HIF-1α质粒转染NIH3T3细胞的体外实验

目的探讨低氧诱导因子1(HIF-1)在NIH3T3细胞的体外表达.方法首先构建真核表达质粒,以脂质体为介导,体外转染细胞,经RT-PCR,Western blot,ELISA检测基因在mRNA、蛋白质等方面的表达.结果半定量RT-PCR证实在NIH3T3细胞表达外源基因,Western blot检测到外源HIF-1蛋白质表达,ELISA试验证明表达的基因产物具有生物活性.结论PcDNA3-HIF1真核表达质粒能够有效地在体外表达目的基因,为进一步的动物实验奠定了基础.     

抗肿瘤血管生成基因治疗的研究

肿瘤血管为肿瘤生长提供氧气、营养、营养、排泄代谢产物，对肿瘤转移也有重要意义。与肿瘤血管生成有关的刺激因子有VEGF、bFGF等，抑制因子有血管生成抑素、内皮抑素sFlt-1等。基因治疗在抗肿瘤血管生成治疗中主要利用病毒载体通过下调VEGF及其受体表达、阻断Ap-Tie受体配体途径、上调血管生成抑素、内皮抑素的表达发挥治疗作用。对抗肿瘤血管生成基因治疗的若干问题尚有争议。抗肿瘤血管生成的基因治疗真正走向临床还有一定距离。     

低氧诱导因子促缺血下肢血管新生的可行性研究

目的低氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）是低氧环境中起细胞调控作用的关键基因。探讨HIF-1α在细胞中的过表达是否有利于缺血性疾病的治疗。方法在体外通过腺病毒介导人HIF-1α基因（Ad-HIF-1α）入人外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）,观察转染后EPC的扩增及迁移功能改变及其在裸鼠缺血下肢局部的促血管新生作用。结果转染Ad-HIF-1α后的EPC在体外细胞扩增数成倍增加,迁移功能改善（P<0.05）;移植异种Ad-HIF-1α-EPC至BALB/c鼠缺血下肢后可见外源性EPC定向作用于缺血部位。Ad-HIF-1α-EPC较对照组进一步促进体内毛细血管数目增加（P<0.05）,缺血面积减小（P<0.05）、缺血下肢的坏死/自体离断降低60%。结论在体外,Ad-HIF-1α感染后的EPC扩增及迁移功能改善;在体内,可促进缺血下肢的局部血管新生。     

骨髓干细胞动员促进兔缺血后肢血管新生的实验研究

目的观察干细胞动员剂动员骨髓干细胞后,促进兔缺血后肢血管新生的情况。方法切断股动脉及其分支,制作兔后肢缺血模型;实验组兔皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员兔自体干细胞释放和迁移至缺血组织;对照组给予生理盐水。术后4周,行腹主动脉造影观察侧支循环形成情况,并取内收肌和腓肠肌行病理切片HE染色,应用图像分析系统统计血管密度。结果实验组兔侧支循环血管数量和血管密度大于对照组(P<0.05),缺血状态得到改善。结论骨髓干细胞动员可促进血管新生,增加缺血下肢血液灌注,改善肢体缺血状态。     

