抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体的鉴定、免疫活性测定及其对T淋巴细胞的作用

目的:鉴定自制的抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体(双抗)的双向结合能力,测定其免疫活性及其对T淋巴细胞的作用.方法:用标化凝胶柱洗脱、免疫组化等方法对自制双抗的相对分子质量及双向结合能力进行测定,用酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法对双抗的双向免疫活性及其对T淋巴细胞表型的作用进行测定,并观察T淋巴细胞形态的变化.结果:经洗脱证实该双抗相对分子质量为11万;经双抗作用后,胶质瘤细胞和淋巴细胞阳性染色率分别>80％和>90％;免疫活性测定显示双抗不仅可与T淋巴细胞结合(结合效价为1∶32 000),还可结合胶质瘤细胞(结合效价为1∶8 000);在细胞表型方面,被双抗活化时,CD3+细胞数占绝大多数,CD8+细胞比例随着培养时间的延长逐渐增加.结论:所制备的复合物确系具有双向结合能力的双抗,有双向免疫活性,并可活化T淋巴细胞.     

rIL-2、TNF-α、IFN-γ与抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体的协同细胞毒作用

目的:观察细胞因子rIL-2、TNF-α、IFN-γ对抗CD3-抗胶质瘤双特异性抗体(双抗)的协同作用,进一步提高双抗对人脑胶质瘤的治疗作用.方法:以人脑胶质瘤细胞株SHG-44为靶细胞,健康人或胶质瘤患者的外周血单个核细胞(PBMC)为效应细胞,以18 h 3H-TdR掺入释放法测定细胞毒活性,采用单比实验和联合作用等对比分析方法,分析各细胞因子(rIL-2、TNF-α、IFN-γ)对双抗诱导的细胞毒性作用的影响.结果:rIL-2、TNF-α、IFN-γ均可协同提高双抗对人脑胶质瘤的细胞毒作用(P<0.05).来源于恶性胶质瘤患者的效应细胞活性较正常人低,rIL-2与双抗可协同增强其活性.结论:细胞因子rIL-2、TNF-α、IFN-γ可协同提高双抗对效应细胞的活化,充分激活效应细胞,增强抗肿瘤免疫能力.     

抗EGFR/CD3双特异性抗体的制备与功能的初步研究

目的 构建抗表皮生长因子受体(anti-EGFR)和抗CD3(anti-CD3)的双特异性抗体(anti-EGFR/CD3),并在体外初步评价其杀伤肿瘤的功能. 方法 通过基因工程技术,利用 knobs-into-holes模式分别构建表达anti-EGFR-HC-knob、anti-EGFR-LC和anti-CD3-scFV-HC-hole的载体,共同转染 Expi 293F细胞,表达双特异性抗体,依次用抗体特异的亲和层析和分子排阻层析进行纯化,再用流式细胞仪和实时无标记细胞功能分析仪评价其体外结合能力和体外肿瘤杀伤功能. 结果 成功获得较高纯度的抗体.流式细胞仪体外结合实验结果显示,双特异性抗体能够同时与EGFR+的U87 Ⅷ脑胶质瘤细胞系、HCT-116结肠癌细胞系和CD3+的Jurkat T 淋巴瘤细胞系结合,具有2种抗体的功能,同时还能很好地激活T细胞(P<0.0001);在体外杀伤效果方面,双特异性抗体作用后杀伤效果明显高于其他抗体和对照组(均为 P<0.0001),具有很好的杀伤效果. 结论 用knobs-into-holes技术获得的anti-EGFR/CD3具有较好的生物活性,为双特异性抗体的肿瘤免疫治疗奠定了一定的基础.     

