阿德福韦耐药乙型肝炎病毒毒株生物学特性的研究

目的 体外研究阿德福韦(ADV)耐药相关变异对于HBsAg产生及HBV复制等生物学特性的影响.方法 收集12例在ADV治疗过程中出现病毒学突破的慢性乙型肝炎患者血清,对其HBV反转录(RT)区进行PCR扩增和测序分析.对其中4例患者的HBV进行全基因扩增、测序、序列分析及克隆.将优势株的HBV全基因插入PHY106载体,构建成1.1拷贝HBV基因组表达载体,进而转染Huh7细胞,ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg及HBeAg水平,了解不同ADV耐药相关变异类型对HBsAg分泌的影响.抽提转染细胞内病毒核心颗粒HBV DNA,实时荧光定量PCR方法 检测HBV DNA水平.将rtA181T/sW172*变异株与rtA181非变异株质粒按不同比例混合,共转染Huh7细胞,检测上清液中HBsAg及细胞内病毒核心颗粒HBV DNA水平.结果在12例出现病毒学突破的患者中,10例出现ADV耐药相关位点变异,以rtA181变异为主,其中5例有rtA181T变异,4例为rtA181T/S+rtN236T变异.将含rtA181T/sW172*变异的质粒转染细胞后,上清液中不能检测到HBsAg,而含其他变异类型的质粒转染细胞后,上清液中HBsAg和细胞内病毒核心颗粒HBV DNA水平与非变异株相似;含不同变异的HBV临床分离株转染后的细胞内核心病毒颗粒HBV DNA水平未见明显差异.将rtA181T/sw172*变异株及rtA181非变异株的质粒共转染后.随着rtA181非变异株比例的增加,上清液中HBsAg水平也逐渐增高,但细胞内核心病毒颗粒HBV DNA水平无明显差异.结论 rtA181变异是ADV耐药相关性变异的主要类型,rtA181T变异较多见.rtA181T/sW172*变异株可引起HBsAg分泌障碍,但rtA181非变异株可纠正rtA181T/sW172*变异株的HBsAg分泌障碍.不同类型的ADV耐药相关变异对HBV的复制能力无显著影响.     

ADV初治耐药与LAM耐药者再耐药时HBV-RT区的变异特征

目的:研究阿德福韦酯(adefovir,ADV)初治耐药和ADV用于挽救治疗拉米夫定(lamivudine,LAM)耐药者再耐药时HBV毒株RT区变异特征的差异性.方法:我院就诊的ADV初治耐药者73例,ADV用于挽救治疗LAM耐药者后再耐药者34例,共计107例,在HBVDNA突破时采用PCR方法扩增HBV-RT区基因,对PCR产物直接测序,用Chromas2.0软件分析HBV-RT区基因的核苷酸和氨基酸差异、变异模式,同时使用Clustalx1.81.msw进行基因型分析.结果:在107例患者中,存在rtA181V变异36例,rtA181T变异43例,rtN236T变异47例,rtM204I/V±rtL180M变异20例,其他相关变异如rtA181S/C、rtH/N238S/T/R/A/K、rtV214I/A、rtQ215H共12例.ADV初治组检测到rtA181V/T变异27例(36.99%)、rtN236T变异14例(19.18%)、rtA181V/T+rtN236T变异28例(38.36%),rtA181T/V和rtN236T以外的变异4例(5.48%).其中发生rtA181V和rtA181T变异患者分别有33.3%、64.5%合并rtN236T变异(P=0.0091);ADV挽救治疗LAM耐药者再耐药,检测到rtA181V/T变异21例(61.76%)、rtN236T变异2例(5.88%)、rtA181V/T+rtN236T变异3例(8.82%),rtA181T/V和rtN236T以外的变异8例(23.53%).其中发生rtA181V患者25%合并rtN236T变异,而rtA181T变异患者未检测到rtN236T变异(P=0.2311).20例(58.83%)患者合并rtM204I/V变异,这20例患者中12例(35.29%)合并rtA181V/T和/或rtN236T变异的多重耐药变异.有12例未检测到rtA181T/V和rtN236T变异,但检查到rtA181S/C(2例)、rtV214I/A(3例)、rtQ215H(1例)、rtH/N238S/T/R/A/K(6例)等ADV耐药相关变异,其中ADV挽救治疗LAM耐药患者8例,ADV初治患者4例,两组间存在统计学差异(P=0.0169).结论:ADV初治耐药主要发生rtA181V/T和rtN236T变异,ADV挽救治疗LAM耐药再耐药主要发生rtA181V/T变异,且后者耐药模式更复杂.     

