NIH3T3细胞及小鼠骨骼肌中人PH-20基因疫苗的表达

目的:研究人PH-20基因疫苗在体内外的表达.方法:以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1( )-hPH-20基因疫苗导入MH3T3细胞中,RT-PCR和原位杂交检测hPH-20 mRNA的表达.以脂质体介导基因转染法将疫苗接种于BALB/C小鼠后腿股内侧肌,分别于接种后第4、7、11、16天取小鼠股内侧肌进行RT-PCR检测.结果:体外转染的NIH3T3细胞阳性克隆经RT-PCR检测,可见1530 bp目的条带;原位杂交结果显示阳性细胞胞浆中可见蓝紫色颗粒.取注射基因疫苗后的小鼠注射部位肌肉以RT-PCR法检测到1 530 bp的目的条带,空载体及生理盐水对照组未见目的条带.结论:人PH-20基因疫苗体内外均可表达.     

T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中的基因及蛋白表达

目的:检测T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗的基因表达.方法:大剂量提取质粒,将BALB/c鼠随机分为pcDNA3.1组、pcDNA3.1/TCR Vβ8组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+ IL-2组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+脂质体组和全硫代CpG组共5组(每组6只),双侧股四头肌内注射疫苗免疫,于第0、2、4周各免疫1次,共3次.接种疫苗后5 d,用RT-PCR法检测重组质粒mRNA表达.接种疫苗后7 d应用免疫组化检测重组质粒蛋白表达.结果:pcDNA3.1/TCR Vβ8组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+ IL-2组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+脂质体组小鼠骨骼肌中均显示mRNA和蛋白表达,而pcDNA3.1组和全硫代CpG组未见mRNA和蛋白表达.结论:T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中有效地表达了基因产物.     

人精子顶体膜相关蛋白32真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:研究人精子顶体膜相关蛋白32(hSAMP32)mRNA在体外细胞NIH3T3中的表达。方法:利用RTPCR及亚克隆技术构建pcDNA3.1( )hSAMP32质粒,实验组以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1( )hSAMP32真核表达载体导入NIH3T3细胞中,同时设置空白和阴性对照组(转染空载体pcDNA3.1( ))。原位杂交检测hSAMP32mRNA在3组细胞中的表达。结果:①RTPCR扩增产物与预期的目的基因hSAMP32长度一致。亚克隆酶切鉴定可见目的片段。②实验组阳性细胞胞浆中可见hSAMP32mRNA的表达,镜下可见蓝紫色阳性颗粒,空白和阴性对照组未见蓝紫色阳性颗粒。结论:脂质体介导基因转染法能够将pcDNA3.1hSAMP32真核表达载体高效导入NIH3T3细胞中,实现了hSAMP32基因的体外表达。     

共刺激分子B7-1与汉坦病毒核蛋白基因共表达载体的构建及免疫调节作用

目的:探讨共刺激分子B7-1(CD80)对汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫调节作用.方法:构建双启动子共表达B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的真核表达载体pcDNA 3.1-B7-S,酶切鉴定后直接肌注免疫BALB/c小鼠,同时设对照组pcDNA 3.1 空质粒接种组、pcDNA 3.1-S接种组.ELISA法检测血清特异性抗体,MTT法检测T细胞增殖反应.结果:pcDNA 3.1-B7-S接种组鼠在抗体的产生水平及淋巴细胞增殖指数上均较pcDNA 3.1-S接种组明显增高.结论:接种B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的共表达质粒优于注射单目的抗原基因表达质粒,为探索增强基因疫苗的免疫作用提供了新的途径.     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

