兔骨髓基质细胞培养及其体外成骨能力

目的观察兔骨髓基质细胞在体外的培养条件及其成骨过程，为研制骨组织工程材料选择种子细胞奠定一定实验基础。方法取兔长管骨骨髓为材料进行体外培养，传代后改用条件培养基进行培养，通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色等方法进行检测。结果传代细胞培养3、4d后融合成单层，培养12d细胞形成多层结构，并聚集成多个散在的黑色结节，细胞富含碱性磷酸酶活性，Ⅰ型胶原染色阳性，这与典型成骨细胞的生物学特性相似。结论体外培养的兔骨髓基质细胞具有成骨能力，可作为骨组织工程学研究的种子细胞。     

大鼠脂肪基质干细胞的体外培养及其成骨细胞分化特性的研究

目的研究脂肪基质干细胞（ADSCs）分离培养的方法,探讨大鼠ADSCs在体外向成骨细胞分化的能力。方法从成年SD大鼠腹股沟处获取脂肪组织后进行体外培养,并通过骨诱导培养基使其分化成成骨细胞,通过碱性磷酸酶（ALP）v、on Kossa染色鉴定向成骨细胞分化能力。采取逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测成骨细胞的标志基因。结果大鼠脂肪组织能够分离培养出ADSCs;向成骨细胞诱导,ALP、von Kossa染色阳性,RT-PCR检测有ALP、osteocalcin及osteopontin表达。结论成功从大鼠脂肪组织分离培养出ADSCs,其生物学特性与骨髓基质干细胞（MSCs）相似,能够向成骨细胞分化,有希望成为组织工程理想的种子细胞来源。     

人骨髓基质细胞的分离、培养及成骨鉴定

目的建立一种体外分离培养人骨髓基质细胞 (HumanBoneMarrowStromalCells ,hBMSCs)的方法。方法 :从髂棘 (髂前或髂后 )抽取骨髓液 5～ 8ml,经密度离心后的骨髓单核细胞 ,以 10 6/ml浓度接种培养 ,贴壁细胞接近长满后 ,进行传代培养 ,每传一代约 5～ 7d。培养期间进行碱性磷酸酶的检测和钙染色。结果 :原代培养和传代培养的细胞均为贴壁、形态不一的细胞。两种细胞在体外可向成骨方向转化。结论 :人骨髓基质细胞在体外长期培养后仍具有成骨能力 ,为骨髓中间充质干细胞 ,掌握其培养方法为其广泛应用奠定基础。     

兔脂肪干细胞分离培养及成脂成骨分化潜能的研究

目的 分离培养兔脂肪干细胞,并在特定条件下诱导分化,观察其成脂成骨潜能.方法 无菌切取新西兰大白兔腹股沟脂肪垫,I型胶原酶消化,分离培养原代细胞,传代后,取第3代细胞接种培养于6孔板,分别在成脂和成骨培养液中诱导分化,采用油红O染色、钙钴法碱性磷酸酶染色和Alizarin red s染色鉴定分化结果.结果 分离培养获得的细胞具有很强的增殖能力;成脂诱导的细胞油红O染色阳性,成骨诱导的细胞钙钴法碱性磷酸酶染色和Alizarin red S染色阳性.结论 本实验分离培养的细胞为脂肪干细胞,具有成脂和成骨潜能,可作为骨组织工程种子细胞.     

人脂肪源性基质细胞体外培养的实验研究

目的:探索人脂肪源性基质细胞(hADSCs)原代培养方法.方法:取成人脂肪,采用原代消化细胞培养法培养,对培养细胞进行形态学研究,测定生长曲线,对第2代细胞进行免疫细胞化学染色,鉴定其表面分子CD44.结果:成人脂肪组织中含有大量间充质干细胞,约70%～80%的细胞表达CD44.结论:建立了一种人体脂肪组织分离、培养hADSCs的简便方法.     