阿德福韦治疗拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者的耐药率及耐药株进化情况

目的观察阿德福韦单药长期治疗拉米夫定耐药CHB患者的耐药率,以及阿德福韦耐药相关性HBV变异及耐药株的动态变化。方法23例发生YMDD变异的CHB患者停用拉米夫定,口服阿德福韦10mg,1次/d,治疗68～116周,从患者基线和阿德福韦单药治疗后不同时间点的血清中抽提HBV DNA,采用直接PCR产物测序法进行耐药变异分析;对其中1例发生阿德福韦耐药患者的一系列血清进行基因克隆分析其HBV耐药株的进化情况。结果阿德福韦单药治疗48周的耐药率为4.3%;96周的耐药率为10.5%。HBV耐药株进化分析结果显示:阿德福韦单药治疗后,YMDD变异株比例逐渐下降而rtA181S变异株出现并逐渐增多,随着治疗时间的延长,又出现了rtA181S N236T联合变异株。阿德福韦变异株(rtA181S和rtA181S N236T联合变异株)对继起的阿德福韦联合拉米夫定治疗病毒学应答较差,并出现了1例阿德福韦与拉米夫定多药耐药联合变异株(rtM204I rtN236T)。结论拉米夫定耐药的CHB患者,换用阿德福韦单药长期治疗后,耐药率逐渐增加并可选择出多药耐药联合变异株。     

HBV反转录酶区rtA181S变异与阿德福韦酯耐药相关性研究

目的：分析HBV反转录酶（RT）区rtA181S变异与阿德福韦酯（ADV）耐药的相关性。方法应用直接测序法筛选分析大样本慢性HBV感染者rtA181S变异的检出频率,并对1例接受ADV单药治疗失败的慢性乙型肝炎患者血清中HBV RT区基因进行克隆测序,分析相关变异形式。用XhoⅠ和SphⅠ双酶切pGEM-Teasy RT及pTriEx-HBV（C）载体后再连接,构建1.1倍HBV野生株和耐药株的重组质粒,转染人肝癌细胞系HepG2细胞,5 h后分别加入不同浓度的 ADV（0、0.033、0.100、0.330、1.000、3.300μmol/L）。隔天换药,4 d后收集细胞上清,采用实时荧光定量PCR法检测不同药物浓度作用下细胞培养上清中的HBV DNA载量,并分析其表型耐药特点。结果9830例慢性HBV感染者的12000个血清样本中,有46例样本检出rtA181S变异（单独或与其他耐药变异联合出现）,在653例中检出经典的rtN236T/A181V变异。其中随访的1例在接受ADV治疗19个月后出现了病毒学和生化学突破,直接测序检出rtA181S＋N236T变异,克隆测序分析显示在24个克隆中11个（45.83%）为野生型,6个（25.00%）为rtN236T变异型,5个（20.83%）为rtA181S变异型,1个（4.16%）为rtA181V变异型,1个（4.16%）为rtA181S＋N236T变异型。在体外实验中,rtN236T、rtA181S和rtA181S＋N236T变异株的相对复制力分别是野生株的91.35%、29.90%和68.53%。表型耐药分析显示rtN236T、rtA181S和rtA181S＋N236T变异株对ADV的灵敏性分别为野生株的1/4.41、1/3.05和1/5.43。结论 rtA181S是一种ADV耐药相关变异,可单独或联合其他变异引起患者耐药。但与经典ADV耐药变异相比,rtA181S变异引起的ADV耐药相对较弱,临床检出率较低。     