肺炎链球菌溶菌酶作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价

目的:肺炎链球菌溶菌酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase,LytA)作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价.方法:PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增LytA基因序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-LytA,免疫印迹(western-blot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达.与前期构建的肺炎链球菌表画蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA)N端序列基因构建的质粒pcDNA3.1-PspA'核酸疫苗联合或单独肌肉注射免疫BABL/c小鼠,检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,并观察免疫小鼠肺炎链球菌D39腹腔攻击21d生存情况.结果:ELISA检测发现3组(pcDNA3.1-LytA组,pcDNA3.1-PspA'组,pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA'组)实验组小鼠特异性IgG水平较空质粒对照组显著升高(P＜0.001),pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA'组小鼠抗LytA特异性抗体IgG水平较pcDNA3.1-LytA组明显升高(P＜0.01),但是与pcDNA3.1-PspA'组比较抗PspA特异性抗体IgG水平无显著差异(P＞0.05).小鼠攻击试验提示pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA'组小鼠中位生存时间较pcDNA3.1-LytA组及空质粒对照组显著延长(P＜0.01),但与pcDNA3.1-PspA'组比较中位生存时间无显著差异(P＞0.05),生存曲线相似.结论:LytA联合PspA'的肺炎链球菌多价核酸疫苗免疫效能并不优于单一抗原PspA'的肺炎链球菌核酸疫苗,LytA作为肺炎链球菌多价核酸疫苗的优势候选抗原组分之一有待进一步研究.     

小鼠CCL21真核表达载体构建及趋化活性检测

目的:构建趋化因子CCL21的真核表达载体并表达蛋白,初步检测其趋化活性.方法:RT-PCR方法扩增CCL21 cDNA片段,并将扩增的片段插入pcDNA3.1真核表达载体,构建重组载体pcDNA3.1-mCCL21,将其转染到小鼠前胃癌细胞(mouse forestomach carcinoma,MFC).利用趋化小室法,检测表达产物针对树突状细胞(DC)趋化活性.结果:基因测序结果证实克隆产物为CCL21基因scya21b型,pcDNA3.1-mCCL21载体构建成功,Western印迹法检测到CCL21蛋白表达,转基因细胞的培养上清对树突状细胞具有显著趋化活性.结论:成功构建真核表达载体pcDNA3.1-mCCL21,其表达产物具有针对DC的趋化活性.     

SARS病毒S2蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的 构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)S2基因的原核和真核表达质粒,研究该真核表达重组质粒作为DNA疫苗的可行性.方法 采用RT-PCR技术从灭活的SARS冠状病毒RNA扩增得到SARS-CoV-S2基因片段,定向克隆入原核表达载体pET-28a和真核表达载体pCDNA3.1 中,构建pET-28a-SARS-CoV-S2和pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒.用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组质粒pET-28a-SARS-CoV-S2在大肠埃希菌BL21(DE3)plysS中表达融合蛋白;并将重组pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒免疫BALB/c小鼠,采用ELISA、Western blot的方法检测被免疫小鼠的抗体应答情况.结果 应用RT-PCR技术,从灭活的SARS冠状病毒扩增得到大小约为998 bp SARS-CoV-S2基因片段后,构建了含SARS-CoV-S2基因片段的原核表达质粒pET-28a-SARS-CoV-S2和真核表达质粒pCDNA3.1-SARS-CoV-S2;通过IPTG诱导,重组pET-28a-SARS-CoV-S2质粒在表达菌BL21(DE3)plysS内表达S2融合蛋白;用纯化的重组真核表达质粒经基因枪免疫BALB/c小鼠后,获得了高效价的特异性抗体.结论 成功构建了可表达SARS-CoV-S2融合蛋白的原核表达质粒pET-28a-SARS-CoV-S2.重组pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒可作为DNA疫苗使被免疫小鼠产生明显的免疫应答.为建立SARS特异性血清学诊断方法和研制SARS DNA疫苗奠定了一定的基础.     

弓形虫DNA疫苗在免疫鼠体内的分布情况研究

目的观察弓形虫疫苗pcDNA3.1-P30-P22免疫小鼠后在小鼠体内的分布情况。方法雌性BALB/c系小鼠,随机分成3组,每组12只,第1组为pcDNA3.1-P30-P22免疫组,第2组为空质粒pcDNA3.1对照组,第3组为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组;免疫组经肌内注射免疫,于免疫后4周和8周,分别取小鼠的注射部位肌肉、血液、肝脏及脾脏抽提组织DNA,并以此为模板进行多聚酶链反应(PCR)扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析。结果免疫后4周,免疫组小鼠的上述器官均扩增出P30-P22基因片断,对照组均未扩增出相应片断,与预期结果相符;免疫后8周,仅免疫鼠血液扩增出上述特异性片断。结论弓形虫DNA疫苗pcDNA3.1-P30-P22免疫小鼠后,重组质粒能被多个组织摄取,但在不同组织中存留的时间不同。     