VEGF_(165)和Angiopoietin-1 cDNA治疗缺血心肌的实验研究

目的探讨血管内皮生长因子165(VEGF_(165))和血管生成素1(Angiopoietin-1,Ang1)基因导入对心肌缺血的治疗作用。方法分别构建编码VEGF_(165)和Ang1的真核表达载体。结扎SD大鼠冠状动脉前降支后1周,将缺血模型随机分为实验组(n=7)和对照组(n=7),在缺血区周围心肌内分别注射VEGF_(165)和Ang1的重组质粒和空质粒。1周后收取心脏,通过Langendorff心脏灌注模型实验,测定离体心脏的心功能。用免疫组织化学方法测定心肌注射区血管密度。结果正确构建了重组质粒pSecTag-VEGF和pSecTag-Ang1,并能在HEK293细胞中特异地表达出VEGF165和Ang1。同对照组相比,治疗后1周实验组左心室收缩压(LVSP)从(34.15±5.78)mmHg(1mmHg=0.133kPa)升高到(39.33±6.10)mmHg;左心室舒张末压(LVEDP)从(15.85±1.79)mmHg降低到(9.09±1.98)mmHg(P<0.05);左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)从(1413.52±417.73)mmHg/s升高到(1939.28±710.22)mmHg/s;左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)从(600.39±55.59)mmHg/s升高到(1030.53±401.22)mmHg/s(P<0.05);左心室做功(LVW)从(8213.88±303.68)mmHg/min升高到(15416.67±233.43)mmHg/min(P<0.05);冠状动脉流量(CF)从(3.2±0.31)mL/min升高到(4.09±0.80)mL/min(P<0.05),心肌注射区毛细血管数分别从(25±5)条/mm2增加到(46±8)条/mm2(P<0.05)。结论VEGF_(165)和Ang1基因导入能增强缺血心肌的血管新生和侧支循环的形成,改善心功能。     

联合促血管生成素-1及血管内皮细胞生长因子基因治疗对大鼠新生血管通透性的影响

目的　探讨联合转染促血管生成素 1(angoipoietin 1,Ang 1)及血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因对大鼠下肢新生血管通透性的影响 ,并观察不同基因剂量配比的差异。方法　制造大鼠下肢血管闭塞病理模型 ,按不同剂量配比肌肉内电转pcD2 Ang 1和 或pcD2 VEGF基因。应用逆转录聚合酶链反应、免疫组化染色检测外源基因在骨骼肌中的表达 ,通过伊文思蓝灌注观察其对新生血管通透性的影响。结果　逆转录聚合酶链反应及免疫组化染色均能检测到外源基因的表达。随着转入pcD2 VEGF剂量的增加 ,血管通透性逐渐增加 ;而随着转入pcD2 Ang 1剂量的增加 ,血管通透性逐渐下降。其中pcD2 VEGF 10 0 μg pcD2 Ang 12 0 0 μg组通透性与正常对照最为接近 [( 8 5 7± 0 74 )ng mlvs ( 8 4 2± 0 82 )ng ml,P >0 0 5 ]。结论　联合转pcD2 Ang 1基因可逆转pcD2 VEGF基因增加血管通透性的副作用 ,其中pcD2 VEGF与pcD2 Ang 1比例为 1 2时血管通透性最接近生理状态。与单基因治疗相比 ,适当配比的联合转基因可能成为治疗闭塞性血管病更安全、更有效的新方法。     

缺氧诱导因子-1α表达与胰腺癌病理学特征及新生血管生成的关系

目的　研究胰腺癌组织中缺氧诱导因子 - 1α(HIF- 1α)的表达与胰腺癌病理学特征的关系 ,以及 HIF- 1α表达与血管内皮生长因子 (VEGF)和肿瘤微血管密度 (MVD)之间的相互关系。方法　应用免疫组织化学方法检测 4 7例胰腺癌和 10例正常胰腺组织中 HIF- 1α和 VEGF蛋白的表达。同时用CD34单克隆抗体标记胰腺癌和正常胰腺组织中的微血管。结果　 HIF- 1α和 VEGF蛋白在 4 7例胰腺癌组织中的阳性表达率分别为 5 5 .3% (2 6 / 4 7)和 6 1.7% (2 9/ 4 7) ,而在 10例正常胰腺组织中均未见表达。胰腺癌组织 MVD为 37.6 1± 14 .3,正常胰腺组织为 7.5 5 ± 2 .4 ,二者间有显著性差别 (t'=13.5 1,P<0 .0 0 1)。 HIF- 1α和 VEGF蛋白阳性表达率及 MVD均与胰腺癌的浸润和转移密切相关 (χ2 =4 .32 ,6 .0 1,4 .75 ,4 .6 2 ;t=2 .38,3.92 ;P<0 .0 5 ) ,而与胰腺肿块大小、组织学分级和患者术后 1年生存率无关 (P>0 .0 5 )。HIF- 1α与 VEGF(r=0 .32 9,χ2 =5 .71;P<0 .0 5 )、HIF- 1α与 MVD(r=0 .5 94 ,t=4 .96 ;P<0 .0 0 1)及 VEGF与 MVD(r=0 .36 6 ,t=2 .6 4 ;P<0 .0 5 )间在胰腺癌组织中的表达均呈显著的正相关性。结论　在缺氧状态下 ,胰腺癌组织中 HTF- 1α基因被激活 ,过量表达 HIF- 1α蛋白 ,并通过诱导 VEGF     

