组织因子途径抑制物-2对人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长及血管生成的影响

目的:探讨组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)对人肝癌Hep3B细胞株裸鼠皮下移植瘤生长以及肿瘤血管生成的作用.方法:将TFPI-2稳定表达的Hep3B细胞(Hep3B-TFPI-2组)、转染空载体PCDNA3.1的Hep3B细胞(Hep3B-V组)及未进行转染的Hep3B细胞(Hep3B-P组)分别接种于裸鼠皮下,待皮下成瘤后,每隔3d测量1次肿瘤大小,并绘制出肿瘤体内生长曲线.3周后处死裸鼠,测定肿瘤体积,提取组织中总RNA和蛋白,实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR,RFQ-PCR)检测肿瘤组织中TFPI-2和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的mRNA水平;蛋白质印迹法检测肿瘤组织中TFPI-2和VEGF蛋白表达水平;免疫组织化学法检测肿瘤组织中TFPI-2蛋白表达水平和肿瘤微血管密度(micro vessel density,MVD).结果:Hep3B-TFPI-2组最终肿瘤体积明显小于Hep3B-V组和Hep3B-P组(P＜0.05).Hep3B-TFPI-2组肿瘤组织的TFPI-2 mRNA表达丰度和蛋白水平明显高于其余2组(P＜0.05);而Hep3B-TFPI-2组VEGF mRNA表达丰度和蛋白水平明显低于其余2组,与2个对照组相比,VEGF蛋白表达抑制率分别为19.8％和23.5％ (P＜0.05).Hep3B-TFPI-2组MVD计数明显低于其余2组(P＜0.05).结论:TFPI-2能抑制人肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长和肿瘤血管生成.     

Toll样受体4的表达及miR-TLR4干扰对HBV相关肝癌细胞生物学活性的影响

目的 观察Toll样受体4在乙肝病毒相关肝癌细胞系中的表达及对其生物学活性的影响。方法 Western blot检测Hep3B、HepG2.2.15、HepG2、SMMC7721及Huh7五种肝癌细胞中TLR4蛋白表达情况,选择TLR4表达高的HBV阳性肝癌细胞作为研究对象。构建4个miR-TLR4质粒和一个阴性对照质粒,选择干扰效果明显的质粒转染TLR4表达高的HBV阳性肝癌细胞。实验分为正常组,阴性对照组,干扰质粒3组及干扰质粒4组。通过MTT法、克隆平板形成实验、流式细胞术分别检测干扰TLR4表达对肝癌细胞增殖、克隆形成、周期及凋亡的影响。结果 TLR4基因在五种肝癌细胞株中均有表达,在Hep3B细胞中表达最高。与正常组和阴性对照组相比,干扰TLR4表达后,Hep3B细胞的增殖能力明显受到抑制（P＜0.05）,克隆形成率显著下降（P＜0.05）,周期阻滞于G₂/M期,并促进细胞凋亡（P＜0.05）。结论 TLR4表达上调促进HBV相关肝癌细胞Hep3B生长增殖、周期再分布以及抑制凋亡,在肝癌发生发展过程中起重要作用。     

装载mIFN-γ基因的溶瘤腺病毒CNHK200的抗肝癌活性

目的:研究鼠源γ-干扰素(mIFN-γ)基因插入溶瘤腺病毒CNHK200后,该病毒对不同的肝癌细胞系及其裸鼠移植瘤的增殖力及特异性杀伤作用。方法:用MTT法检测CNHK200-mIFN-γ在体外对人正常肝细胞L02、人肝癌细胞Hep3B、HepGⅡ的特异性杀伤作用;裸鼠体内试验观察CNHK200-mIFN-γ对肝癌Hep3B模型的抗肿瘤疗效。结果:CNHK200-mIFN-γ对正常人肝细胞L02无杀伤作用,但能特异性杀伤肝癌细胞,mIFN-γ的插入使病毒对肿瘤细胞的杀伤能力提高;动物体内,CNHK200-mIFN-γ具有明显的肿瘤生长抑制作用。结论:CNHK200-mIFN-γ可以高效率地杀死肝癌肿瘤细胞,而不杀伤正常细胞,可能具有良好的临床应用前景。     