HBV PRt204+180以外位点变异与拉米夫定耐药关系探讨

目的 探讨慢性乙型肝炎患者HBV P区常见耐药位点Rt204±180以外位点变异与拉米夫定耐药关系.方法 收集27例接受拉米夫定初治患者治疗基线和获得病毒学应答后出现病毒学反弹的血清标本,采用PCR产物直接测序技术,检测治疗基线和病毒学反弹时HBV DNA的P区变异位点,对位点变异与拉米夫定耐药关系进行分析.结果 HBV P区的rtA181V、rtM171R、rtN/H238T/A和rtI187V变异不伴随有P区rtM204V/1±rtL180M耐药位点的变异.结论 HBV P区的rtA181V、rtM171R、rtN/H238T/A和rtI187V变异可能是拉米夫定耐药的新变异位点.     

拉米夫定与恩替卡韦序贯治疗中的乙型肝炎病毒准种动力学

目的 研究HBV准种群体在拉米夫定(LAM)与恩替卡韦(ETV)序贯治疗过程中的动态演变及其临床意义. 方法 对2例采用LAM-ETV序贯治疗出现不同临床结果的患者进行了近4年的随访,用多聚酶链反应-克隆-测序的方法研究HBV准种组成的长程动态演变,用最大似然法建立遗传进化树分析代表序列的遗传进化关系,结合血清学和病毒学指标分析HBV准种演变与临床过程的关系. 结果 2例患者均出现了LAM耐药病毒学突破,采用ETV治疗后,1例患者获得了持续病毒学应答,另一例患者在ETV治疗72周时又出现病毒学突破.病毒学突破均发生在原有对药物敏感的优势准种被耐药株替代时,ETV耐药与rtL180M+S202G+M204V三联突变株成为优势准种密切相关,准种动力学和遗传进化分析结果提示LAM治疗筛选出的rtL180M合并M204V联合突变株在HBV种群中的累积与此三联突变株的出现有直接关系.结论 HBV准种组成与核苷类药物敏感性密切相关,LAM耐药株可进一步演化为ETV耐药株,对使用核苷类药物治疗的患者进行HBV准种监测具有重要临床意义.     

拉米夫定与恩替卡韦序贯治疗中的乙型肝炎病毒准种动力学

目的 研究HBV准种群体在拉米夫定(LAM)与恩替卡韦(ETV)序贯治疗过程中的动态演变及其临床意义. 方法 对2例采用LAM-ETV序贯治疗出现不同临床结果的患者进行了近4年的随访,用多聚酶链反应-克隆-测序的方法研究HBV准种组成的长程动态演变,用最大似然法建立遗传进化树分析代表序列的遗传进化关系,结合血清学和病毒学指标分析HBV准种演变与临床过程的关系. 结果 2例患者均出现了LAM耐药病毒学突破,采用ETV治疗后,1例患者获得了持续病毒学应答,另一例患者在ETV治疗72周时又出现病毒学突破.病毒学突破均发生在原有对药物敏感的优势准种被耐药株替代时,ETV耐药与rtL180M+S202G+M204V三联突变株成为优势准种密切相关,准种动力学和遗传进化分析结果提示LAM治疗筛选出的rtL180M合并M204V联合突变株在HBV种群中的累积与此三联突变株的出现有直接关系.结论 HBV准种组成与核苷类药物敏感性密切相关,LAM耐药株可进一步演化为ETV耐药株,对使用核苷类药物治疗的患者进行HBV准种监测具有重要临床意义.     

