可作为华支睾吸虫感染诊断候选分子。     

日本血吸虫24-26kDa抗原和重组Sj26抗原的抗原性和免疫原性比较研究

本文报告从日本血吸虫大陆株成虫抽提的24—26kDa抗原与源于日本血吸虫菲律宾株的重组Sj26抗原之间在抗原性和免疫原性上所进行的一系列比较研究。ELISA、IFA和Westernblotting等方法观察结果均表明,24—26kDa和rSj26抗原免疫后所诱导的特异性抗体与其对应的抗原之间具有明显的抗原交叉反应,而与其它血吸虫抗原如可溶性虫卵抗原也有交叉反应。若以两种抗原加福氏佐剂分别免疫小鼠,以日本血吸虫大陆株尾蚴攻击感染,减虫率相似(26～32％),表明两种抗原存在一定程度的交叉免疫保护性。这些研究结果为开发rSj26抗原,或是根据已知Sj26 cDNA核苷酸序列制备DNA探针,从已构建的日本血吸虫(大陆株)cDNA库筛选相关目的基因,加速血吸虫疫苗的研制起着重要作用。     

猪囊尾蚴表面蛋白及其抗原性的初步测定分析

本文初步分析了猪囊尾蚴囊壁表面蛋白的特性。根据囊尾蚴漂洗液PAGE和SDS-PAGE考马斯亮蓝染色带分别显示了9条及14条蛋白区带,其中大部分与宿主骨骼肌组织的可溶性蛋白有一致的迁移率,但其中第5、7、10条蛋白带为其独有。漂洗液与囊液兔高免血清IE可出现1条沉淀弧;用漂洗液蛋白抗原对35例囊虫病人血清做ELISA,阳性率为60％。此外,对囊虫表面宿主蛋白的可能作用,做了初步探讨。     

疟疾疫苗候选蛋白及其抗原性研究概况

疟原虫结构复杂、蛋白种类众多,但每种蛋白质的特性决定了其被开发、利用的局限性。本文围绕疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)、疟原虫多药抗性蛋白1(PfMRP1)、疟原虫组氨酸富集蛋白1(HPR-Ⅰ)等的结构、功能和各自作为疫苗候选抗原、免疫诊断抗原或药物作用靶抗原的应用现状进行了简要概述。     

布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析法快速检测技术的建立

目的建立一种快速检测布鲁氏菌抗体的新方法。方法利用胶体金免疫层析技术,以大肠埃希菌表达、纯化的OMP31与BP26重组蛋白作为检测抗原,以金黄葡萄球菌A蛋白(SPA)作为胶体金标记物,制备胶体金免疫层析试纸条,用于检测布鲁氏菌抗体,并分析方法的敏感性和特异性。结果以粒径为40nm胶体金制备的试纸条检测布鲁氏菌抗体的敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.2,SPA蛋白最适标记量为6μg/ml。交叉试验证明试纸条不与其他非相关疾病感染血清反应,特异性高。试纸条检测结果与琥红平板试验方法的符合率为92%。结论制备的布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,可用于鉴别布鲁氏菌自然感染和人工免疫,并可区分牛、羊种布鲁氏菌感染,可在基层推广使用。     

布鲁氏菌鞭毛钩蛋白FlgE和融合蛋白BLS-FlgE的克隆、表达及免疫诊断研究

目的分别构建含目的基因flgE和bls-flgE的原核表达载体,表达纯化重组蛋白,并对其免疫诊断价值进行初步评价。方法从NCBI得到布鲁氏菌鞭毛钩蛋白基因flgE和2,4二氧四氢蝶啶合酶基因(bls)序列,设计引物,利用PCR技术扩增得到目的基因,与载体pET30a连接,转化E.coli BL21感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定,使用带His标签的蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。纯化后的蛋白建立ELISA法检测布病阳性血清和健康人血清,收集灵敏度和特异度数据。结果成功克隆了FlgE鞭毛钩蛋白和BLS-FlgE融合蛋白,经过优化表达条件,目的蛋白获得较大量的表达,免疫印迹结果显示可被阳性病人血清识别。以FlgE蛋白构建ELISA法检测得到灵敏度和特异度分别为70.83%和41.67%,以BLS-FlgE蛋白构建ELISA法检测得到灵敏度和特异度分别为68.75%和52.08%。结论成功表达布鲁氏菌鞭毛钩蛋白FlgE和融合蛋白BLS-FlgE,分别作为诊断抗原总体符合率低,免疫诊断价值较低。     