腺相关病毒介导的人内皮抑素基因转染对肝细胞性肝癌生长的抑制作用

目的　研究腺相关病毒介导的人内皮抑素基因转染对肝细胞性肝癌的抑制作用。方法　用含人内皮抑素的腺相关病毒(r AAV2 /EGFP- Endo)转染肝癌细胞Hep3B,通过流式细胞仪检测其转染率。MTT法检测转染细胞的培养液上清对人脐静脉内皮细胞ECV30 4增生的抑制作用。Hep3B细胞接种裸鼠建立移植瘤模型,分别瘤内注射r AAV2 /EGFP- Endo(2×10 1 0 v.g.)、r AAV2 /EGFP或生理盐水,3周后检测裸鼠血液中内皮抑素的表达及移植瘤的体积和微血管密度(MVD)。结果　流式细胞仪结果显示重组腺相关病毒体外对Hep3B细胞的转染率为6 2 .5 % ;转染内皮抑素基因的Hep3B细胞的培养液上清能显著抑制ECV30 4细胞的生长(P<0 .0 1)。移植瘤内注射r AAV2 /EGFP- Endo后,荷瘤裸鼠血清中内皮抑素浓度为(82 .6 4±7.5 4 ) μg/L,移植瘤的体积和微血管密度均明显低于对照组(P<0 .0 1)。结论　腺相关病毒介导的人内皮抑素基因转染能够有效抑制人肝细胞性肝癌的生长。     

缺氧诱导因子-2α对肝癌干细胞标记物EpCAM和CD133表达的影响

目的:研究缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)对肝癌干细胞标记物EpCAM和CD133表达的影响.方法:分别上调和下调肝癌细胞系HepG2细胞和Hep3B细胞中HIF-2α的表达,Real-time PCR检测EpCAM和CD133 mRNA表达的变化;Western Blot检测EpCAM和CD133蛋白水平的变化.结果:转染HIF-2α表达质粒后HepG2细胞和Hep3B细胞中EpCAM和CD133表达水平升高(P<0.05),干扰HIF-2α表达后肝癌细胞中EpCAM和CD133表达水平降低(P<0.05).结论:HIF-2α可能在肝癌细胞"干性"维持方面发挥着积极的作用.     

EphA2通过调控Grb2表达参与肝癌细胞侵袭的机制探讨

目的:检测促红细胞生成素肝细胞受体A2(EphA2)蛋白在肝细胞肝癌中的表达情况,探讨其参与调控肝癌细胞侵袭的可能内在机制。方法:培养人正常肝细胞HL-7702和肝癌细胞株MHCC97H、Hep3B, 通过siRNA干扰法下调肝癌细胞中EphA2、生长因子受体结合蛋白2（Grb2）的表达,分为三组:未处理组（未处理肝癌细胞）、对照组（加入对照siRNA）和siRNA干扰组（加入siRNA干扰EphA2或Grb2）。通过Western blot法检测不同处理前后细胞中EphA2、Grb2蛋白的表达情况,Transwell小室检测细胞侵袭性。多组比较、组间比较分别采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果:体外侵袭实验结果显示MHCC97H、Hep3B、HL-7702穿透细胞的数量分别为:（401±3）/10 HPF、（111±4）/10 HPF、（31±3）/10 HPF,人正常肝细胞与人肝癌细胞相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。EphA2、Grb2蛋白在人正常肝细胞与人肝癌细胞中的相对表达量相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）。 siRNA法抑制细胞EphA2表达后,Hep3B和MHCC97H细胞系未处理组、对照组、siRNA干扰组穿透的细胞数量分别为:（111±4）/10 HPF、（108±5）/10 HPF、（53±3）/10 HPF和（405±5）/10 HPF、（399±4）/10 HPF、（155±7）/10 HPF,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0．001)。检测EphA2蛋白在Hep3B、MHCC97H细胞系未处理组、对照组、siRNA干扰组中的相对表达量,siRNA干扰组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。siRNA抑制Grb2表达后,Hep3B和MHCC97H细胞系未处理组、对照组、siRNA干扰组穿透的细胞数量分别为:（109±3）/10 HPF、（107±4）/10 HPF、（56±4）/10 HPF和（403±4）/10 HPF、（402±4）/10 HPF、（163±5）/10 HPF,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。检测Grb2蛋白在Hep3B和MHCC97H细胞未处理组、对照组、siRNA干扰组组中的相对表达量,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。 siRNA抑制EphA2表达后,检测Grb2蛋白在Hep3B、MHCC97H细胞未处理组、对照组、siRNA干扰组中的相对表达量,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:EphA2参与调控肝癌细胞侵袭的内在机制可能是通过调控Grb2蛋白的表达实现的,据此,我们得出EphA2可作为治疗肝细胞肝癌的新靶点。     