拉米夫定与恩替卡韦序贯治疗中的乙型肝炎病毒准种动力学

目的 研究HBV准种群体在拉米夫定(LAM)与恩替卡韦(ETV)序贯治疗过程中的动态演变及其临床意义. 方法 对2例采用LAM-ETV序贯治疗出现不同临床结果的患者进行了近4年的随访,用多聚酶链反应-克隆-测序的方法研究HBV准种组成的长程动态演变,用最大似然法建立遗传进化树分析代表序列的遗传进化关系,结合血清学和病毒学指标分析HBV准种演变与临床过程的关系. 结果 2例患者均出现了LAM耐药病毒学突破,采用ETV治疗后,1例患者获得了持续病毒学应答,另一例患者在ETV治疗72周时又出现病毒学突破.病毒学突破均发生在原有对药物敏感的优势准种被耐药株替代时,ETV耐药与rtL180M+S202G+M204V三联突变株成为优势准种密切相关,准种动力学和遗传进化分析结果提示LAM治疗筛选出的rtL180M合并M204V联合突变株在HBV种群中的累积与此三联突变株的出现有直接关系.结论 HBV准种组成与核苷类药物敏感性密切相关,LAM耐药株可进一步演化为ETV耐药株,对使用核苷类药物治疗的患者进行HBV准种监测具有重要临床意义.     

对阿德福韦酯自然变异耐药与抗病毒后耐药的慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因序列比较

目的 通过对慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶RT区序列分析,观察对阿德福韦酯(ADV)自然变异耐药及继发耐药的异同.方法 PCR产物直接测序法检测78例对ADV耐药患者外周血HBV RT区基因序列.其中曾用ADV治疗患者30例(治疗组),未抗病毒治疗48例(未治疗组),并对两组ADV相关耐药变异位点发生频数进行比较.结果 未治疗组ADV耐药的主要变异类型为rtAl81V/T 10例(20.8％),rtN/H238T/D/S 10例(20.8％)和rtV214A变异13例(27.1％);而治疗组发生的ADV耐药变异主要为rtA181V/T 16例(53.3％),没有发现rtN/H238T/D/S变异,仅发现l例rtV214A变异.结论 CHB患者中存在相当严重的ADV自然变异耐药变异,主要变异类型为rtN/H238T/D/S及rtV214A,而抗病毒治疗后该变异位点发生频数反而相对减少.rtAl81V/T变异既可以为自然变异也可以由ADV抗病毒治疗而诱发.     

拉米夫定和阿德福韦酯双重耐药HBV株临床检出特点与表型特性分析

目的分析拉米夫定(lamivudine,LAM)和阿德福韦酯(adefovir,ADV)双重耐药HBV株临床检出特点和表型特性,为临床优化抗病毒方案提供参考。方法回顾性分析26 553例慢性HBV感染者血清样本中HBV反转录酶区与LAM和ADV耐药相关的突变类型及频率,采用PCR产物直接测序法和克隆测序法(≥20个克隆/样本)对双重耐药HBV株进行鉴定,采用表型耐药方法分析强效核苷(酸)类似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]对双重耐药HBV的抑制效果。结果 26 553例慢性HBV感染者的血清样本中,LAM/ADV双重耐药HBV突变株的检出率为0.6%(147/26 553),主要突变类型为rt L180M+A181V+M204V(65.3%)和rt A181V+M204I(10.2%)。多数患者经历了LAM→ADV(40.8%)或LAM→ADV→ETV(38.8%)单药序贯/联合治疗,平均抗病毒时间为63个月。其中2例代表性LAM和ADV双重耐药患者的动态血清样本克隆结果显示,在恩替卡韦(entecavir,ETV)+ADV联合挽救治疗期间,随着获得完全病毒学应答后维持时间的延长,病毒准种池中LAM/ADV双重耐药株逐渐消失,病毒株以单一NAs耐药株或野生株为主。体外表型结果显示,各种双重耐药HBV突变株的体外复制力均低于野生株,ETV+ADV联合、替诺福韦酯(tenofovir,TDF)单独或TDF+ETV联合可有效抑制野生株复制(抑制率为98.5%~99.5%),而对各种LAM/ADV双重耐药突变株的抑制率分别为80.6%~92.5%、86.1%~97.9%和89.2%~97.5%。结论长期LAM和ADV单一序贯治疗可促进LAM/ADV双重耐药HBV发生,ETV+ADV联合、TDF单独或TDF+ETV联合均可有效抑制LAM/ADV双重耐药HBV复制,而基于TDF的挽救治疗效果更佳。