抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)诱导Jurkat细胞凋亡活性研究

目的：观察抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的死亡受体5（DR5）单克隆抗体——mDRA-6对Jut-kat细胞的凋亡作用。方法：DR5蛋白免疫BALB／c小鼠，融合筛选抗DR5杂交瘤细胞，制备抗人DR5单抗——mDRA-6；光镜下观察mDRA-6作用下Jurkat细胞形态变化；MTT方法计算mDRA-6不同浓度、不同作用时间对Jurkat细胞凋亡率影响。结果：mDRA-6致Jurkat细胞染色质边集、断裂，细胞出芽，凋亡小体形成；MTT法显示mDRA-6具有明显的Jurkat细胞杀伤作用，0.1μg／ml的mDRA-6即可使Jurkat细胞存活率降至77．2％；25．6μg／ml的mDRA-6作用8小时，可使Jurkat细胞存活率降至28．4％；Annexin v及PI双染显示1μg／ml的mDRA-6作用10小时，Jurkat细胞凋亡率达81．82％。结论：抗DR5单抗——mDRA-6具有高效诱导Jurkat细胞凋亡的活性。     

抗人DR5抗体mDRA- 6细胞毒作用机制分析

目的:探讨鼠抗人DR5单克隆抗体(mAb)mDRA-6对Jurkat细胞的细胞毒作用及其机制。方法:以流式细胞术测定mAbmDRA-6对Jurkat细胞的细胞毒作用和细胞凋亡作用,以及caspase8、9的抑制剂对mAbmDRA-6诱导的Jurkat细胞凋亡的影响。在荧光显微镜下,观察mAbmDRA-6对Jurkat细胞形态的影响。以琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat细胞中的DNA片段化。结果:mAbmDRA-6对Jurkat细胞具有显著的细胞毒作用,并呈剂量和时间依赖性。经mAbmDRA-6处理后,Jurkat细胞可出现典型的细胞凋亡的形态特征:细胞膜皱缩,出泡,染色质浓缩,形成凋亡小体等。经mAbmDRA-6处理后,Jurkat细胞膜表面高表达丝氨酸磷脂,并可导致Jurkat细胞中的DNA片段化。caspase8的抑制剂可明显抑制mAbmDRA-6诱导的Jurkat细胞凋亡,caspase9的抑制剂的影响很小。结论:mAbmDRA-6可通过死亡受体信号传导途径诱导Jurakt细胞凋亡,对Jurkat细胞产生细胞毒作用,其在以TRAIL/DR5系统进行的肿瘤治疗和探讨DR5功能结构域方面具有广阔的应用前景。     

抗DR5抗体对食管鳞癌的细胞毒作用及机制

目的：探讨抗人DR5功能性单克隆抗体mDRA-6对食管鳞癌EC9706和109细胞的细胞毒作用及其作用机制。方法：利用MTT法检测mAb mDRA-6对食管癌细胞的细胞毒作用;在显微镜下观察食管癌细胞死亡的形态变化;以琼脂糖凝胶电泳检测食管癌细胞中的DNA片段化。利用流式细胞术检测食管癌细胞表面DR5表达、细胞凋亡率和线粒体膜电位;利用caspase抑制剂分析mAb mDRA-6的细胞毒作用机制。结果：mAb mDRA-6对食管鳞癌细胞有显著的细胞毒作用,并呈剂量和时间依赖性,但对食管上皮细胞NEC细胞没有毒性。经mAb mDRA-6处理,食管鳞癌细胞出现典型的细胞凋亡特征：细胞膜皱缩,出泡,染色质浓缩,形成凋亡小体以及DNA片段化等。流式细胞术检测结果显示,食管癌细胞表面表达DR5,而食管上皮细胞NEC细胞不表达;经1.2μg/ml的mAb mDRA-6作用24小时后,大多数食管鳞癌EC9706和109细胞的表面均表达磷脂酰丝氨酸。Caspase 8的抑制剂几乎完全抑制mAb mDRA-6诱导的细胞凋亡,Caspase 9抑制剂的则影响小。此外,在mAb mDRA-6诱导的食管癌细胞凋亡的早期,线粒体膜电位不改变,在凋亡的晚期,线粒体膜电位降低。结论：mAb mDRA-6主要通过死亡受体信号传导途径诱导细胞凋亡,对食管鳞癌细胞产生细胞毒作用,其在以TRAIL/DR5系统进行的肿瘤治疗和探讨DR5功能结构域方面具有广阔的应用前景。     