IWR-1对人肝癌细胞株Hep3B的增殖及Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用

目的 探讨IWR-1对人肝癌细胞株Hep3B细胞增殖的影响及可能的机制。方法 用不同浓度IWR-1（2、4、8、16μmol/L）处理Hep3B细胞,CCK-8法检测细胞生长抑制率;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡率;Western blot法检测细胞中蛋白表达的变化,实时定量RT-PCR检测β-catenin和c-myc mRNA表达的变化。结果 IWR-1对人肝癌Hep3B细胞的生长抑制作用呈现剂量和时间依赖性（P<0.01）。流式细胞术结果显示,Hep3B细胞的细胞周期呈现明显的G0/G1期阻滞,且细胞凋亡率明显升高（P<0.01）,呈现剂量依赖性。IWR-1可引起β-catenin和c-myc mRNA表达下降,β-catenin、c-myc蛋白表达下降,而Axin 1和p-β-catenin蛋白表达上升。结论 IWR-1可以抑制人肝癌细胞株Hep3B的增殖,其机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路来实现。     

中期因子诱导肝癌细胞Hep3B抵抗失巢凋亡

目的：探讨肝素结合分子中期因子（midkine,MK）对肝癌细胞Hep3B抵抗失巢凋亡的影响。方法：采用悬浮培养法建立人肝癌来源细胞系Hep3B失巢凋亡模型,以不同质量浓度（10、50、100 ng/ml）MK或PBS（对照组）处理失巢培养的肝癌细胞Hep3B,采用流式细胞术检测Hep3B细胞的凋亡,采用Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3的表达。结果：随着悬浮培养时间的延长,肝癌细胞Hep3B失巢凋亡率逐渐升高,培养72 h后悬浮培养的Hep3B细胞凋亡率显著高于贴壁培养的Hep3B细胞凋亡率\[（38.76±4.23）% vs （6.76±1.43）%,P<0.01\]。不同质量浓度MK处理24 h后,悬浮培养Hep3B细胞的凋亡率均明显低于对照组,且与MK的浓度呈负相关关系（r=0.951,P=0.049）;同时,MK处理后Hep3B细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显增加,而促凋亡蛋白caspase-3则明显下降。结论：MK可能通过上调Bcl-2蛋白表达和下调caspase-3蛋白的表达来提高肝癌细胞Hep3B在失巢状态下抵抗凋亡的能力。     

