血管内皮细胞和RPE细胞对光敏剂Verteporfin的吸收比较

目的比较体外视网膜色素上皮(RPE)细胞和血管内皮细胞对光敏剂Verteporfin吸收的异同。方法将体外培养的RPE细胞和血管内皮细胞与20μg/ml的Verteporfin共同孵育,根据孵育时间不同,各分成0、5、15、30、60、120min6个组,用50%的甲醇萃取进入细胞内的Verteporfin,荧光分光光度计分别测量各组细胞内Verteporfin的含量。结果6个组的每106个细胞内Verteporfin含量,RPE细胞分别为(单位μg)0、0.1±0.01、0.26±0.01、0.42±0.02、0.52±0.02、0.53±0.03;血管内皮细胞分别为0、0.12±0.01、0.31±0.02、0.46±0.01、0.55±0.03、0.58±0.02;各时间组每种细胞内的Verteporfin,经方差分析差异均有统计学意义(P<0.05)。在相同时间组的两种细胞Verteporfin吸收量经t检验差异均无统计学意义(P>0.05)。结论RPE细胞和血管内皮细胞对Verteporfin有相似的吸收功能。     

I型单纯疱疹病毒感染对人角膜上皮细胞基质金属蛋白酶-2和黏着斑激酶表达的影响

背景研究表明,I型单纯疱疹病毒（HSV-1）感染可导致角膜上皮细胞（CECs）基质金属蛋白酶（MMPs）表达、分泌和活性改变。黏着斑激酶（FAK）对MMPs的表达、释放和激活起着重要的调节作用。人角膜上皮感染HSV-1后FAK的表达变化鲜有报道。目的探讨HSV-1感染对体外培养的人CECsMMP-2和FAK表达的影响。方法以HSV-1（F株）感染体外培养的人CECs,应用逆转录PCR（RT—PCR）、免疫印迹法、免疫组织化学法分别于感染后2、20、40h检测人CECsMMP-2、FAK及磷酸化黏着斑激酶（p-FAK）的表达情况。结果RT．PCR法检测结果显示,感染细胞的MMP-2mRNA、FAKmRNA较非感染细胞（即加入无病毒无血清培养液的阴性对照组）的表达明显增强,不同时间点间比较差异无统计学意义,组别与时间点间不存在交互作用（MMP-2mRNA：F目目=0．968,P=0．436;F蚴I=47．649,P=0．000;F女Ⅱ#目=0．757,P=0．536．FAKmRNA：F时间=0．658,P=0．631;F组别=35．182,P=0．000;F交互作用=1．386,P=0．137）。Westernblot法检测结果显示,感染后2h时p-FAK、FAK、MMP-2在感染细胞与非感染细胞间差异均无统计学意义（P’0．05）,感染后20h、40h感染细胞的蛋白表达较非感染细胞均明显增强（P〈0．05）。免疫组织化学染色检测结果显示,随着感染时间的延长,MMP-2、FAK、p-FAK蛋白染色阳性细胞数目增多。结论在HSV-1感染早期,FAK的激活可刺激MMPs活性增强,从而加速角膜溃疡及坏死性病变的形成。     