抗人DR5单克隆抗体诱导Jurkat和U937细胞凋亡的线粒体信号通路

目的:探讨抗人死亡受体5(Death receptor 5,DR5)单克隆抗体mDRA-6诱导Jurkat和U937细胞凋亡的线粒体信号通路。方法:MTT法检测mDRA-6对Jurkat和U937细胞生长增殖的影响,以及caspase-9、3抑制剂对mDRA-6抑制Jur-kat和U937细胞生长增殖的影响;琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat和U937细胞DNA片段化降解;Western blot检测mDRA-6对Jurkat和U937细胞bax、bcl-2、bcl-xl、Cyt c及caspase-9、3的激活改变。结果:mDRA-6呈时间、浓度依赖性地抑制Jurkat和U937细胞的生长增殖,10 mg/L的mDRA-6作用6、8和10小时,Jurkat细胞增殖抑制率分别达59.38%、72.56%和76.28%,U937细胞增殖抑制率分别达38.67%、47.54%和50.59%。琼脂糖凝胶电泳显示,10 mg/L的mDRA-6作用6小时,Jurkat和U937细胞均呈现凋亡细胞特有的DNA梯形条带;Western blot检测结果发现,随着mDRA-6作用时间延长,Jurkat和U937细胞内促凋亡分子bax增多,抗凋亡分子bcl-2及bcl-xl减少,Cyt c释放明显增多,同时caspase-9、caspase-3也显示明显的激活表现。预先使用caspase-9抑制剂孵育细胞1小时,mDRA-6所致Jurkat和U937细胞生长抑制率分别降低了24.36%(t=5.44,P﹤0.01)和20.82%(t=4.29,P﹤0.01),mDRA-6所致Jurkat和U937细胞凋亡率分别降低了32.89%和23.97%。结论:线粒体信号通路激活是抗人死亡受体5(Death receptor 5,DR5)单克隆抗体mDRA-6诱导Jurkat和U937细胞凋亡的途径之一。     

抗DR5单克隆抗体-mDRA-6对白血病细胞的凋亡诱导作用

目的:观察抗死亡受体5(DR5)单克隆抗体(mAb)-mDRA-6对白血病细胞的凋亡作用。方法:DR5蛋白免疫BALB/c小鼠,融合筛选抗DR5杂交瘤细胞,制备抗人DR5mAb-mDRA-6;荧光显微镜下观察mDRA-6作用下白血病细胞Jurkat、HL-60、K562的形态变化;MTT法测定不同浓度的mDRA-6对Jurkat、HL-60、K562细胞存活率的影响;通过FITC-Annexin V及PI标记细胞,以流式细胞术检测mDRA-6对Jurkat、HL-60、K562细胞凋亡率的影响。结果:mDRA-6导致Jurkat、HL-60细胞染色质浓缩、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成;mDRA-6对Jurkat、HL-60细胞具有明显的杀伤作用,但对K562的杀伤作用较弱,25mg/L的mDRA-6作用12h,Jurkat、HL-60、K562细胞死亡率分别为88.76%,59.76%,5.18%。Annexin V及PI双染显示1mg/L的mDRA-6作用10h,Jurkat细胞凋亡率为86.06%,10mg/L的mDRA-6作用10h,HL-60细胞凋亡率为48.11%,但10mg/L的mDRA-6作用K562细胞10h,细胞凋亡不明显。结论:抗DR5mAb mDRA-6能够诱导白血病细胞凋亡,不同的白血病细胞株对mDRA-6的敏感性不同。     