三氧化二砷抑制肝癌Hep G2 细胞侵袭转移 及对RhoC 基因表达的影响

 目的　了解三氧化二砷(As2 O3 ) 对肝癌Hep G2 细胞体外黏附、侵袭和迁移的抑制作用及对转 移基因RhoC 表达的影响,探讨As2O3 抑制肝癌细胞转移的机制。方法　分别采用MTT 法、Transwell 检测As2O3 对Hep G2 细胞黏附、迁移、侵袭能力的影响; 采用RT2PCR、Western blot 方法检测As2O3 作 用前后Hep G2 细胞中RhoC 基因的表达及变化。结果　As2O3 作用后Hep G2 细胞黏附率、侵袭及侵袭 细胞数较对照组明显下降( P < 0. 05) 。As2O3 作用4 、6 、8 天后RhoC2mRNA 及蛋白表达水平逐渐下降 ( P < 0. 05) 。Hep G2 细胞中RhoC2mRNA 表达和蛋白表达具有相关性( r = 0. 92 , P = 0. 046) 。结论　 As2O3 可明显抑制Hep G2 细胞细胞黏附、迁移和侵袭的能力;并可通过下调RhoC 基因的表达而抑制其 侵袭转移。     

ANGPTL4 基因对不同肝癌细胞株生长的影响

目的:观察血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like 4, ANGPTL4 )基因对不同肝癌细胞株生长的影响. 方法:用RT-PCR和Western印迹法检测9种不同肝癌细胞及永生化肝细胞中ANGPTL4的表达水平;选择ANGPTL4低表达的Huh-7、MHCC-LM3 和中度表达的MHCC-97L共3个肝癌细胞株,以pEGFP-N1质粒为载体,用Lipofectamine 2000脂质体转染 ANGPTL4 基因,用G418筛选结合FCM法对转染阳性细胞进行筛选,建立过表达ANGPTL4的稳定细胞株.制备细胞芯片,用 Ki-67 荧光免疫细胞化学技术检测3个稳定细胞株的体外增殖率,用裸小鼠体内成瘤实验观察ANGPTL4对这3个细胞株在裸小鼠体内生长的影响.结果:ANGPTL4 mRNA在未转染肝癌细胞Huh-7和MHCC-LM3中低表达,在MHCC-97L细胞中中度表达,在Hep3B细胞中高表达.细胞芯片检测结果表明,与空载体组相比,稳定过表达ANGPTL4的Huh-7细胞体外增殖率较低( P=0.000 74),而稳定过表达ANGPTL4的MHCC-LM3( P =0.073 08)和MHCC-97L( P=0.011 52)细胞株的体外增殖率则较高.体内实验证实,ANGPTL4可以明显抑制Huh-7细胞的裸鼠体内成瘤( P ＝0.001 10),而促进MHCC-LM3细胞( P＝0.057 50) 和MHCC-97L细胞( P＝0.018 91)的裸鼠体内成瘤.结论:ANGPTL 4对不同肝癌细胞株的生长有不同影响,而对同一种细胞株体内和体外生长的影响基本一致.     

Notch1基因转染对人肝癌细胞Hep3B生长的影响及作用机制的研究

目的：研究逆转录病毒介导的Notch1（ICN）基因转染对人肝癌细胞生长的影响，并对其作用机制进行了探讨。方法： 采用磷酸钙沉淀法质粒共转染293T细胞，制备出表达组成性活化形式的Notch1（ICN）和/或绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒载体MSCVICN/GFP及对照逆转录病毒载体MSCVGFP，并检测病毒滴度。用逆转录病毒感染人肝癌细胞Hep3B，观察病毒的感染效率，MTT比色法测定瞬时表达Notch1（ICN）对Hep3B人肝癌细胞生长的影响，利用流式细胞仪分析细胞周期分布的变化，Western blot方法检测细胞周期调控蛋白的变化。结果：通过质粒共转染可获得具有较高滴度的重组逆转录病毒。MTT比色法显示瞬时表达Notch1（ICN）基因可以抑制人肝癌细胞Hep3B的生长，瞬时表达Notch1（ICN）基因可使Hep3B细胞周期停滞在G0/G1期并上调细胞周期调控蛋白P53的表达水平。结论：Notch1基因可通过影响细胞周期分布和P53蛋白的表达水平而抑制人肝癌细胞生长。     