羊布鲁杆菌M5-90 BP26抗原单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备高亲和性的羊布鲁杆菌M5-90 BP26抗原单克隆抗体,并对抗体进行鉴定.方法 将质粒pET-28a-BP26转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21 (DE3),构建原核表达质粒pET-28a-BP26,用镍离子金属螯合亲和层析法(Ni-NTA)纯化、重组BP26蛋白(rBP26).将纯化后的rBP26蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合成乳化抗原,接每只100 μg/0.1 ml在BALB/c小鼠皮下多点注射进行初次免疫;2周后,按每只50μg/0.1ml 在小鼠皮下多点注射进行再次免疫.再次免疫后2周,小鼠尾静脉取血测效价,检测免疫效果;在细胞融合前3天,将乳化抗原按每只小鼠50μg腹腔注射加强免疫.将小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞按1∶5比例在聚乙二醇( PEG) 1450作用下进行细胞融合,置于37℃、5％CO2培养箱中培养;10 d后取细胞培养上清液,用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测定,筛选分泌抗rBP26抗体的杂交瘤细胞;再经过反复3次克隆,筛选出单克隆全阳性的杂交瘤细胞建株,用杂交瘤细胞株制备BP26抗原单克隆抗体,并以初始杂交瘤细胞克隆导命名.利用羊布鲁杆菌M5 -90疫苗株制备膜蛋白提取物(NMP),采用免疫印迹法(Western)及斑点间接酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)对筛选的单克隆抗体进行免疫学特性鉴定,用单克隆抗体亚型试剂盒进行抗体分型和Kappa (κ)和Lambda(λ)轻链鉴定.结果 成功地获得2株能稳定分泌抗rBP26抗原的高亲和性杂交瘤3C3和5A5单克隆抗体,并能与羊布鲁杆菌M5-90疫苗株上的NMP结合,构建成M5-90 BP26抗原单克隆抗体,抗体亚型分别为IgG1和IgG2b,轻链均为κ链.结论 鉴定结果表明,成功制备2株羊布鲁杆菌BP26抗原的高亲和性单克隆抗体,抗体具有识别M5-90疫苗株的膜蛋白构象表位的能力,优势表位的识别可为羊布鲁杆菌M5-90疫苗株的改造提供实验依据.     

布鲁杆菌外膜蛋白OMP31和bp26基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆并测序中国布鲁杆菌外膜蛋白基因OMP31和bp26,重组表达OMP31和bp26蛋白, 并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁杆菌基因组中获得OMP31和bp26基因,连接入PMD18-T克隆质粒并测序。测序后分别克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,在大肠埃希菌中表达融合蛋白。用Western-blot技术分析重组表达的GST-OMP31和GST-bp26的免疫学特性。结果 OMP31和bp26基因的测序结果与 GeneBank中已报道的布鲁杆菌株完全一致,并在大肠埃希菌中成功表达了GST-OMP31和GST-bp26融合蛋白。布鲁杆菌免疫兔血清能特异性识别所表达的蛋白而不与载体蛋白发生反应。结论成功表达了布鲁杆菌外膜蛋白OMP31和bp26,它可以被布鲁杆菌免疫血清特异性识别,表现出良好的抗原性,为之后的实验室诊断和亚单位疫苗的研究打下良好的物质基础。     