抗人DR5单克隆抗体——mDRA-6与顺铂协同杀伤白血病细胞HL-60作用研究

目的：观察抗死亡受体5（Death receptor 5,DR5）单克隆抗体--mDRA-6与顺铂（DDP）对HL-60细胞的协同杀伤作用.方法：DR5蛋白免疫BALB/c小鼠,融合筛选抗DR5杂交瘤细胞,制备抗DR5单抗--mDRA-6;流式细胞术测定顺铂对HL-60细胞表面DR5表达及细胞凋亡率;荧光显微镜下观察mDRA-6与顺铂协同作用下HL-60细胞形态变化;MTT法测定不同浓度的顺铂与mDRA-6对HL-60细胞存活的影响;琼脂糖凝胶电泳检测mDRA-6与顺铂联合对HL-60细胞DNA片段化的影响.结果：顺铂可诱导HL-60细胞表面DR5表达增加,mDRA-6与顺铂联用致HL-60细胞出现染色质浓缩、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成等细胞凋亡形态学变化;250 ng/ml的mDRA-6作用于HL-60细胞10小时,细胞凋亡率为16.61%;0.16 μg/ml的DDP作用于HL-60细胞10小时,细胞凋亡率为2.35%;二者联合作用后,HL-60细胞凋亡率增至57.10%;mDRA-6与DDP联合作用HL-60细胞,DNA琼脂糖凝胶电泳显示明显“梯形”条带.结论：抗DR5单抗--mDRA-6与DDP对HL-60细胞具有强大的协同杀伤作用.     

抗人DR5单克隆抗体mDRA-6对HL-60细胞的诱导凋亡作用

目的 观察抗死亡受体5(DR5)单克隆抗体nDRA-6对HL-60细胞的凋亡作用.方法 制备抗人DR5单克隆抗体mDRA-6;荧光显微镜下观察mDRA-6作用后HL-60细胞的形态变化;MTT法测定不同浓度mDRA-6在不同作用时间对HL-60细胞存活的影响;通过FITC-Annexin V及PI标记细胞,以流式细胞仪检测mDRA-6对HL-60细胞凋亡率的影响;琼脂糖凝胶电泳检测mDRA-6对HL-60细胞DNA片段化的影响.结果 mDRA-6导致HL-60细胞染色质浓缩、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成;mDRA-6对HL-60细胞具有明显的杀伤作用,24ng/mL mDRA-6作用HL-60细胞10 h,细胞死亡率达21.2%;1μg/mL的mDRA-6作用8 h,可使HL-60细胞死亡44.1%;Annexin V及PI双染显示,10μg/mL mDRA-6作用2 h,HL-60细胞的凋亡率达48.1%;20μg/mLmDRA-6作用HL-60细胞3 h,DNA琼脂糖凝胶电泳显示明显的"梯形"条带.结论 抗DR5单克隆抗体mDRA-6具有诱导HL-60细胞凋亡作用.     

抗人DR5单克隆抗体对白血病U937细胞凋亡的作用

目的：研究鼠抗人DR5单克隆抗体（mDRA-6）对白血病细胞U937的凋亡诱导作用。方法：光镜下观察mDRA。6作用后U937细胞的形态变化；流式细胞术检测15937细胞表面DR5表达率；MTT法检测mDRA-6对U937细胞生长的影响；AnnexinV—FITC／PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率；琼脂糖凝胶电泳检测U937细胞DNA的片段化降解；JC-1单染流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位改变。结果：mDRA-6作用U937细胞后呈现典型的细胞凋亡特征；MTT法检测显示mDRA-6作用U937细胞24小时死亡率为61．09％，并呈时间、浓度依赖性；流式细胞仪检测显示10mg/L的mDRA-6作用4小时，U937细胞凋亡率为79．12％；琼脂糖凝胶电泳显示DNA呈现明显梯状带型；mDRA-6作用U937细胞后线粒体膜电位明显下降。结论：mDRA-6能够诱导白血病U937细胞凋亡，是具有诱导细胞凋亡活性的功能性抗体。     

抗死亡受体-5单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:研制抗DR5单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法:以纯化的DR5免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DR5mAb。用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗DR5mAb的亚类。用ELISA法测定sDR5对抗DR5mAb与DR5结合的阻断作用及流式细胞术检测与Jurkat细胞膜上DR5结合的阻断作用,以鉴定mAb的特异性。用间接ELISA法检测腹水mAb的效价、亲和常数并进行表位分析。结果:获得4株可分泌抗DR5mAb的的杂交瘤细胞系YM366EC、YM366ED、YM369F5和YM369E6。4株mAb的Ig亚类均为IgG1;腹水mAb效价为1×10-4~5×10-6;亲和常数为1×109水平,4株mAb可识别2种不同的抗原表位。结论:获得4株抗DR5的mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。     