HIF-1α基因表达沉默对肝癌细胞的放射增敏作用*

目的:探讨在乏氧条件下,HIF-1 α 在肝癌细胞中的表达,及HIF-1 α 表达沉默后对肝癌细胞的放射增敏作用。方法:利用Westernbolt方法检测不同乏氧时相HIF-1 α 在肝癌细胞Hep3b 中的表达。构建特异性的HIF-1 α慢病毒干扰载体,利用慢病毒感染肝癌细胞Hep3b,杀稻瘟菌素进行药物筛选,利用RT-PCR 和Westernblot检测干扰效果,利用克隆形成实验观察HIF-1 α 表达沉默后对肝癌细胞反射敏感性的影响。结果:在乏氧条件下,肝癌Hep3b 细胞HIF-1 α 蛋白表达增强。利用特异性的HIF-1 α 慢病毒沉默肝癌细胞HIF-1 α 的表达,Hep3b 细胞中HIF-1 α 表达降低了90% ,说明HIF-1 α 载体构建成功。HIF-1 α 表达沉默后,能明显降低放射后Hep3b 细胞的克隆形成率,其放射增敏比为2.18。结论:乏氧可以诱导肝癌细胞HIF-1 α 的表达,HIF-1 α 表达沉默对肝癌细胞具有放射增敏作用。      

NF-κB,Gadd45γ蛋白在肝癌中的差异表达及其意义

目的:分析NF-κB,Gadd45γ蛋白在肝细胞性肝癌中的差异表达,探讨其在肝癌尤其是HBV感染型肝癌发生发展中的意义.方法:应用免疫组化方法检测NF-κB,Gadd45γ蛋白在64例肝癌和48例癌旁组织中的表达情况,并结合HBV感染状态与临床病理资料进行分析.结果:NF-κB在感染型肝癌组织中的表达率高于癌旁组织和非感染型肝癌.Gadd45γ在感染型肝癌组织中的表达率低于癌旁组织和非感染型肝癌组织,差别具有统计学意义(P＜0.05).NF-κB的表达与肝癌的分化程度,转移能力有关;NF-κB,Gadd45γ表达呈负相关(P＜0.05).结论:HBV感染型肝癌组织中NF-κB的高表达,Gadd45γ的低表达并NF-κB部分介导的Gadd45γ表达下调共同参与了肿瘤的发生发展.     

Survivin-pPRIME-IGF1R-miR30慢病毒载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制

目的：探讨survivin启动子调控的重组慢病毒survivinpPRIMEIGF1RmiR30载体(简写为surIGF1RmiR30)对肝癌Hep3B细胞IGF1R表达和细胞生长的影响。方法：PCR扩增survivin启动子,构建surpPRIME;将针对〖STBX〗IGF1R〖STBZ〗基因的干扰序列与surpPRIME载体连接,构建surIGF1RmiR30慢病毒载体。将surIGF1RmiR30、psPAX2和pMD2G质粒共转染293T细胞,扩增慢病毒,检测病毒滴度。以surIGF1RmiR30感染人肝癌Hep3B细胞和胎肝L02细胞,RTPCR、Western blotting检测Hep3B细胞IGF1R的表达,CCK8法检测Hep3B细胞的生长。结果：成功构建survivin启动子调控的慢病毒载体surIGF1RmiR30,滴度为4.58×109 PFU/ml。SurIGF1R miR30感染后,Hep3B细胞中特异表达荧光蛋白,L02细胞中基本没有表达。SurIGF1RmiR30感染Hep3B细胞可阻断IGF1R mRNA和IGF1R蛋白的表达。SurIGF1RmiR30感染抑制肝癌细胞的生长,第7天时的抑制率达60％(P<0.05)。结论：成功构建的重组慢病毒载体surIGF1RmiR30 可有效地降低肝癌细胞中IGF1R的表达,抑制肝癌细胞的增殖。     