心肌血管新生的基因治疗

尽管冠状动脉粥样硬化性心脏病的防治取得了很大进步 ,并广泛开展了冠状动脉成形术和冠状动脉搭桥术 ,但仍有许多冠心病患者未能获得有效治疗。为了改善缺血心肌的血流 ,分子生物学领域的研究已成为当今的热门 ,用基因转移技术促进缺血心肌组织的血管新生也将成为一种极有前途的治疗方法。1　基因治疗的背景研究用转基因技术治疗缺血心肌的实验背景主要来源于对大量重组的促血管生长因子的研究。 2 0多年前 ,Folkman首先提出血管生长因子的治疗作用 ,这种观点是基于对肿瘤的研究 ,人们发现肿瘤的发展 ,依赖于血管的新生 ,与这些肿瘤相关的…     

低氧对小鼠低氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子表达的影响

目的 研究低氧时小鼠肺组织中低氧诱导因子-1α（HIF-1α）及血管内皮生长因子（VEGF）表达的变化，探讨低氧与血管新生的关系。方法将哈尔滨医科大学附属第二医院呼吸科2005年4月至6月实验用雄性昆明小鼠，分为低氧组与对照组，低氧仓浓度分别为10％，7％和5％。低氧时间分别为3d．6d和9d。用免疫组织化学技术检测小鼠在低氧条件下肺组织中的HIF—1α和VEGF蛋白表达的变化及微血管密度（MVD），用Westem blotting法检测HIF-1α和VEGF的表达。结果低氧组HIF-1α和VEGF蛋白表达均增加，并且随低氧时间的延长及低氧浓度的降低而增强，而对照组HIF-1α无表达，VEGF有少量表达，P〈0、05；低氧组的MVD也高于对照组；VEGF、MVD的表达均与HIF-1α表达呈正相关（r分别为0、730与0．691）。结论HIF-1α/VEGF通路在低氧致小鼠肺组织血管新生过程中起重要作用。     

低氧诱导因子修饰内皮祖细胞促血管新生的研究

目的观察低氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）转染内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）后,EPCs在体外的扩增及迁移功能改变及对体内缺血下肢血管新生的影响。方法在人外周血EPCs中导入人HIF-1α基因。结果转染后的EPCs中HIF-1α、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）mRNA及蛋白表达升高,并被特异性siRNA-HIF-1α中度抑制;功能学检测示HIF-1α过表达增加了EPC在体外的分化、扩增、迁移;内皮细胞（EC）标记物CD31、VEGFR2、eNOS及VEGF、NO分泌增加;移植HIF-1α-EPCs至缺血下肢后可见外源性EPCs存在于缺血部位;HIF-1α-EPCs较对照组进一步促进体内毛细血管数目增加。结论在体外,HIF-1α转染后的EPCs扩增及迁移功能改善;在体内,可促进缺血下肢的局部血管新生。     

Simvastatin enhances myocardial angiogenesis induced by vascular endothelial growth factor gene transfer