抗人甲胎蛋白单克隆抗体的研制及其应用

本文报告将自制的人甲胎蛋白(AFP)抗原免疫小鼠,采用常规杂交瘤技木融合小鼠的脾细胞和SP2/0细胞。经有限稀释法克隆出九株分泌抗人AFP单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。分别用血凝抑制试验、琼脂双扩散、ELISA和放射免疫分析等方法鉴定了McAb对抗原的表位特异性、亲和力及其稳定性和小鼠Ig亚类属性。实验结果表明几种McAb分别作用于AFP抗原上相同或不同的抗原表位。其中大多数McAb具有较高的亲和力。抗原表位特异性不同的McAb在免疫沉淀反应中有协同作用。本文报告的AFP McAb双位点夹心ELISA,对一些临床标本的检测结果与AFP放射免疫试剂盒的结果有着良好的相关性。     

兔抗人DR5抗血清诱导Jurkat细胞凋亡

制备兔抗人sDR5抗血清,检测它对Jurkat细胞的生长抑制和凋亡诱导作用。采用本室制备的sDR5免疫新西兰白兔,制备兔抗人sDR5抗血清,用ELISA法测定抗sDR5抗血清效价及抗血清的特异性。MTT试验分析它对Jurkat细胞生长抑制影响,倒置光显微镜和荧光显微镜观察抗sDR5抗血清对Jurkat细胞形态的影响,用AnnexinV/PI双染试剂盒检测Jurkat细胞凋亡率,琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat细胞中DNA的片断化。结果:获得了高效价特异性兔抗人sDR5抗血清。兔抗人sDR5抗血清对Jurkat细胞具有显著的细胞生长抑制作用,并呈剂量依赖性。兔抗人sDR5抗血清处理后,Jurkat细胞可出现典型的细胞凋亡的形态特征:细胞膜皱缩,出泡,染色质浓缩,形成凋亡小体等。流式细胞术结果显示:兔抗人sDR5血清1/80、1/160作用Jurkat细胞2 h,细胞凋亡率分别为54.98%和34.13%。兔抗人sDR5抗血清可导致Jurkat细胞中的DNA片段化。本室制备的兔抗人sDR5抗血清能抑制Jurkat细胞生长和诱导Jurkat细胞凋亡。     

抗人DR5单克隆抗体诱导HL-60细胞凋亡机制

探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)诱导白血病细胞系HL-60细胞凋亡的可能机制。MTT法检测mDRA-6对HL-60细胞的生长增殖的影响,以及Caspase 8、10、3抑制剂对mDRA-6抑制HL-60细胞生长增殖的影响;琼脂糖凝胶电泳检测HL-60细胞DNA片断化降解;Western blot检测mDRA-6对HL-60细胞Caspase 8、10、3的激活改变。结果发现,mDRA-6呈时间、浓度依赖性地抑制HL-60细胞的生长增殖,10 mg/L的mDRA-6作用HL-60细胞6 h、8 h和10h,细胞增殖抑制率分别为23.96%、44.10%和50.28%;琼脂糖凝胶电泳显示,10 mg/L的mDRA-6作用6 h,HL-60细胞呈现凋亡细胞特有的DNA梯形条带;Western blot检测结果发现,mDRA-6作用HL 60细胞不同时间,Caspase 8均只有酶原条带出现,无激活片段产生,而Caspase 10和Caspase 3显示明显裂解片段产生,并随mDRA-6作用时间延长而增多;预先使用15μmol/L的Caspase 10及Caspase 3抑制剂孵育细胞1 h,能够使mDRA-6对HL-60细胞的生长抑制率分别降低64.15%(t=10.13、P<0.01)和53.69(t=8.93、P<0.01)%,而预先使用15μmol/L的Caspase 8抑制剂孵育细胞1 h,mDRA-6对HL-60细胞的生长抑制率仅降低4.40%(t=0.52、P>0.05)。以上实验结果提示,mDRA-6通过激活Caspase 10启动凋亡信号分子,诱导白血病HL-60细胞凋亡。     