骨髓基质细胞及诱导成骨的研究进展

骨髓基质细胞（BMSCs）具有多分化潜能，近年来，组织工程中选择种子细胞的研究方兴未艾，由于BMSCs取材方便容易，扩增方法可靠，应用范围广泛及成骨确定且避免了免疫排斥问题，已成为最有前途的骨组织工程种子细胞。     

原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的:检测原代人脂肪基质细胞(human adipose-derived stromal sells,hASCs)的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法:酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶(al-kaline phosphatase,ALP)染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs+支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果:300 mL脂肪组织中可以获得约6×107个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论:原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。     

成人骨髓基质细胞体外培养及鉴定

目的 :探讨简易的成人成骨细胞体外培养方法 ,为进一步研究成骨细胞及骨组织工程提供技术平台。方法:手术中抽取健康成人骨髓组织 ,采用全骨髓培养法在体外进行培养 ,细胞汇合后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素 C的条件培养基进行传代培养 ,观察细胞增殖和分化情况 ,并对细胞进行鉴定。结果:培养的成人成骨细胞表现出成骨细胞的形态特征 ,细胞碱性磷酸酶 (AL P)阳性率为 6 8% ,经 Von Kossa's染色证实其能最终形成钙结节。结论:全骨髓培养法所培养的细胞具有成骨细胞的特性 ,可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。     

原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的：检测原代人脂肪基质细胞（human adipose-derived stromal sells,hASCs）的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法：酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs + 支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果：300 mL脂肪组织中可以获得约6×10⁷个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论：原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。     

兔骨髓基质干细胞的分离培养及鉴定

目的探讨兔骨髓基质干细胞（MSC）体外分离培养及鉴定。方法自兔髂骨抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离纯化出MSC,并增殖。观察MSC的生长情况及形态学特点,流式细胞仪检测第3代MSC表面抗原的表达情况。结果体外培养的兔MSC贴壁生长,呈长梭形,可增殖形成克隆;MSC阳性表达CD29,CD90,但CD34,CD45呈阴性。结论利用密度梯度离心法获取的MSC具有大量增殖的能力,表达CD29,CD90,不表达CD34,CD45。     

人胚胎骨髓基质干细胞的长期培养及体外成骨特性

研究了人胚胎骨髓基质干细胞(hBMSCs)在体外长期培养时的基本特性和向成骨细胞的分化能力。结果表明：前三代hBMSCs多数呈长梭形,生长快速,增殖能力强;而后几代细胞变得比较扁平,生长缓慢,增殖能力下降;至第六代,细胞已失去增殖能力。每一代细胞生长均分为延滞期、对数生长期和稳定期,延滞期一般为6～7d,对数生长期为4～5d,最后是稳定期。前三代细胞对数生长期的群体倍增时间(PD71)基本相同,而第四代细胞的PDT略有上升,第五代细胞的PDT最大。在体外扩增能力方面,前三代细胞均可以扩增18倍左右,而第四、第五代细胞则下降至11倍、5倍。实验结果表明扩增后的细胞经过诱导可以形成钙化小结,与未诱导细胞相比碱性磷酸脂酶(ALP)活性显著提高。     

脂肪来源干细胞体外成骨和成脂及成神经的诱导分化研究

目的 探讨脂肪组织来源干细胞 (adipose stem cell,ADSC) 的表面表型及向成骨、成脂和成神经多向分化的生物学特性.方法 取SD大鼠的腹股沟、附睾垫和腹膜后脂肪,Ⅰ型胶原酶消化、分离培养ADSC,检测第3代ADSC的CD29、CD44和CD45的表达情况.将ADSC加入成骨诱导剂,通过茜素红S染色鉴定成骨细胞;成脂诱导剂利用油红O染色鉴定脂肪细胞;神经干培养基诱导,免疫荧光染色鉴定诱导的神经元.结果 ADSC表达CD29(99.07±0.12)%、CD44(95.82±0.68)%和CD45(0.11±0.12)%.其经成骨诱导4周,茜素红S染色显示聚集的细胞团中央形成红色钙化结节,碱性磷酸酶染色可见到细胞的胞质内有紫红色颗粒;成脂诱导1周,油红O染色可见细胞质内有橙红色脂滴;经过神经干培养基诱导6 d后,免疫荧光染色显示诱导的细胞Nestin、NF-200及GFAP阳性表达.结论 ADSC表达间质干细胞的表面表型,体外经诱导培养后可向成骨细胞、脂肪细胞和神经元多向分化,表明 ADSC具有干细胞的多向分化潜能.     