Statins have cardioprotective roles. We explored the cardiac angiogenic effects of simvastatin in combination with transient overexpression of vascular endothelial growth factor (VEGF). Compared with normal mice, 1-year-old ApoE(-/-) mice fed on a high-fat diet (HFD) had about 30% less myocardial capillary (P < 0.001) and arteriolar (P < 0.03) densities, associated with decreased VEGF (55%), VEGFR-1 (56%) and VEGFR-2 (78%) mRNA expressions and myocardial endothelial nitric oxide synthase (eNOS) production (58%). By contrast, angiopoietin-1 and angiopoietin-2 mRNA expressions were increased (500% P < 0.02, and 400% P < 0.01, respectively) in the ApoE(-/-) hearts. No change was observed in Tie-2 gene expression. Phosphorylation of antiapoptotic Akt was lower and proapoptotic p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) was higher in the ApoE(-/-) mice compared with controls. Intramyocardial VEGF gene transfer increased capillary and arteriolar densities in the ApoE(-/-) mice, and simvastatin treatment further enhanced capillary density (P < 0.03) to a level similar to that of normal mice. Simvastatin did not change the lipid profile but blocked p38 MAPK phosphorylation in the ApoE(-/-) myocardium. Concurrent with these changes, there were increased levels of expression of mVEGF (P < 0.04) and VEGFR-2 (P < 0.03) mRNAs and increased production of eNOS (P < 0.05) in the ApoE(-/-) mice, while no changes were detected in the angiopoietin system. Thus, increased myocardial angiogenesis in the ApoE(-/-) mice following transient overexpression of VEGF is further increased by additional simvastatin treatment. These effects occurred concurrently with simvastatin-induced stimulation of the VEGF system, increased eNOS production and reduction in p38 MAPK phosphorylation.     

血管生成素1基因上调Tie2受体表达促进大鼠急性心肌梗死血管生成的实验研究

目的　通过观察血管生成素 1 (angiopoietin 1 ,Ang1 )基因对急性心肌梗死大鼠心肌Tie2受体表达的影响 ,探讨Ang1基因治疗促进血管生成 ,减少梗死面积的可能机制。方法　结扎左前降支冠状动脉制备大鼠心肌梗死模型 ,心肌内分别直接注射空载质粒或phAng1质粒 ;分别于术后第 3,7,1 4 ,2 8天取材 ,利用RT PCR技术分析心肌组织内Tie2受体表达 ;免疫组化方法计算血管生成以及肌性小动脉生成数量 ,Masson染色法检测心肌梗死面积。结果　Ang1基因治疗组Tie2受体mRNA表达明显高于对照组 ,于术后 7天达到高峰 ,2 8天降至正常水平。术后第 7,1 4和 2 8天 ,Ang1基因治疗组的血管生成及肌性小动脉生成较同期对照组均明显增加 ,梗死面积减小。结论　Ang1基因心肌内注射促进急性心肌梗死血管生成及肌性小动脉生成 ,减小梗死面积 ,其机制可能与促进Tie2受体上调有关。     

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植促进缺血心肌血管生成的研究

目的研究血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)基因转染骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)移植对缺血心肌的血管生成作用。方法于2004年5月至2005年8月取第四军医大学西京医院分离、培养Wistar大鼠的MSCs,用真核表达载体pcDNA3.1(-)/hVEGF165转染MSCs。45只近交系Wistar大鼠随机均分为转染组(MSCs/VEGF组)、对照组(MSCs组)、无血清培养基组(DMEM组),结扎前降支建立急性心肌梗死模型后在梗死区边缘区行5×106细胞移植,DMEM组行等量培养基注射。细胞移植前行CM-DiI标记。移植1个月后行心脏B超测量射血分数值,组织化学染色评价新生血管密度。结果培养的MSCs呈典型贴壁生长成纤维样外观,pcDNA3.1(-)/hVEGF165能有效转染大鼠MSCs,移植1个月后MSCs/VEGF组较其余各组左室射血分数(LVEF),再生血管密度明显增加,差异均有显著性(P<0.01)。结论VEGF基因转染MSCs移植能显著促进缺血心肌血管再生,进而改善心脏功能。     