rIL—2、TNF—α、IFN—γ对抗CD3—抗胶质瘤双特异性抗体的协同细胞毒作用

目的：观察细胞因子rIL-2、TNF－α、IFN－γ对抗CD3－抗胶质瘤双特异性抗体（双抗）的协同作用,进一步提高双抗对人脑胶质瘤的治疗作用。方法：以人脑胶质瘤细胞株SHG－44为靶细胞,健康人或胶质瘤患的外周血单个核细胞（PBMC）为效应细胞,以18h ^3H-TdR掺入释放法测定细胞毒活性,采用单比实验和联合作用等对比分析方法,分析各细胞因子（rIL-2、TNF－α、IFN－γ)对双抗诱导的细胞毒性作用的影响。结果：rIL-2、TNF－α、IFN－γ均可协同提高双抗对人脑胶质瘤的细胞毒作用（P＜0．05）。来源于恶性胶质瘤患的效应细胞活性较正常人低,rIL-2与双抗可协同增强其活性。结论：细胞因子rIL-2、TNF－α、IFN－γ可协同提高双抗对效应细胞的活化,充分激活效应细胞,增强抗肿瘤免疫能力。     

细胞融合法制备抗人CD3-抗人IgM μ链双特异性抗体

目的制备抗人CD3-抗人IgMμ链双特异性抗体(Bispecific antibody,BsAb)的细胞株,并对建株的杂交-杂交瘤的稳定性及活性进行鉴定.方法将抗人CD3单克隆抗体细胞株采用8-AG诱变成HAT敏感杂交瘤细胞株.再通过FuGENETM6转染含neo基因质粒pCDaA3,制备成具有双标记杂交瘤αCD3 HATsG418R亚系,与抗人IgMμ链单克隆抗体细胞株融合.通过ELISA法及流式细胞仪筛选,制备分泌BsAb的细胞株.结果融合6次,共接种1 080孔,共得5株抗CD3-抗IgM杂交-杂交瘤.经亚克隆后,其中2株体外连续传代培养2月仍保持良好的分泌BsAb功能.结论采取细胞融合法可成功制备分泌BsAb的杂交-杂交瘤,其稳定性及效价与亲本杂交瘤相似.     

榄香烯协同抗CD3—抗胶质瘤双特异性抗体免疫治疗胶质瘤作用的研究

目的：研究榄香烯协同抗CD3－抗胶质瘤双特异性抗体免疫治疗胶质瘤的作用。方法：外周血单个核细胞（HuPBL)转输入重度联合免疫缺陷）（SCID）鼠,皮下移植入脑胶质瘤,腹腔注入双特异性抗体,通过测量肿瘤,流式细胞仪分析,原位杂交法,观察潜伏期,肿瘤体积及人淋巴细胞浸润。结果：移植鼠潜伏期,肿殖速度延长,活化的HuPBL大量定位肿瘤组织,结论：榄香烯协同双特异性抗性体生物治疗,有可能成为肿瘤生物治疗新途径。     

细胞融合法制备抗人CD3—抗人IgMμ链双特异性抗体

目的 制备抗入CD3－抗人IgMμ链双特异性抗体（Bispecific antibody,BsAb)的细胞株,并对建株的杂交－杂交瘤的稳定性及活性进行鉴定。方法 将抗入CD3单克隆抗体细胞株采用8－AG诱变成HAT敏感杂交瘤细胞株,再通过FuGENE^TM6转染含neo基因质粒pCDaA3,制备成具有双标记杂交瘤αCD3 HAT^S G418^R亚系,与抗人IgMμ链单克隆抗体细胞株融合,通过ELISA法及流式细胞仪筛选,制备分泌BsAb的细胞株。结果 融合6次,共接种1080孔,共得5株抗CD3－抗IgM杂交－杂交瘤。经亚克隆后,其中2株体外连续传代培养2月仍保持良好的分泌BsAb功能。结论 采取细胞融合法可成功制备分泌BsAb的杂交－杂交瘤,其稳定性及效价与亲本杂交瘤相似。     

抗前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体的构建及表达

目的 构建并表达抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体,观察其生物学活性及临床意义。方法 利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术,构建抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体融合基因,测序正确后,利用EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达,表达产物纯化后,利用流式细胞仪进行生物学活性测定。结果 经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为1．5kb,序列与设计完全一致;SDS-PAGE和Western印迹实验证明：表达产物分泌于细胞培养上清,相对分子质量为6l000;流式细胞仪结果显示：双特异性单链抗体与PBMC和PC-3细胞的阳性结合率分别为54．1％和53．7％。结论 抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性,为进一步的体内实验奠定了基础。     

抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体介导的αβT细胞CDR3谱系漂移

目的探讨抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-1)介导的αβT细胞CDR3谱系漂移,为双特异性抗体介导的T细胞免疫应答机制提供理论基础。方法采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员T细胞在人卵巢癌SKOV3细胞联合BHL-1刺激前后的TCR库多样性变化(CDR3谱型分布特征)及刺激后T细胞TCRα、β链CDR3优势利用情况,对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果刺激前6例正常献血员TCR CDR3谱型均呈高斯分布,刺激后发生CDR3谱系漂移,部分TCR Vα、Vβ家族出现优势增生,明确了BHL-1介导下单克隆增生T细胞的α、β链CDR3序列。结论 SKOV3联合BHL-1诱导的T细胞CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达可能与BHL-1介导的特异性T细胞免疫反应有关,特异应答T细胞TCR CDR3序列的确定,将为卵巢癌的T细胞免疫治疗提供基础。     

抗CD3/CD45双特异抗体激活的效应细胞对白血病细胞的杀伤效应

目的探讨双特异性抗体用于白血病自体干细胞移植体外净化的可能性。方法以抗ＣＤ３／ＣＤ４５双特异性抗体激活外周血单个核细胞,以ＨＬ６０为靶,用ＬＤＨ方法测定杀伤效应。结果靶效比例不同时,抗ＣＤ３／ＣＤ４５激活的效应细胞对ＨＬ６０细胞都表现出杀伤效应。结论抗ＣＤ３／ＣＤ４５可能用于骨髓／造血干细胞移植的体外净化。     

双特异抗体介导的人单核—巨噬细胞对荷人肝癌裸鼠的抑制作用

观察双特异性单克隆抗体介导的人单核－巨噬细胞在裸鼠体内对肝癌生长的抑制作用。用化学交联法制备双特异性单克隆抗体ＨＡｂ１８－ＭＡｂ７及ＨＡｂ１８Ｆ（ａｂ）２－ＭＡｂ７Ｆ（ａｂ＇＿２，并将其与单核－巨噬细胞－同注入荷人肝癌裸鼠体内，观察肿瘤体积的变化。     

Preparation and characterization for bispecific antibodies of anti-CD3 X anti-idiotype to B cell lymphocytic leukemia

Summary Bispecific antibodies (BsAbs) of anti-CD3 X anti-idiotype (Id) to B-cell lymphocytic leukemia (CLL) were prepared by chemical conjugation and direct hybridization technique of hybridoma and hybridoma without screening markers. The specificity of BsAbs from culture supernatants or ascites was assayed by indirect ELISA and indirect immunoflurescence (IF). The results showed that BsAbs could specifically react with homologous serum IgM from patients with B-CLL and cells carrying CD3 marker respectively. Cell combination test and LDH assay demonstrated that BsAb significantly increased the conjugate formation between lymphocyte activated kill (LAK) cells and Daudi cells, and enhanced the cytotoxic activity of LAK cells against Daudi cells. This project was supported by a grant from the National Sciences Foundation of China (No. 39370627).     

双特异性抗体药物在肿瘤治疗领域的研究进展

肿瘤免疫疗法是目前治疗肿瘤的新方向。双特异性抗体可结合两种不同的抗原,因而在肿瘤治疗领域的开发前景十分广阔。双特异性抗体中最引人注目的三功能抗体和双特异性T细胞衔接抗体已分别有药物上市,代表药物是卡妥索单抗和博纳吐单抗。迄今为止,有将近100种抗肿瘤的双特异性抗体药物正在进行临床研究,深入理解它们的作用机制将为肿瘤治疗提供更多可行的方案。本文对卡妥索单抗、博纳吐单抗和目前极具开发前景的双特异性抗体药物的研究进展进行综述,以期为在肿瘤治疗领域的开发与应用奠定基础。     