rSj26GST-Sj32融合蛋白-IgG4-ELISA诊断慢性血吸虫病的研究

目的探讨rSj26GST Sj32 IgG4 ELISA诊断慢性血吸虫病的价值。方法用rSj26GST Sj32融合蛋白作为包被抗原,通过rSj26GST Sj32 IgG4 ELISA检测慢性日本血吸虫病患者血清抗体,同时以华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、泡型棘球蚴病、囊型棘球蚴病、乙型肝炎、肺结核患者血清和健康人血清作为对照。结果该法检测慢性血吸虫病的敏感性和特异性分别为95.00%和100.00%,且与泡型棘球蚴病、囊型棘球蚴病、乙型肝炎和肺结核患者血清均无交叉反应;诊断慢性血吸虫病的阳性预告值、阴性预告值及诊断效率分别为100.00%、95.56%和97.59%。结论rSj26GST Sj32 IgG4 ELISA可用于慢性血吸虫病的免疫诊断。     

结核分枝杆菌 PPE17蛋白原核表达与抗原性分析

目的 利用原核系统生产重组结核分枝杆菌 PPE17蛋白,Western-Blot方法鉴定PPE17蛋白的抗原性和特异性.方法 PCR 扩增 Rv1168c 基因序列然后克隆至原核表达载体pET-24b中,对PPE17蛋白进行表达和纯化,并以Western blot分析其抗原性和特异性.结果 PPE17蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,复性后的 PPE17蛋白与结核病患者阳性血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本无反应.结论 PPE17蛋白在大肠杆菌中以包涵体表达形式存在,具有抗原特异性和免疫原性,可开发为结核病临床诊断试剂.     

猴轮状病毒的灭活、纯化及抗原性鉴定

目的探讨经β丙内酯灭活的猴轮状病毒SA11的抗原性。方法将猴轮状病毒适应到vero细胞上,用β丙内酯灭活后,接种MA104细胞,鉴定灭活效果,经超滤浓缩、凝胶过滤后,加入弗氏完全佐剂免疫豚鼠,确定豚鼠产生的中和抗体效价。结果利用β丙内酯在4℃作用24、48、72或96h,可以有效的灭活轮状病毒SA11,通过凝胶过滤可得到初步纯化的轮状病毒,以1.33mg/只的剂量与弗氏完全佐剂混合免疫豚鼠后,中和抗体的滴度为1∶1024。结论用β丙内酯可以有效的灭活轮状病毒。     

不同牛PrP合成肽段的抗原性研究

目的研究PrP多肽的抗原性以及不同偶联方法对多肽免疫原性的影响。方法选择4段牛PrP多肽(BoP1、BoP2、BoP3、BoP4)为半抗原,KLH为载体,MBS、戊二醛两种偶联方法进行偶联,免疫BALB/c小鼠,间接ELISA方法检测小鼠血清中抗体效价,并对两种偶联方法进行比较。结果两组动物均出现死亡,戊二醛偶联多肽免疫小鼠出现不同程度的腹水,MBS偶联多肽免疫小鼠未见其它异常反应;戊二醛偶联的4种多肽产生的抗体效价无显著性差异(P>0.05),MBS偶联的KLH-BoP1、KLH-BoP2、KLH-BoP4产生抗体效价无显著性差异(P>0.05),MBS偶联的KLH-BoP3抗体效价低于其它3种多肽(P<0.05);对同一种多肽而言,不同偶联方法KLH-BoP1、KLH-BoP2、KLH-BoP4所产生抗体效价无显著性差异(P>0.05),戊二醛偶联KLH-BoP3产生的抗体效价明显高于MBS偶联KLH-BoP3产生的抗体效价(P<0.05)。结论PrP多肽可作为半抗原刺激小鼠强烈的免疫反应,不同偶联方法,不同肽段抗原性不同,为抗PrP多克隆及单克隆抗体的制备奠定了基础。     