大鼠脂肪组织源性间充质干细胞的分离及向心肌细胞的诱导分化

目的：探讨脂肪组织源性间充质干细胞体外分离培养的方法并将其向心肌细胞方向诱导分化。方法：无菌条件下获取2月龄SD大鼠腹部肠系膜脂肪组织，0．08％胰酶消化分离出单个核细胞，接种7～10d后形成单层贴壁长梭形细胞。0．25％胰酶消化传代，第3代细胞用于鉴定细胞表面分子及诱导分化。浓度为10μmol／L5-氮胞苷与分离细胞共同培养24h，3周后应用抗desmin及抗α-actnin抗体对诱导细胞进行免疫化学鉴定。结果：所分离细胞约90％表达间充质干细胞表面抗原CD13、CD44。5-氮胞苷诱导后3周，所培养的细胞形成desmin及α-actnin染色阳性的心肌细胞团。结论：体外通过消化法可从脂肪组织中分离出大量间充质干细胞，这些细胞经5-氮胞苷诱导后分化为心肌细胞。     

兔MSCs-PGA复合物在RCCS中的成骨潜能

目的：探讨联合应用兔骨髓基质干细胞（MSCs）、聚乙醇酸（PGA）支架材料和成骨诱导因子在旋转式细胞培养系统（RCCS）中构建组织工程化骨的可行性。方法：利用密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞，采用动力接种方法形成骨髓基质干细胞-PGA支架复合物，以成骨条件培养液为生长介质，在RCCS中进行培养。用趋骨性荧光素四环素标记、茜素红染色以及扫描电镜、透射电镜观察，研究细胞-PGA支架在RCCS中的成骨潜能。结果：组织化学研究显示，兔骨髓基质干细胞-PGA支架结构中RCCS中培养第7d时，茜素红钙质染色呈弱阳性反应，至第21d及28d时，茜素红钙质染色呈强阳性反应。荧光显微锏上，培养组织趋骨性荧光素四环素标记呈现金黄色荧光，荧光亮度与分泌物堆积程度成正相关，与钙质染色阳性反应结果一致。超微结构观察，见骨髓基质干细胞合成分泌胶原纤维，释放基质小泡，并出现钙盐沉积，形成丛毛球状钙球，最终形成骨组织。结论：在旋转式细胞培养系统中，骨髓基质干细胞-PGA支架结构具有形成类似活体骨组织特征的组织工程化骨的潜能。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。     

人脐带血间充质干细胞的体外培养及影响因素

目的:建立人脐带血的间充质干细胞(MSCs)体外培养、扩增的方法。方法:无菌条件下取正常足月的脐带血,分离单个核细胞,以含5%胎牛血清的低糖DMEM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞,测定MSCs的生长曲线,用流式细胞技术分析细胞的表面抗原。结果:脐血中的单个核细胞在适当的条件下分离、培养,获得的MSCs均一稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD105,但不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR。结论:脐带血中含有的MSCs可在体外培养、扩增,能够作为间充质干细胞的一种有效来源。     

人脐带间充质干细胞体外分离、培养、扩增方法及生物学特性研究

目的 建立从足月脐带分离间充质干细胞和体外传代培养技术,并对其生物学特性进行研究.方法 采用双酶法分离脐带间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养,绘制生长曲线;用流式细胞仪检测脐带表面抗原及细胞周期;采用软琼脂克隆实验以观察脐带致瘤性.结果 成功建立了脐带间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD44、CD13和CD29,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31,不表达CD106、CD166和HLA-DR;细胞倍增时间为30h,细胞周期分析表明,G0～G1期和S G2 M期所占比例分别为78.84%和11.16%,脐带间充质干细胞在软琼脂中无克隆形成.结论 双酶法是一种较好的分离和培养方法间充质干细胞的方法,培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性,无致瘤性,为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据.     

骨髓基质细胞体外成骨能力的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞(BMSc)的体外成骨能力，为骨组织工程研究提供细胞来源。方法 采用密度梯度离心法将兔BMSc自小量骨髓中分离培养，并观察第2代BMSc在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠诱导条件下的生长及成骨分化情况。结果 BMSc呈成纤维细胞样表现，增殖能力强，在诱导条件下碱性酸酶活性明显增高，并出现矿化结节。结论 BMSc体外增殖能力强，成骨能力肯定。地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠可促进BMSc向成骨细胞分化。