双氢青蒿素通过下调NICD-1抑制胶质瘤生长

目的 探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinine,DHA)对人神经胶质瘤生长的影响及机制.方法 人胶质瘤U251细胞株传代培养,设置空白对照组、二甲基亚砜(DMSO)组、DAPT组和DHA(10、20、40、80 μmol/L)实验组,应用CCK-8和FCM检测细胞增殖、周期及凋亡,Western blot检测Notch1的胞内区域(NICD-1)及其下游靶蛋白Hes1的表达水平.建立裸鼠皮下胶质瘤模型(n=20),按随机数字表法分为DMSO组、DAPT组、DHA(50、100 mg/kg)治疗组,每组5只,根据时间体积曲线计算各组抑瘤率,免疫组化法检测裸鼠皮下移植瘤组织中NICD-1表达水平变化.结果 与空白对照组和DMSO组相比,实验组U251细胞增殖率显著下降,G1期细胞所占百分比显著上升,S期细胞所占百分比显著下降,早期凋亡率显著上升(P＜0.05),NICD-1及Hes1蛋白表达水平显著低于空白对照组(P＜0.05),均呈浓度依赖关系;DHA各治疗组的裸鼠皮下移植瘤生长速率及移植瘤组织内NICD-1表达显著低于DMSO对照组(P＜0.05).结论 DHA有效抑制人神经胶质瘤的生长,其作用机制可能与通过下调NICD-1表达抑制Notch信号通路有关.     

去甲二氢愈创木酸对恶性胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的作用

探讨去甲二氢愈创木酸对恶性胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的作用,方法采用光镜和电镜观察移植瘤细胞的形态变化,用流式细胞仪进行细胞周期分析;用免疫组化检测肿瘤细胞中ＧＦＡＰ、ＰＣＮＡ的蛋白表达情况。结果（１）ＮＤＧＡ可明显降低裸鼠移植瘤的成瘤率;（２）ＮＤＧＡ能抑制移植瘤细胞的生长和诱导其分化,使细胞增殖受阻于Ｇ１→Ｓ期。结论：ＮＤＧＡ在体内与体外有相同的抗胶质瘤作用。     

鼻咽癌双特异性抗独特型抗体体外抗肿瘤免疫机制初探

目的：比较鼻咽癌双价双特异性抗独特型抗体G22-I50与单价的抗独特型抗体G22,I50在体外抗肿瘤免疫情况,并对其可能的机制作初步探讨。方法：诱导表达G22-I50,G22,I50 3种蛋白并用Western印迹及ELISA方法进行活性鉴定。常规分离人外周血单个核细胞(PBMC),分别用G22-I50,G22,I50抗独特型抗体刺激并培养,采用MTT法、LDH释放法分别观察淋巴细胞增殖情况和细胞毒作用,ELISA法测定各抗独特型抗体刺激后培养上清液中IFN-γ,IL-2,IL-4的水平,流式细胞术检测刺激后淋巴细胞表型的改变。结果：Western印迹分析表明表达的G22-I50,G22,I50蛋白均可与FC2(Ab1)特异性地结合;直接ELISA结果表明复性后的蛋白已恢复活性,可用于体外实验研究。与G22、I50组相比,G22-I50刺激后的PBMC增殖明显,且对鼻咽癌细胞HNE2有特异的杀伤作用。G22-I50刺激后的PBMC培养上清液中IFN-γ,IL-2水平均比G22,I50组有所增加,而对IL-4水平没有明显影响。流式细胞术显示刺激后的PBMC中CD4+,CD8+T细胞比例增加,CD4+/CD8+比率增加,而CD4+CD25+T细胞的比例有所减少,其中以G22-I50组最为明显。结论：G22-I50具有更强的免疫原性并能增强PBMC的特异性杀瘤作用,其机制可能与促进PBMC的增殖,诱导具有抗肿瘤作用的Th1细胞因子的分泌并活化CD8+T细胞,抑制CD4+CD25+T细胞的表达有关。