应用胶原凝胶构建组织工程化皮肤的研究

目的探讨以胶原凝胶为支架材料构建组织工程化皮肤的可行性。方法体外分离、培养人皮肤表皮细胞和成纤维细胞；利用自制的胶原蛋白制成胶原凝胶作为组织工程支架材料；在成功构建人工真皮的基础上种植表皮细胞，构建复合人工皮肤；采用HE染色与免疫组织化学的方法对复合人工皮肤进行组织学检测。结果HE染色可见，构建的复合人工皮肤具有表皮和真皮双层结构；免疫组织化学染色显示，Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白阳性，在形态结构上与正常皮肤相似。结论培养的人表皮细胞和成纤维细胞种植于胶原凝胶支架上，气一液界面培养可构建出具有类似正常皮肤结构的组织工程化皮肤。     

构建含黑色素细胞组织工程皮肤的研究

目的 探讨运用组织工程方法构建含有黑色素细胞的组织工程皮肤。方法 以包皮组织作为细胞来源，采用消化法获得角朊细胞、成纤维细胞和黑色素细胞，在自行设计的组织工程皮肤培养系统构建组织工程皮肤。行Dopa染色、透射电镜和S-100免疫组织化学检测构建的皮肤中黑色素细胞的分布和状态。结果 构建的组织工程皮肤结构完整，细胞状态良好，Dopa染色、透射电镜和S-100免疫组织化学检测均显示含有大量黑色素细胞并处于良好状态。结论 构建了含黑色素细胞的组织工程皮肤，可用于下一步的动物实验和临床实验。     

利用胶原构建皮肤组织工程支架的研究

目的利用胶原构建皮肤组织工程支架。方法用Na2S、弹性蛋白酶预处理胎牛皮得到胶原纤维；经蛋白酶M降解胶原纤维后，0．5mol／L醋酸溶液溶解得到酸溶性胶原；再用蛋白酶N处理上述酸溶性胶原，最终得到生物相容性良好的胶原溶液；将胶原溶液构建皮肤组织工程支架。通过SDS-PAGE试验，分析酸溶性胶原分子量及基本结构；用皮肤组织工程支架材料包覆大鼠创面，观察创面愈合情况，研究支架材料对大鼠创伤愈合的影响；在支架材料上种植成纤维细胞，观察细胞扩增情况，以及支架材料对细胞移植影响。结果通过特异性蛋白酶M处理得到的酸溶性胶原，显示典型的1型胶原SDS-PAGE图谱；构建的皮肤组织工程支架呈多孔海绵状，孔径为50～200μm；在支架材料上种植成纤维细胞扩增情况良好；用于修复大鼠创面，具有促进创面愈合作用。结论酸溶性胶原经蛋白酶N处理后，生物相容性良好，适合于皮肤组织工程支架的构建，并具有良好生物活性。     

组织工程化人工复合皮肤的构建

目的 为皮肤缺失的移植提供具有生物活性的表皮、真皮的组织工程化人工复合皮肤。方法 将体外传代培养的表皮角朊细胞和真皮成纤维细胞分别接种在冷冻干燥及戊二醛交联的I型胶原基质网架的两侧,在液面下培养1周后,改为气－液界面培养,动态观测人工皮肤光镜下组织学形态及电镜下超微结构。结果 人工复合皮肤具有表皮、真皮双层结构。培养过程中表皮逐步增殖、分化、发育,形成基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层;真皮基质网架渐渐降解,并逐步被增殖的成纤维细胞及其所分泌的细胞外基质所取代,完成真皮构建。结论 利用组织工程技术体外构建人工复合皮肤,可用于皮肤缺失者的自体移植治疗,体外构建的复合人工皮肤可从根本上解决自体供皮不足,且细胞源于自体皮肤,排除了发生免疫排斥反应和疾病传播的风险,具有安全、有效、实用等优点。     

组织工程化皮肤研究新进展

组织工程化皮肤是指运用工程及生命科学的原理和方法构建出的用于修复、维持和改善损伤皮肤组织功能的替代物 ;其核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。理论上 ,组织工程化皮肤应具有如下功能 :①作为损伤皮肤的替代物 ;②作为基质植入宿主体内并生长 ;③或作为含药理成分的化学刺激物 ,促进创面愈合[1] 。但现阶段 ,还不能作为永久性的皮肤替代物。本文对以胶原为细胞外基质材料所形成的组织工程化皮肤的研究进展作一简要综述。一、胶原作为细胞外基质材料及特点胶原蛋白是真皮结缔组织的主要成分 ,占皮肤干重的70 % ,具有天然…     