缺氧对视网膜色素上皮细胞基质细胞衍生因子-1和整合素连接激酶表达的影响

背景 缺氧是诱导新生血管形成的主要因素,近年来越来越多的研究证实基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和整合素连接激酶(ILK)在新生血管性疾病中发挥着重要作用,而缺氧对视网膜色素上皮(RPE)细胞SDF-1和ILK表达的影响尚未阐明. 目的 探讨缺氧对体外培养RPE细胞中SDF-1和ILK表达的影响.方法 从4周龄SPF级健康C57BL/6小鼠眼球中获取RPE组织并进行消化和培养,将达到80％融合的细胞进行传代.取第3代细胞制作细胞爬片后用细胞角蛋白18(CK18)抗体进行免疫组织化学检测和鉴定,以5×104个/ml密度将RPE细胞接种于含胎牛血清的DMEM/F12培养液的培养瓶中,无血清饥饿培养24 h后常氧组在常规培养基中进行培养,缺氧组在CoCl2浓度为200 μmol/L的含胎牛血清的DMEM/F12培养液中进行培养,2个组根据培养时间的不同再亚分为1、3、6、12、24、48、72h组.采用逆转录PCR(RT-PCR)检测RPE细胞中SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达,采用Western blot检测RPE细胞中SDF-1蛋白和ILK蛋白的表达,均以目的基因A值/β-actin A值表示.结果 培养的RPE细胞呈不规则多边形,细胞质内布满黑色素颗粒,90％以上的细胞对CK18呈阳性反应.随着CoCl2培养时间的延长,SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达量逐渐增加,总体比较差异均有统计学意义(SDF-1 mRNA:F=281.875,P=0.000;ILK mRNA:F=187.566,P=0.000),12h达高峰,之后略有降低,但仍高于常氧组,缺氧1h组SDF-1 mRNA及蛋白表达无明显变化;缺氧培养3、6、12、24、48、72 h组SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达量均明显高于常氧培养组,差异均有统计学意义(P＜0.01).随着CoCl2培养时间的延长,SDF-1蛋白和ILK蛋白的表达量逐渐增加,差异均有统计学意义(SDF-1:F=44.719,P=0.000; ILK:F=144.481,P=0.000).缺氧1h组SDF-1及ILK蛋白表达无明显变化;缺氧3、6、12、24、48、72 h组SDF-1蛋白、ILK蛋白表达明显升高,与常氧组比较差异均有统计学意义(P＜0.01). 结论 SDF-1和ILK参与了RPE细胞的缺氧反应,并且在缺血缺氧性视网膜病变的发生发展过程中可能发挥一定的作用.     

HSP90抑制剂对缺氧诱导的RPE细胞SDF-1表达的影响

目的 研究热休克蛋白(heat shock protein 90,HSP90)抑制剂17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG)对缺氧诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)表达的影响.方法 将培养的第3代RPE细胞分为缺氧对照组、DMSO对照组和17-AAG预处理组.其中17-AAG预处理组根据浓度不同又分为6组:0.01 μmol·L-1、0.10 μmol·L-1、0.50 μmol·L-1、1.0 μmol·L-1、5.0 μmol·L-1、10.0μmol·L-1.利用氯化钴建立体外RPE细胞的化学缺氧模型,不同浓度的HSP90抑制剂17-AAG预处理RPE细胞1 h后给予12 h缺氧处理,RT-PCR和Western blotting方法检测SDF-1表达变化情况.结果 缺氧对照组、DMSO对照组和不同浓度17-AAG预处理组SDF-1 mRNA与内参B-actin mRNA光密度比值分别为0.89±0.04、0.93±0.07、0.62±0.06、0.52±0.06、0.43±0.06、0.28±0.04、0.21±0.04、0.17±0.03;SDF-1蛋白与内参B-actin蛋白光密度比值分别为0.76±0.04、0.80±0.06、0.65±0.04、0.34±0.03、0.20±0.02、0.16±0.02、0.07±0.02、0.05±0.01.与缺氧对照组比较,DMSO对照组SDF-1 mRNA和蛋白的表达无明显变化,而不同浓度17-AAG预处理组SDF-1 mRNA和蛋白的表达明显降低(p均<0.05),呈浓度依赖性.结论 HSP90的特异抑制剂17-AAG能有效抑制缺氧条件下RPE细胞SDF-1表达.     