抗人DR5功能性单克隆抗体诱导Jurkat细胞凋亡的线粒体途径的分子机制

目的:探讨抗人死亡受体5(DR5)功能性单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞诱导凋亡的线粒体途径的分子机制。方法:MTT法检测单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞生长抑制作用的剂量-效果及时间-效果关系;JC-1单染流式细胞术定量分析技术对凋亡的Jurkat细胞线粒体膜电位的变化进行分析;免疫印迹技术检测凋亡细胞的Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cytoc等凋亡相关蛋白的表达情况。结果:mDRA-6对Jurkat细胞抑制具有明显剂量-效果和时间-效果关系;流式细胞仪检测显示,2.0μg/ml浓度的mDRA-6作用15、30、60和120分钟时,Jurkat细胞线粒体膜电位改变率分别为20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,呈逐渐增高趋势。免疫印迹技术检测显示,mDRA-6作用后,Jurkat细胞Caspase-8、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cytoc等表达活性增加,并且Cytoc在线粒体内为递减而在胞浆呈递增的表达现象。结论:mDRA-6通过激活外源性膜受体,继而启动细胞线粒体途径导致Jurkat细胞凋亡。本研究为mDRA-6对白血病治疗奠定实验基础。     

Oridonin-induced apoptosis of Jurkat cells and its mechanism

Jurkat cells in culture medium in vitro were exposed to different concentrations of oridonin. The proliferation rate of the cells was measured by MTT assay, cell apoptotic rate was detected by flow cytometry, morphology of cell apoptosis was observed by Hoechst 33258 fluorescence staining, DNA fragmentation was assayed by agarose gel electrophoresis, caspase-3 and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) expressions were detected by Western blotting using polyclonal anti-caspase-3 antibody and mouse anti-human PARP monoclonal antibodies, and caspase-3 activity was assayed with a colorimetric assay kit before and after apoptosis had occurred. Oridonin (over 32 mol/l) inhibited the growth of Jurkat cells and caused significant apoptosis. The suppression was both time-dependent and dose-dependent. Marked morphological changes of cell apoptosis, including condensation of chromatin and nuclear fragmentation, were clearly observed by Hoechst 33258 fluorescence staining, as well as by agarose gel electrophoresis. Western blotting showed cleavage of the caspase-3 zymogen protein (32 kDa), with the appearance of its 17 kDa subunit, and a cleaved 89-kDa fragment of 116 kDa PARP was also found, together with a concurrent increase in caspase-3 apoptotic activity. Oridonin can induce apoptosis in Jurkat cells via activation of caspase-3; the results indicate that oridonin might be an important potential anti-leukaemia reagent.     

抗人DR5单克隆抗体对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用

探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对人肝癌细胞系HepG2致凋亡的作用。常规培养人肝癌细胞系HepG2,流式细胞术定量分析检测HepG2细胞表面DR5的表达。MTT法检测mDRA-6的细胞毒性作用;Annexin V-FITC/PI双色标记HepG2细胞,流式细胞术定量分析检测细胞凋亡率;在荧光显微镜下观察mDRA-6对HepG2细胞形态变化的影响。结果显示,HepG2细胞表面有DR5表达,其平均表达百分率为40%。MTT法检测显示在40 mg/L mDRA-6浓度下可杀伤42%的细胞;Hoechst33258染色证实杀伤作用是通过细胞凋亡实现的经流式细胞术检测显示,3 mg/L的mDRA-6作用HepG2细胞6 h导致24.61%的细胞发生凋亡;在荧光显微镜下可观察到mDRA-6诱导导致HepG2细胞呈现典型细胞凋亡的形态特征。上述结果表明,mDRA-6能够诱导人肝癌细胞系HepG2凋亡。     

抗人DR5单克隆抗体对人肝细胞系HL7702的凋亡作用

目的:探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA6)对人肝细胞系HL7702致凋亡的作用。方法:流式细胞术检测HL7702细胞表面DR5的表达。在荧光显微镜下观察mDRA6对HL7702细胞形态变化的影响;MTT法检测mDRA6的细胞毒性作用;AnnexinVFITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:mDRA6导致HL7702细胞呈现典型细胞凋亡的形态特征;MTT法检测显示在40mg/L浓度下可杀伤39%的细胞;经流式细胞术检测显示,3mg/L的mDRA6作用HL7702细胞6h导致25.5%的细胞发生凋亡。结论:mDRA6能够诱导人肝细胞系HL7702凋亡,mDRA6具有诱导细胞凋亡的活性。