组织工程皮肤的应用研究

目前，人们对人工活性皮肤替代物（细胞工程或组织工程人工皮肤）的研究已进行了约半个世纪。将表皮细胞培养于经辐照的鼠成纤维细胞（Fb）滋养层，是组织工程皮肤治疗大面积烧伤的里程碑。由于培养基的改良与商品化，促使角质形成细胞的无血清层和无滋养层培养成功，结合早期切痂和应用临时皮肤覆盖物，     

体外培养表皮干细胞构建组织工程皮肤的研究

目的探讨应用表皮干细胞构建组织工程皮肤修复皮肤缺损的可行性。方法运用黏附实验将人表皮干细胞分选出来后大量培养，将成纤维细胞和表皮干细胞转移到真皮底物上构建组织工程皮肤，并将之移植于裸鼠皮肤缺损模型，于术后第1、2、4周处死动物，收集标本，进行组织学、透射电镜及免疫组织化学检查。结果组织工程皮肤移植后4周具备完整的表皮层和真皮层，表皮层中具备基底层、棘层、颗粒层和角质层。表皮细胞间还可以看到有桥粒、半桥粒、角质透明颗粒和粗张力微丝柬。表、真皮层间有连续的、完整的基底膜。真皮网架破坏明显，大量的成纤维细胞增殖活跃，胶原纤维排列整齐，有丰富的毛细血管。结论本研究所构建的组织工程皮肤组织学形态和超微结构上已接近于正常的皮肤，从而为临床修复皮肤缺损的研究打下了坚实的理论和实践基础。     

组织工程化人工神经实验研究

目的：研究组织工程化人工神经修复大鼠2.5cm长坐骨神经缺损的效果。方法：21只2月龄Lewis 1w雌性大鼠随机分成三个神经移植组,每组7只。A组：种植同源雪旺细胞并具有内部支架结构的胶原神经管,即组织工程化人工神经。B组：无雪旺细胞但具有内部支架结构的胶原神经管。C组：自体神经移植体。术后六个月,进行系列神经电生理监测,神经肌肉组织学观察,S－100和神经微丝蛋白（Neurofilament）免疫组化染色,轴突计数等检查。结果：在A组和C组移植神经上均能诱发出波幅明显的神经肌肉复合动作电位（CMAP）,再生轴突已通过移植神经全长,远端肌肉轻度萎缩。而B组中没有或仅记录到极小波幅的CMAP,移植神经远端结缔纤维组织增生,再生轴突罕见,所支配肌肉明显萎缩。结论：初步结果显示：组织工程化人工神经可用来修复大鼠长段神经缺损。     

兔髂骨生长板细胞的培养及体内成软骨作用的研究

目的 建立大量生产髂骨生长板软骨细胞的培养及保存方法,观察髂骨生长板细胞在裸鼠体内的成软骨作用,为生长板组织工程提供种子细胞。方法 取二周龄兔髂骨生长板软骨,经机械剪切和化学消化作用后,接种、培养及液氮保存,通过显微镜观察其生物学表现,并通过甲苯胺兰、碱性磷酸酶染色及Ⅱ型胶原染色对其生物学特性进行签定。将生长良好的第二代细胞注入裸鼠背部,于第四周取材,进行组织学观察。结果 细胞可在体外大量增殖并在六代内无明显反分化,但缺乏向肥大细胞进一步分化的能力。冷冻复苏细胞存活率为92％。注射的细胞悬液可在裸鼠体内形成软骨组织,并进一步向肥大细胞转化。结论 成功建立了髂骨生长板细胞的培养及冻存方法,证明髂骨生长板细胞可在体内进一步形成软骨组织并向肥大期细胞转化。     

混合接种法构建组织工程皮肤

目的 探讨混合接种法体外构建复合皮的可行性.方法 在异种猪脱细胞真皮的真皮面接种人成纤维细胞7 d后,将其分两组进行实验.实验组:将表皮细胞按5×105/cm2与成纤维细胞0.2 ×105/cm2混合后接种于表皮面,培养液用K-SFM与成纤维细胞上清的1:1混合液.对照组:仅接种表皮细胞5×105/cm2,培养液用K-SFM.培养1、3周后取材观察其形态变化,并行免疫组化鉴定.结果 培养3周后,实验组可见表皮层连续,细胞层数3～4层,与真皮连接紧密,有表皮突形成;对照组表皮细胞层仅1～2层,且与真皮分离.实验组Laminin强阳性提示基底膜形成充分,并经透射电镜也可观察到完整的基底膜.结论 将表皮细胞与少量成纤维细胞混合接种,可促进表皮细胞在脱细胞真皮上黏附增殖,并有助于基底膜充分形成.     