缺氧条件下共培养时观察Mtiller细胞对RPE细胞生长的影响

背景视网膜色素上皮（RPE）细胞和Mtiller细胞在维持视网膜的正常代谢中起重要作用,多种生理、病理过程与二者的相互作用有关。目的利用Transwell小室体外共培养兔Mtiller细胞与RPE细胞,观察缺氧条件下Moller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响。方法应用组织块培养法和酶消化法分别培养原代兔Mtiller细胞和RPE细胞,免疫组织化学法鉴定2种细胞。取第3代培养良好的细胞进行试验。应用CoCl2培养细胞以建立细胞化学缺氧模型,分为常氧组和缺氧组,每组又分为对照组（RPE细胞单独培养）、共培养组（MOiler细胞与RPE细胞共同培养）。利用Transwell小室建立Mtiller细胞和RPE细胞的共培养模型,各组分别培养3、6、24、48h,利用MTT法和结晶紫染色法对培养存活的RPE细胞进行计数,检测常氧及缺氧条件下Miiller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响。结果原代培养的RPE细胞符合RPE细胞的特征,90％以上呈现CK．18阳性反应。培养的Miiller细胞对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100染色呈阳性反应。与常氧培养条件比较,缺氧条件下单独培养的RPE细胞增生数量增加,细胞迁移数量增加,差异有统计学意义（P〈0．01）;缺氧条件下与MUller细胞共培养的RPE细胞增生数量和迁移数量明显增加,与常氧组和单细胞培养情况下比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。缺氧条件下,与RPE细胞单细胞培养组比较,共培养组RPE细胞的增生和迁移增加,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论缺氧可以促进RPE细胞的增生和迁移,Mtiller细胞可以加重缺氧引起的RPE细胞的增生和迁移。     

细胞外基质相关分子在眼底新生血管形成中的作用

眼底新生血管形成是导致增生型糖尿病视网膜病变(PDR)、早产儿视网膜病变(ROP)及年龄相关性黄斑变性( AMD)患者视力丧失的主要原因之一.细胞外基质(ECM)固有成分中的胶原蛋白、弹性蛋白等经酶解后在体外研究及动物实验中已证实可促进脉络膜新生血管(CNV)、视网膜新生血管形成的发生.ECM黏附分子中的整合素α5β1与纤连蛋白在体外可促进内皮细胞黏附、增生,其抑制剂于体内则可抑制CNV、视网膜新生血管的发生,整合素αV β3及αV β5的抑制剂在体内也可发挥类似作用.黏附分子中的选择素及细胞间黏附分子则主要通过介导白细胞与内皮细胞间的相互作用促进新生血管形成.ECM降解相关的丝氨酸蛋白酶,尤其是尿激酶型纤溶酶原激活剂( uPA)(通过促进纤溶酶的生成)、基质金属蛋白酶(MMPs)(主要是MMP-2及MMP-9),在体外及体内实验中已证明可促进CNV、视网膜新生血管的发生,而I型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)及组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)则可抑制新生血管形成.对ECM相关分子在CNV、视网膜新生血管形成中作用的深入研究将为预防和治疗眼底新生血管形成提供新的思路和方法.     

细胞外基质在年龄相关性黄斑变性中的研究进展

年龄相关性黄斑变性(ARMD)是老年人失明的主要原因。研究表明,细胞外基质(ECM)调节障碍作为ARMD疾病的重要特征之一,它的损伤可贯穿于ARMD病程。此外,参与ARMD发生发展过程的各类型细胞可以在多种信号的控制下参与ECM的形成与异常沉积,通过传递调节黏附、迁移、增殖、凋亡、存活或分化的信号,从而导致视网膜、脉络膜微环境的破坏,免疫功能障碍,浸润性炎症细胞分化,新生血管生成,上皮-间充质转化,最终导致晚期ARMD视网膜下纤维化和瘢痕形成及视力严重受损。因此,ECM在ARMD中的作用逐渐引起重视。文章针对视网膜中ECM与ARMD的联系及ARMD中各类型细胞与ECM之间的作用做一综述,以期为治疗ARMD的研究方向提供指导意义。     