重组布氏杆菌BP26蛋白和OMP31蛋白作为间接ELISA诊断抗原的研究

目的 传统布氏杆菌病血清学方法因其抗原构成复杂，存在较严重的交叉免疫反应性，导致结果判定困难。BP26及OMP31分别为布氏杆菌细胞周质蛋白及外膜蛋白，在感染牛、绵羊、山羊、犬和人类均为优势免疫原，且在抗原性上具有较好的布氏杆菌种属特异性。方法 以大肠杆菌表达、纯化的BP26和OMP31重组蛋白为包被抗原，初步建立了检测血清特异抗体的间接ELISA方法，并以现地牛布氏杆菌普查检测血清100份为样本，与传统的试管凝集试验进行了比较研究。结果 试管凝集试验血清样本阳性率为15％（15／100）；BP26包被抗原ELISA检测判为阳性的12个样本中有11为试管凝集反应阳性，相对阳性率为73．3％，二者阳性符合率为92％（11／12）；而采用OMP31为包被抗原，阳性检出率为0（图5）。结论 被检测区域阳性牛主要感染布氏杆菌为牛种布氏杆菌（B．abortus天然缺失0MP31基因）；BP26作为间接ELISA包被抗原用于牛布氏杆菌血清学检测具有良好的特异性及较好的敏感性。     

布鲁杆菌BP26重组卡介苗的构建及对小鼠CD4+和CD8+T细胞的影响

目的 构建预防布鲁杆菌病的新型疫苗——布鲁杆菌BP26重组卡介苗(rBCG-BP26),观察rBCG-BP26对免疫小鼠CD4+、CD8+T细胞的影响.方法 利用常规分子生物学技术构建重组穿梭分泌载体pMV261-Ag85B-BP26,电转入卡介苗(BCG)后经过卡那霉素抗性筛选,对获得的基因重组株进行PCR鉴定.采用Western免疫印迹法检测菌体和液体培养基中BP26蛋白表达情况.选用45只BALB/c小鼠进行安全性实验分析,将其分成3组:目标实验(rBCG-BP26)组、阳性对照(BCG)组、阴性对照(PBS)组,每组15只.分别在小鼠皮内接种100μl rBCG-BP26[含106克隆形成单位(CFU)]、BCG、PBS.观察各组小鼠体征,在小鼠免疫后的第10、20、30、40天称量体质量,并于尾部采血,用流式细胞仪分析CD4+、CD8+T细胞含量.结果 成功构建rBCG-BP26重组疫苗株.在菌体和液体培养基中均能检测到BP26蛋白的表达.安全性实验分析表明,3组小鼠在免疫后第10、20、30、40天体质量比较,差异无统计学意义[rBCG-BP26组分别为(19.16±0.55)、(20.89±0.20)、(22.15±0.76)、(24.60±0.64)g; BCG组分别为(19.90±0.02)、(21.53±1.57)、(21.95±0.55)、(24.70±0.39)g;PBS组分别为(19.24±0.54)、(21.37±0.66)、(22.83±0.62)、(25.06±0.37)g;F值分别为2.468、0.331、1.520、0.739,P均＞0.05].在免疫后第10、20天时,rBCG-BP26组小鼠全血CD4+T细胞含量(13.40％、26.70％)低于BCG组(26.70％、33.07％)和PBS组(33.85％、29.33％),rBCG-BP26组CD4+/CD8+T细胞含量比值随时间延长而逐渐增长(0.69％、1.27％、1.57％、1.70％).结论 rBCG-BP26能高效表达布鲁杆菌BP26蛋白,并具有毒力弱、能激活机体CD4+、CD8+T细胞的特点,可作为预防布鲁杆菌病的疫苗候选株之一.     

结核分枝杆菌重组Mtb8.1蛋白自诱导表达与抗原性分析

目的 通过自诱导表达系统重组表达结核分枝杆菌H37Rv菌株可溶性蛋白抗原Mtb8.1, 并对其抗原性进行分析。方法 应用PCR技术扩增结核分枝杆菌H37Rv 菌株Mtb81蛋白抗原编码序列, 将其插入克隆载体pMD18-T, 酶切后插入表达载体PET28a, 通过优化培养基和发酵工艺, 摸索出一条高效的可溶表达方法, 以间接ELISA法研究其免疫学特性。结果与结论 重组的Mtb81高效可溶性表达, 纯化后纯度达95%以上;用纯化的重组蛋白抗原作为包被抗原建立的间接ELISA法检测200份血清样本, 阳性率达34.0%, 阴性率达91.0%, , 符合率达62.5%。