应用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析兔Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量

应用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳）分析了兔皮中Ⅲ型胶原的含量。采用此法检测了正常兔皮伤后７２ｈ深Ⅱ度创面、伤后１月及１．５月的已愈创面组织中胶原成分的改变，旨在探讨深Ⅱ度烧伤早期及愈后皮肤胶原的变化，结果表明创面在伤后及愈合后组织中Ⅲ型胶原含量均显著减少。提示在创面愈合过程中，胶原修复的同时伴有Ⅲ型胶原的减少。     

应用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳分析兔Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量

应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE 电泳)分析了兔皮中Ⅲ型胶原的含量。采用此法检测了正常兔皮伤后72h 深Ⅱ度创面、伤后1月及1.5月的已愈创面组织中胶原成分的改变,旨在探讨深Ⅱ度烧伤早期及愈后皮肤胶原的变化,结果表明创面在伤后及愈合后组织中Ⅲ型胶原含量均显著减少。提示在创面愈合过程中,胶原修复的同时伴有Ⅲ型胶原的减少。     

扩张后皮肤挛缩动力环境的实验研究

目的　研究皮肤扩张后真皮内环境的变化及其与挛缩过程的关系。方法　采用兔头部扩张模型进行皮肤扩张实验,通过免疫组化、放射免疫测定等方法研究了真皮Ⅰ、Ⅲ型胶原以及透明质酸的变化。结果　Ⅰ型胶原在皮肤扩张后出现破坏和修复的现象,而Ⅲ型胶原有一过性增多。透明质酸的含量在皮肤扩张后由30ng/ml增加到80ng/ml,而且在相当长时间内呈增高状态,快速扩张变化较常规扩张明显。结论　扩张后真皮中的胶原结构发生重组,透明质酸的增加为扩张后皮肤挛缩提供重要的动力环境基础,快速扩张产生透明质酸多因此更易发生挛缩。     

Cosmetic improvement in various acute skin defects treated with tissue-engineered skin

Acute skin defects often cause many adverse events such as abnormal pigmentation and scar formation, the satisfactory healing of which remains a significant clinical challenge. Over the past several decades, a number of skin equivalents have been available for clinical purposes to promote wound closure. However, the true values of skin equivalent - tissue-engineered skin (TE-skin) composed of neonatal fibroblasts and keratinocytes - in improving the quality of wound healing are not yet elucidated. A total of 158 patients were enrolled, 129 of which were used in this study. In these patients, acute skin defects were treated with TE-skin as experimental group, and treated with Vaseline primary dressing as control group. The differences in average healing times between the two groups were determined with statistical analysis according to different depths of skin defects. Wound quality, including pigmentation, cicatrization, and pliability, was assessed by investigators from different clinical centers over a 6-month period. The cosmetic outcome of the wound was further evaluated with histological method. In the study, the average time of wound closure in the experimental group was significantly shortened by 6.5 to 20 days according to different depths of skin defects. The cosmetic quality of reconstructed skin was satisfactory, with the patients enjoying better pliability, less abnormal pigmentation, and cicatrization. Safety analysis demonstrated that the wounds treated with TE-skin did not show clinical or laboratory evidence of rejection during the trial. These results indicate that TE-skin is a suitable and clinically effective treatment for various acute skin defects. Furthermore, the TE-skin appears to produce more satisfactory cosmetic results when compared with the conventional therapy.     

猕猴组织工程化周围神经移植物的实验研究

目的 评价利用化学萃取法获得的神经支架制备猕猴组织工程化周围神经移植物修复40mm尺神经缺损的效果。方法 共使用成年猕猴9只，随机取其中的6只，培养自体雪旺细胞，应用已经制备好的去细胞神经为支架材料构建组织工程化周围神经移植体修复猕猴尺神经的40mm缺损。实验分实验组，空白组，正常对照组3组。术后5个月通过形态学，肌电检测和免疫组织化学方法观察。结果 3组均未发现猕猴双手有糜烂或溃疡形成，猕猴小鱼际肌群的饱满度和弹性于术前无明显差别。实验组与正常对照组间小鱼际肌群的运动动作电位潜伏期．最大振幅及再生神经纤维的数目差异均无统计学意义（P〉0．05）。但在实验组与空白组间的差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 用自体源雪旺细胞微注入去细胞同种异体神经支架构建的组织工程化神经移植物修复猕猴40mm的尺神经缺损，可取得与自体神经移植相似的效果。