缺氧条件下共培养时观察Müller细胞对RPE细胞生长的影响

背景 视网膜色素上皮(RPE) 细胞和Müller细胞在维持视网膜的正常代谢中起重要作用,多种生理、病理过程与二者的相互作用有关.目的 利用Transwell小室体外共培养兔Müller细胞与RPE细胞,观察缺氧条件下Müller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响.方法 应用组织块培养法和酶消化法分别培养原代兔Müller细胞和RPE细胞,免疫组织化学法鉴定2种细胞.取第3代培养良好的细胞进行试验.应用CoCl2培养细胞以建立细胞化学缺氧模型,分为常氧组和缺氧组,每组又分为对照组(RPE细胞单独培养)、共培养组(Müller细胞与RPE细胞共同培养).利用Transwell小室建立Müller细胞和RPE细胞的共培养模型,各组分别培养3、6、24、48h,利用MTT法和结晶紫染色法对培养存活的RPE细胞进行计数,检测常氧及缺氧条件下Müller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响.结果 原代培养的RPE细胞符合RPE细胞的特征,90%以上呈现CK-18阳性反应.培养的Müller细胞对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100染色呈阳性反应.与常氧培养条件比较,缺氧条件下单独培养的RPE细胞增生数量增加,细胞迁移数量增加,差异有统计学意义(P＜0.01);缺氧条件下与Müller细胞共培养的RPE细胞增生数量和迁移数量明显增加,与常氧组和单细胞培养情况下比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).缺氧条件下,与RPE细胞单细胞培养组比较,共培养组RPE细胞的增生和迁移增加,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 缺氧可以促进RPE细胞的增生和迁移,Müller细胞可以加重缺氧引起的RPE细胞的增生和迁移.

Abstract：

Background More and more evidences suggest that the interaction of retinal progression of retinal diseases.Objective Present study was to investigate the primarily cultured and digested using explant culture method and trypsas acidic protein(GFAP) staining,S-100 staining and cytokine-18 staining co-cultured under the normoxia and hypoxia using transwell chamber,and the proliferation and migration of cultured RPE cells were examined using MTT and compared with only RPE cells cultured group at 3, 6, 24 and 48 hours.Results Over 90% of primarily cultured RPE cells showed the positive response for S-100.The proliferation and migration of RPE cells were significantly increased in hypoxia condition compared with normoxia condition (P＜0.01).In hypoxia group,amount of proliferation and migration of RPE cells in co-culture group were higher than the only RPE cells cultured group(P＜0.01).Conclusion Hypoxia appear to aggravate the proliferation and migration of RPE cells under the hypoxia status.     

缺氧对培养的人视网膜色素上皮细胞中血管生成素-2表达的影响

背景脉络膜新生血管（CNV）是导致一些眼底疾病视力丧失的主要原因,而血管生成素2（Ang-2）与血管生成的关系较为密切。目前在缺氧条件下人视网膜色素上皮（RPE）细胞上Ang-2的表达情况与CNV发病的关系研究较少。目的观察缺氧对体外培养的人RPE细胞中Ang．2表达的影响,探讨Ang-2在CNV形成中的可能作用。方法人RPE细胞经培养和传代,取第4～7代细胞以5×10^7个／L密度接种于培养皿,常氧对照组不加CoCl2,缺氧组换以含终浓度为200μmol／LCoCl2的培养基5ml建立RPE细胞化学缺氧模型,分别于加药导致缺氧后0．5、1、2、4、6、12和24h终止缺氧。采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测缺氧不同时间对体外培养的人RPE细胞Ang-2mRNA表达的影响;采用酶联免疫吸附反应（ELISA）法检测缺氧不同时间对体外培养的人RPE细胞上清液中Ang-2蛋白质量浓度的影响。结果人RPE细胞复苏后存活率达90％,第4代传代细胞中色素很少,细胞形态多为梭形。不同培养条件组人RPE细胞中Ang-2mRNA／β-actin mRNA值的总体比较差异有统计学意义（F=1086．30,P=0．00）;缺氧条件下培养0．5h后人RPE细胞中Ang-2mRNA／β-actin mRNA值开始明显增加,至缺氧培养后4～6h达高峰,与常氧对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）;缺氧培养24h后Ang-2mRNA／β-actin mRNA值接近常氧对照组。ELISA分析结果表明,不同培养条件下人RPE细胞培养基上清液中Ang-2蛋白的总体比较差异有统计学意义（F=1034．00,P=0．00）,缺氧条件下培养0．5h后人RPE细胞中Ang-2蛋白的质量浓度开始明显升高,6h达到高峰,与常氧对照组相比,差异均有统计学意义（P〈0．05）;缺氧培养24h后Ang-2蛋白的质量浓度接近常氧对照组。结论缺氧可显著上调体外培养的人RPE细胞中Ang-2的表达,Ang-2于缺氧早期呈高表达,提示Ang-2参与了CNV的形成,可能在CNV形成过程的早期阶段发挥作用。     