转录因子Ets-1表达载体的构建及调控小鼠成釉细胞MMP-20的表达

目的 构建转录因子Ets-1的pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体,转染小鼠成釉细胞,检测Ets-1调控小鼠成釉细胞MMP-20的表达,为研究Ets-1在牙釉质发育过程中的重要作用奠定基础.方法 以从小鼠成釉细胞中提取的总RNA逆转录所得cDNA为模板,用RT-PCR法扩增得出含有kpn Ⅰ和BamH Ⅰ的Els-1目的 基因连接到pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体上.将重组质粒瞬时转染到小鼠成釉细胞中观察,并通过实时定量RT-PCR的方法检测MMP-20 mRNA的相对表达量.结果 ①经过PCR引物扩增得到一约1399bp的基因片段,重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-1双酶切进行初步鉴定后,与GenBank登录基因对比显示生物公司测序结果完全正确.②重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-1转染小鼠成釉细胞后(以转染空载体pcDNA3.1/myc-HisA作为对照),实时定量RT-PCR检测MMP-20 mRNA的相对表达量上升明显.结论 成功构建了Ets-1的真核表达载体,初步研究证明小鼠成釉细胞核中Ets-1可以上调MMP-20基因表达水平.     

自杀基因联合细胞因子的癌症治疗

INTRODUCTION The transfer of suicide genes into tumor cells is currently being used in a variety of clinical gene therapy trials for the treatment of cancer, and suicide gene therapy is the transduction of a gene that transforms a non-toxic into a toxic substance[1].     

Evaluation of clustering algorithms for gene expression data using gene ontology annotations

Background  Clustering is a useful exploratory technique for interpreting gene expression data to reveal groups of genes sharing common functional attributes. Biologists frequently face the problem of choosing an appropriate algorithm. We aimed to provide a standalone, easily accessible and biologically oriented criterion for expression data clustering evaluation.

Methods  An external criterion utilizing annotation based similarities between genes is proposed in this work. Gene ontology information is employed as the annotation source. Comparisons among six widely used clustering algorithms over various types of gene expression data sets were carried out based on the criterion proposed.

Results  The rank of these algorithms given by the criterion coincides with our common knowledge. Single-linkage has significantly poorer performance, even worse than the random algorithm. Ward’s method archives the best performance in most cases.

Conclusions  The criterion proposed has a strong ability to distinguish among different clustering algorithms with different distance measurements. It is also demonstrated that analyzing main contributors of the criterion may offer some guidelines in finding local compact clusters. As an addition, we suggest using Ward’s algorithm for gene expression data analysis.

     

PBL教学法在基因诊断及基因治疗教学中的应用?

分子生物学是现代医学的重要组成部分,其中基因诊断和基因治疗在临床医学中的应用越来越广泛。在这两个专题的教学中,如何帮助学生综合平衡分子生物学基础知识和前沿进展并加以灵活应用显得尤为重要。文章以遗传病“苯丙酮尿症”为典型案例,采用以问题为导向的教学方法( problem-based learning,PBL),综合了基因学、遗传学、氨基酸代谢、基因诊断、基因治疗等各章节的相关知识。通过结合具体案例,培养锻炼了学生自主思考和解决临床问题的能力,充分调动其学习积极性,同时对基因诊断和基因治疗等前沿技术加以掌握。     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

PTEN基因真核荧光表达载体的构建及其在喉癌细胞株

目的: 构建人PTEN基因的真核荧光表达载体并在Hep-2喉癌细胞中高效表达,阐明PTEN基因在喉癌细胞株中的抑癌效果并为喉癌的基因治疗奠定基础。方法: 从人喉黏膜组织中提取总RNA,经逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）得到PTEN全基因。克隆入PGEM-T easy载体上,经过PCR和酶切鉴定为阳性的克隆,进行测序分析。将所获得的基因定向克隆入Pegfp-C1载体中构建PTEN真核荧光表达载体,并将其转入Hep-2细胞中进行表达,Western blotting检测其表达。结果: 反转录PCR扩增后的产物,在约1 400 bp处可观察到特异性条带,序列分析表明与GenBank中的PTEN基因序列相同。PCI-PTEN真核载体转染Hep-2细胞后的Western Blotting表明表达产物与抗人PTEN单克隆抗体有特异性免疫反应。结论：成功构建出PTEN真核荧光表达载体,诱导产生蛋白经检测证实为PTEN蛋白。     