联合基因治疗小型猪冠状动脉闭塞的实验研究

目的　探讨联合血管内皮生长因子 (VEGF)及促血管生成素 1(Ang 1)基因治疗小型猪冠脉闭塞的疗效。方法　在小型猪冠脉闭塞模型的心肌内注射质粒PCD2 /VEGF和 (或 )PCD2 /Ang 1,检测外源基因在心肌中的表达并观察其生物学作用。结果　逆转录 PCR及免疫组化染色均检测到外源基因的表达。转PCD2 /VEGF和 (或 )PCD2 /Ang 1基因治疗组毛细血管计数及小动脉计数均高于空载质粒对照组 (P <0 0 5 ) ,联合基因治疗组血管计数最高。冠状动脉造影证明联合基因治疗组促进闭塞冠脉侧支循环建立更为有效。结论　心肌内联合注射PCD2 /VEGF及PCD2 /Ang 1基因能够获得外源基因mRNA及蛋白的有效表达 ,与单基因治疗相比联合基因治疗能更有效地促进血管生成及侧支循环的建立。     

氯化钴对RNA干扰食管鳞癌细胞HIF-1α基因表达及功能的影响

目的研究氯化钴模拟缺氧对RNA干扰的缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因表达及功能的影响，观察在人食管鳞癌细胞系Eca-109中RNA干扰抑制HIF-1α的效果。方法选择4组细胞分别为食管癌Eca-109细胞和3株稳定转染HIF-1αSiRNA的Eca-109细胞（本实验室编号分别为H2／14号、H3／15号、H2／20号细胞），分别用200、400、600、800μmol／L氯化钴模拟缺氧，缺氧培养时间分别为12、24．48、72h，采用Western印迹和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HIF—1α蛋白及mRNA表达，同时Western印迹检测血红素加氧酶（HO-1）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、葡萄糖转运体-1（Glut-1）、P53等相关基因的表达。结果4组细胞HIF-1α蛋白表达均随氯化钴浓度加大而增加，常氧与400μmol／L氯化钴处理24h后筛选出H3／15号细胞HIF-1α蛋白表达最少，与其它3组相比差异有统计学意义（P〈0．05），mRNA检测差异无统计学意义；干扰细胞常氧下HO-1、MMP-2、Glut-1、P53表达不同程度减少，缺氧后HO-1、P53表达增加，MMP-2、Glut-1表达无明显变化。结论RNA干扰能抑制Eca-109细胞的HIF-1α基因表达，从而不同程度减少HO-1、MMP-2、Glut-1、P53等相关基因表达；经氯化钴模拟缺氧筛选出干扰效果较好的一株细胞，为进一步研究HIF-1α的功能奠定了基础。     

高脂血症脂肪肝家兔肝脏纤溶酶原激活物抑制物1型基因表达的研究

目的探讨高脂血症脂肪肝肝组织纤溶酶原激活物抑制１型（ＰＡＩ－１）ｍＲＮＡ的表达以及血浆ＰＡＩ－１活性变化。方法通过持续１２周的高脂饮食建立家兔高脂血症脂肪肝模型,分别利用发色底物法和ＲＴ－ＰＣＲ法测定模型组（ｎ＝１０）血浆ＰＡＩ－１活性及肝脏ＰＡＩ－１ｍＲＮＡ的表达,并设正常饮食组（ｎ＝７）作对照。结果与正常组相比,模型组家兔血浆脂质和ＰＡＩ－１活性在实验６周时即显著增高,实验结束时模型组肝脏呈重     

Antisense angiopoietin-1 inhibits tumorigenesis and angiogenesis of gastric cancer