Inhibition of proliferation,migration and tube formation of choroidal microvascular endothelial cells by targeting HIF-1α with short hairpin RNA-expressing plasmid DNA in human RPE cells in a coculture system

BACKGROUND: Retinal pigment epithelial (RPE) cells and choroidal microvascular endothelial cells (CECs) are the main cells involved in choroidal neovascularization (CNV), and hypoxia plays an important role in CNV formation via hypoxia inducible factor 1 (HIF-1). Our aim was to evaluate the role of HIF-1 in human RPE cells with regard to proliferation, migration and tube formation of CECs under hypoxia. METHODS: RPE cells were cultured under chemical hypoxia induced by 200 muM CoCl(2), and RNA interference (RNAi) technique was used to knock down HIF-1alpha gene in RPE cells. mRNA and protein expression of HIF-1alpha and VEGF in RPE cells were investigated by real-time RT-PCR and Western blot. Three kinds of coculture models were used to observe the effects of RPE cells transfected by short hairpin RNA (shRNA)-expressing plasmid DNA (pDNA) (pshHIF-1alpha) on the proliferation, migration and tube formation of CECs respectively. RESULTS: Transfection of shRNA-expressing pDNA targeting HIF-1alpha to RPE cells resulted in the knock down of HIF-1alpha gene and reduction of the corresponding mRNA and protein of HIF-1alpha and VEGF under hypoxia. Consequently, the proliferation, migration and tube formation of CECs were significantly inhibited by the knocked-down RPE cells compared with the control in the coculture system. The proliferation rates of CECs decreased by 40.2%, 36.6% and 36.8% on days 3, 4 and 5 respectively. Migration reduced by 49.6% at 5 h, and tube formation decreased by 40.4% at 48 h. CONCLUSION: RNAi of HIF-1alpha in RPE cells can inhibit angiogenesis in vitro and provide a possible strategy for treatment of choroidal neovascularization diseases by targeting HIF-1alpha.     

bFGF对人晶状体上皮细胞中FAK表达的影响

目的:观察不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)引起体外培养的人晶状体上皮细胞迁移和黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)mRNA水平的动态变化.方法:体外培养的第3代人晶状体上皮细胞,建立细胞划痕损伤模型,经0,5,10,15μg/L bFGF作用8～16h后,电脑图像法测定细胞迁移距离,RT-PCR法检测0,1,4,8,16h FAK mRNA水平,免疫荧光法检测整合素β1和增殖细胞核抗原表达阳性率的变化.结果:与对照组比,5μg/L 组细胞迁移距离和FAK mRNA表达显著增加(P＜0.05):10μg/L 组细胞整合素β1表达阳性率显著增加(P＜0.05);15μg/L 细胞迁移距离和FAKmRNA显著降低(P＜0.05).结论:bFGF引起人晶状体上皮细胞迁移距离和FAK mRNA表达的变化.     