RNA干扰真核翻译延长因子1A1抑制肝癌Hep3B细胞的增殖

目的 :探讨RNA干扰真核翻译延长因子1A1(eukaryotic translation elongation factor 1A1,e EF1A1)的表达对肝癌Hep3B细胞增殖能力的影响及其可能的作用机制。方法 :构建靶向e EF1A1的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)重组载体p GPU6/GFP/Neo-e EF1A1-sh RNA,并将其转染至肝癌Hep3B细胞中,随后应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测e EF1A1 m RNA和蛋白的表达,CCK-8(cell counting kit 8)法检测细胞的增殖能力,平板克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力,FCM法检测细胞周期的变化,蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)的表达。结果 :成功构建重组载体p GPU6/GFP/Neo-e EF1A1-sh RNA,并获得稳定低表达e EF1A1的肝癌Hep3B细胞。p GPU6/GFP/Neo-e EF1A1-sh RNA转染组Hep3B细胞中e EF1A1 m RNA和蛋白的表达水平明显低于阴性对照组(转染阴性对照载体p GPU6/GFP/Neo-NC的Hep3B细胞)和空白对照组(未转染的Hep3B细胞)(P<0.01,P<0.05)。与阴性对照组比较,p GPU6/GFP/Neo-e EF1A1-sh RNA转染组Hep3B细胞的体外增殖能力和克隆形成能力明显下降(P<0.05,P<0.01),G1期细胞所占比例明显上升(P<0.01),S期细胞所占比例明显下降(P<0.05),cyclin D1和CDK4蛋白的表达水平明显下调(P<0.05)。结论 :下调e EF1A1的表达可以抑制肝癌Hep3B细胞的增殖能力。     

Wnt7a对肝癌细胞凋亡、迁移及侵袭的影响

目的:检测Wnt7a在肝癌中的表达,分析Wnt7a对肝癌细胞活性、凋亡、迁移及侵袭的影响,探讨Wnt7a在肝癌中的作用。方法:分别采用免疫组织化学染色和Western blot检测组织和细胞系中Wnt7a的表达情况;Hep3B细胞经人重组Wnt7a蛋白（rWnt7a）处理后,MTT法检测细胞活性改变,流式细胞仪检测细胞凋亡变化,Transwell分析细胞迁移及侵袭能力变化。结果:相对于癌旁组织,肿瘤组织低表达Wnt7a蛋白;经rWnt7a处理后,Hep3B细胞活性降低、细胞凋亡增多且迁移与侵袭能力下降。结论:Wnt7a蛋白能抑制Hep3B细胞生长、迁移与侵袭能力,可能在肝癌中发挥抑癌作用。     

神经降压素对肝细胞肝癌生长和侵袭的影响*

目的:探讨神经降压素（neurotensin ,NTS）与肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma ,HCC ）生长和侵袭性的关系。方法:随机选取天津医科大学肿瘤医院100 例经部分肝切除术治疗的HCC 患者的临床病理资料,并分析NTS 、神经降压素受体1（neurotensin receptor 1,NTR 1）与临床病理指标的相关性。以Hep3B 细胞为基础,通过基因转染技术和RNA 干扰技术构建不同NTR 1 表达水平的HCC 细胞系。利用BrdU增殖实验、AnnexinV凋亡实验、划痕修复实验、Transwell 侵袭实验来观察不同NTS 处理和不同NTR 1表达水平的细胞在增殖、凋亡、迁移、侵袭上的差异。结果:NTS 、NTR 1 表达与HCC 患者包膜完整性和门静脉癌栓浸润等转移指标密切相关。外源性NTS 刺激和高表达NTR 1 对Hep3B 细胞的增殖与凋亡无影响。Hep3BNTR 1hi细胞的划痕修复率和侵袭细胞数均显著高于Hep3Bwt细胞,Hep3BNTR 1-细胞的划痕修复率和侵袭细胞数均显著低于Hep3Bwt细胞,同样NTS 处理的Hep3Bwt、Hep3BN TR1hi细胞的划痕修复率和侵袭细胞数均高于对照组。结论:HCC 组织中NTS 、NTR 1 高表达与肝癌高侵袭性相关,外源性NTS 刺激和高表达NTR 1 不影响HCC 的增殖凋亡,但会增强其侵袭性。      