子宫肌瘤基因芯片的研究

基因芯片是一种能快速检测大量基因表达的分子生物学研究工具。子宫肌瘤基因芯片的研究发现,肌瘤中与细胞生长、增殖、凋亡、代谢、细胞运动性、血管发生、细胞外基质形成、细胞分化和免疫相关的基因表达发生了改变。文章综述子宫肌瘤基因芯片的研究进展,从分子水平探讨子宫肌瘤的发病机制。     

肝癌患者血清中HBV含量及C基因启动子基因变异的关系

目的了解肝癌患者乙型肝炎病毒(HBV)DNA含量及其与C基因启动子(BCP)基因变异的关系.方法采用PCR荧光实时定量技术检测114例肝癌患者及100例非肝癌乙肝患者HBV-DNA含量.采用PCR-微板核酸分子杂交ELISA技术对肝癌及乙肝患者进行BCP基因变异检测.结果肝癌患者48%HBV-DNA阳性,平均拷贝量为4.7×106拷贝/ml.BCP区域1 762、1 764位突变率为27%,且BCP变异的患者HBV拷贝量明显大于非变异患者.100例非肝癌乙肝患者HBV-DNA阳性率41%,平均拷贝量3.8×105拷贝/ml,BCP基因突变率为8%,肝癌患者的BCP基因突变率明显高于乙肝患者.结论HBV感染可能是导致肝癌发生的重要原因,HBV BCP变异可能与病变程度有关.     

用基因芯片研究异丙酚麻醉大鼠丘脑基因表达谱

目的:运用基因芯片研究异丙酚麻醉大鼠丘脑基因表达谱的变化. 方法:SD大鼠12只,随机分为对照组和异丙酚组,每组6只. 对照组、异丙酚组大鼠分别腹腔注射生理盐水或100 mg/kg异丙酚. 1 h后,取丘脑,抽提RNA,以RNA为模板逆转录合成cDNA,以cDNA为模板转录生物素标记的cRNA,cRNA经提纯、片断化后与大鼠神经生物学表达芯片U34杂交;杂交后的芯片用扫描仪检测信号,收集图像,用Microarray Suite Version 5.0软件分析差异表达基因并对其作初步功能分析. 结果:1323条待测基因中,异丙酚麻醉后221条基因差异表达,上调表达80条,下调表达141条,其中差异表达超过两倍的为53条. 差异性表达的基因功能可分为离子通道、信号转导、转录因子、细胞因子等. 结论:异丙酚麻醉可诱导大鼠丘脑众多基因的差异表达,基因芯片是研究全麻机制的有效方法.     

载脂蛋白E基因、LDL受体相关蛋白基因与汉人Alzheimer病的相关性研究

目的探讨中国汉族人载脂蛋白E基因、低密度脂蛋白受体相关蛋白基因多态性与Alzheimer病(AD)的相关情况。方法应用PCR-RFLP方法,在67例AD患者和77例正常人中观察apoE基因、LRP基因多态性的分布,进行关联分析。结果apoEε4与AD有显著的关联,AD患者LRP基因C/C纯合子基因型频率及等位基因C频率均高于对照组(P<0.05)。结论中国汉族人群中,apoE基因多态性、LRP基因多态性与AD呈正相关。     

应用RNA干扰抑制目的基因在小鼠体内表达

目的研究RNA干扰(RNAi)对体外和体内基因表达的沉默作用。方法以PCR方法从基因组DNA中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子,并用于驱动RNAi片段的合成;构建特异性针对目的基因(绿色荧光蛋白,GFP)的RNAi载体(Pi)。将RNAi干扰载体和GFP载体转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察、RT-PCR、流式细胞技术(FACS)分析上述细胞中RNAi对目的基因GFP表达的抑制效果,进一步在个体水平将RNAi载体注入小鼠体内,研究RNAi对GFP表达的抑制情况。结果RNAi能有效地使NIH3T3细胞中GFP表达量降低约60%以上,并能有效地抑制GFP在转基因小鼠体内的表达。结论RNAi技术能抑制目的基因在体内外的表达,是一种有效的基因治疗工具。