AIM: To investigate the effect of angiopoietin-1 (Ang-1) on biological behaviors in vitro and tumorigenesis and angiogenesis in vitro of human gastric cancer cells. METHODS: Human full-length Ang-1 gene was cloned from human placental tissues by RT-PCR method. Recombinant human Ang-1 antisense eukaryotic expression vector was constructed by directional cloning, and transfected by lipofectin method into human gastric cancer line SGC7901 with high Ang-1 expression level. Inhibition efficiency was confirmed by semi- quantitive PCR and Western blot method. Cell growth curve and cell cycle were observed with MTT assays and flow cytometry, respectively. Nude mice tumorigenicity test was employed to compare in vitro tumorigenesis of cells with Ang-1 suppression. Microvessel density (MVD) of implanted tumor tissues was analyzed by immunohistochemistry for factorⅧstaining. RESULTS: Full-length Ang-1 gene was successfully cloned and stable transfectants were established, namely 7Angl- for antisense, and 7901P for empty vector transfected. 7Angl- cells showed down-regulated Ang-1 expression, while its in vitro proliferation and cell cycle distribution were not significantly changed. In contrast, xenograft of 7Angl- cells in nude mice had lower volume and weight than those of 7901P after 30 days' implantation (p<0.01, 293.00±95.54 mg vs. 624.00±77.78 mg) accompanied with less vessel formation with MVD 6.00±1.73 compared to 7901P group 8.44±1.33(p<0.01). CONCLUSION: Ang-1 may play an important role in tumorigenesis and angiogenesis of gastric cancer, and targeting its expression may be beneficial for the therapy of gastric cancer.     

HIF—1α在胰腺癌组织中的表达及其对细胞凋亡的影响

目的通过检测胰腺癌组织HIF-1α、Bcl-XL的表达,探讨HIF-1α对胰腺癌细胞凋亡的影响。方法应用免疫组化方法检测41例胰腺癌和20例正常胰腺组织中HIF-1α、Bcl-XL的表达,TUNEL法检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blot检测21例胰腺癌组织和10例正常胰腺中HIF-1α、Bcl-XLmRNA和蛋白的表达。结果正常胰腺组织均无HIF-1α、Bcl-XL蛋白和mRNA的表达。胰腺癌组织HIF-1α、Bcl-XL蛋白表达率分别为63.4%和87.8%,HIF-1αmRNA和Bcl-XL mRNA的表达率分别为71.4%和80.9%,两者的表达呈正相关(r=0.335,P=0.032),HIF-1α阳性表达的胰腺癌的凋亡指数较阴性表达者低[(1.32±0.59)%vs(1.79±0.77)%,P=0.034]。结论HIF-1α和Bcl-XL在胰腺癌组织中存在高表达。HIF-1α可能通过上调Bcl-XL的表达抑制胰腺癌细胞凋亡,在胰腺癌发生发展中起重要作用。     

Resveratrol enhances neovascularization in the infarcted rat myocardium through the induction of thioredoxin-1, heme oxygenase-1 and vascular endothelial growth factor

We have previously shown that resveratrol possesses cardioprotective effect, which may be attributed to its ability to (i) stimulate nitric oxide production and (ii) free radical scavenging activity. Since resveratrol is one of the major components of certain varieties of red grapes, these events may underlie the cardioprotective effects thought to be obtained from moderate red wine consumption. Here we report resveratrol enhanced myocardial angiogenesis both in vivo and in vitro by induction of vascular endothelial growth factor (VEGF), which was regulated by thioredoxin-1 (Trx-1) and heme oxygenase-1 (HO-1). Human coronary arteriolar endothelial cells exposed to resveratrol or Trx-1 on Matrigel demonstrated significantly accelerated tubular morphogenesis with induction of HO-1 and VEGF expression. This angiogenic response was repressed by tin-protoporphyrin IX (SnPP), an HO-1 inhibitor, along with downregulation of VEGF expression. However Trx-1 expression was not affected by SnPP. Again, rat neonatal cardiomyocytes treated with resveratrol significantly expressed Trx-1, HO-1 as well as VEGF. Rats were orally administered with resveratrol (1 mg/kg per day) for 14 days and then underwent permanent left anterior descending coronary artery (LAD) occlusion to document similar pro-angiogenic effect. Our results demonstrated that pretreatment with resveratrol markedly reduced infarct size 24 h after myocardial infarction (MI) and increased capillary density in the peri-infarct myocardium along with better left ventricular function 4 days after MI compared with vehicle-treated control. Concomitantly, resveratrol-treated myocardium after MI significantly induced Trx-1, HO-1 and VEGF expression. This effect was blocked by SnPP. Our findings suggest that resveratrol mediates cardioprotection and neovascularization through Trx-1-HO-1-VEGF pathway in rat ischemic myocardium.