长链非编码RNA NRAV在肝癌组织和细胞中的表达及其对癌细胞糖酵解的影响

目的:探究长链非编码RNA抗病毒反应的负调节剂(negative regulator of antiviral response, NRAV)在肝癌组织和细胞中的表达情况及其对肝癌细胞糖酵解和6磷酸果糖2激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)表达的影响。方法:RT-qPCR检测NRAV和PFKFB3 mRNA表达。通过转染shRNA或过表达质粒下调或上调肝癌细胞中NRAV表达,通过检测葡萄糖摄取、乳酸生成和ATP水平评估肝癌细胞糖酵解能力。通过Western blotting检测PFKFB3蛋白水平。结果:NRAV在肝癌组织中表达显著高于癌旁组织。NRAV在肝癌细胞系(Hep3B、PLC/PRF/5、HCCLM3、SK-Hep-1和Huh7)中的表达均显著高于正常肝细胞系(MIHA)。干扰NRAV显著减少肝癌细胞葡萄糖摄取、乳酸生成和ATP水平,而过表达NRAV显著增强肝癌细胞糖酵解。肝癌组织中NRAV与PFKFB3 mRNA表达显著正相关,敲低NRAV显著降低肝癌细胞中...     

miR-21靶向抑制TIMP3表达促进肝细胞肝癌细胞侵袭

目的:探讨miR-21在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞中的表达及其调控细胞增殖和侵袭的机制.方法:通过Real-time PCR检测HCC细胞株(Hep3B、HuH7、SNU398和Hep3G2)和人正常肝细胞(THLE2、THLE3)中miR-21的表达.使用miR-21-...     

ANGPTIA基因对不同肝癌细胞株生长的影响

目的：观察血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like4，ANGPTL4）基因对不同肝癌细胞株生长的影响。方法：用RT—PCR和Western印迹法检测9种不同肝癌细胞及永生化肝细胞中ANGPTL4的表达水平；选择ANGPTL4低表达的Huh-7、MHCC—LM3和中度表达的MHCC-97L共3个肝癌细胞株，以pEGFP-N1质粒为载体，用Lipofectamine2000脂质体转染ANGPTL4基因，用G418筛选结合FCM法对转染阳性细胞进行筛选，建立过表达ANGPTL4的稳定细胞株。制备细胞芯片，用Ki-67荧光免疫细胞化学技术检测3个稳定细胞株的体外增殖率，用裸小鼠体内成瘤实验观察ANGPTL4对这3个细胞株在裸小鼠体内生长的影响。结果：ANGPTL4mRNA在未转染肝癌细胞Huh-7和MHCC-LM3中低表达，在MHCC-97L细胞中中度表达，在Hep3B细胞中高表达。细胞芯片检测结果表明，与空载体组相比，稳定过表达ANGFFL4的Huh-7细胞体外增殖率较低（P=0．00074），而稳定过表达ANGPTL4的MHCC—LM3（P=0．07308）和MHCC-97L（P=0．01152）细胞株的体外增殖率则较高。体内实验证实，ANGPTL4可以明显抑制Huh-7细胞的裸鼠体内成瘤（P=0．00110），而促进MHCC-LM3细胞（P=0．05750）和MHCC-97L细胞（P=0．01891）的裸鼠体内成瘤。结论：ANGPTL4对不同肝癌细胞株的生长有不同影响，而对同一种细胞株体内和体外生长的影响基本一致。