NADPH氧化酶4抑制剂对缺氧诱导的人RPE细胞中VEGF表达的抑制作用

目的观察还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶4(NOX4)抑制剂对缺氧诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法将APRE-19细胞分为Avastin干预组和VAS2870干预组,并按照药物剂量不同将Avastin干预组亚分为常氧对照组、缺氧对照组及0.25 mg/ml、0.50 mg/ml和0.75 mg/ml Avastin干预组,将VAS2870干预组亚分为1μmol/ml、3μmol/ml和5μmol/ml VAS2870干预组,缺氧对照组采用终浓度为300μmol/L CoCl2处理ARPE-19细胞以建立细胞化学缺氧模型。采用细胞免疫荧光染色技术对不同干预组细胞中NOX4和VEGF表达进行测定和定位,采用Western blot法对不同干预组细胞中NOX4和VEGF蛋白相对表达量进行测定和比较。结果Western blot法检测显示,常氧对照组、缺氧对照组及0.25 mg/ml、0.50 mg/ml和0.75 mg/ml Avastin干预组NOX4蛋白相对表达量分别为0.657±0.153、1.000±0.200、1.206±0.300、1.260±0.200和1.413±0.273,VEGF-A蛋白相对表达量分别为0.821±0.110、1.210±0.100、0.672±0.100、0.340±0.120和0.300±0.130,组间总体比较差异均有统计学意义(F=17.631,P<0.001;F=4.777,P=0.020),其中0.75 mg/ml Avastin干预组细胞中NOX4蛋白表达量明显高于常氧对照组,差异有统计学意义(P<0.001),0.25、0.50和0.75 mg/ml Avastin干预组VEGF-A表达量均明显低于缺氧对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。常氧对照组、缺氧对照组及1μmol/ml、3μmol/ml和5μmol/ml VAS2870干预组细胞中NOX4的蛋白相对表达量分别为0.970+0.120、1.060+0.130、0.880+0.130、0.567+0.135和0.450+0.120,VEGF-A蛋白相对表达量分别为0.387+0.135、0.627+0.125、0.370+0.140、0.363+0.140和0.160+0.100,组间总体比较差异均有统计学意义(F=12.933,P<0.001;F=4.948,P<0.05),其中3μmol/ml和5μmol/ml VAS2870干预组细胞中NOX4蛋白相对表达量明显低于缺氧对照组,差异均有统计学意义(均P<0.001);1μmol/ml、3μmol/ml和5μmol/ml VAS2870干预组细胞中VEGF-A蛋白相对表达量明显低于缺氧对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论NOX4抑制剂可抑制人RPE细胞中VEGF-A表达。     

Focal adhesion kinase signaling pathway participates in the formation of choroidal neovascularization and regulates the proliferation and migration of choroidal microvascular endothelial cells by acting through HIF-1 and VEGF expression in RPE cells

Choroidal neovascularization (CNV) is one of the most frequent causes of severe and progressive vision loss, while its pathogenesis is still poorly understood. Focal adhesion kinase (FAK), a non-receptor tyrosine kinase, plays a crucial role in linking signals initiated by both the extracellular matrix (ECM) and soluble signaling factors and controls essential cellular processes. Extensive evidence has shown that FAK is activated in angiogenic response. This study aims to investigate the effect of FAK on CNV formation. The Brown-Norway (BN) rats underwent laser rupture of Bruch's membrane to induce CNV and were then killed at 1, 3, 7, and 14 days following laser injury. Immunofluorescence and Western blot were processed to detect FAK protein. Retinal pigment epithelial (RPE) cells were cultured under hypoxia and RNA interference (RNAi) technique was used to knock down the FAK gene in RPE cells. Expression of hypoxia inducible factor-1 (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in RPE cells were investigated by RT-PCR and Western blot. Two kinds of coculture models were used to observe the effects of specific blockade of FAK in RPE cells on the proliferation and migration of choroidal microvascular endothelial cells (CECs), respectively. FAK was highly expressed in the rat RPE-choroid tissue after photocoagulation. In vitro experiment showed that FAK was involved in hypoxia signaling in cultured RPE cells. The absence of FAK effectively reduced the expression of hypoxia-induced HIF-1α and VEGF in RPE cells, resulting in the inhibition of proliferation and migration of CECs. Our results suggest that FAK pathway activation plays a role in the development of CNV, and regulates the proliferation and migration of CECs by acting through HIF-1 and then up-regulating the expression of the angiogenic factor VEGF in RPE cells. It is reasonable to propose that FAK siRNA will potentially provides a means to attenuate the strong stimuli for neovascularization in CNV-dependent disorders, which could present a therapeutically relevant strategy for the inhibition of CNV.     

非致死性过氧化氢持续性损伤对视网膜色素上皮细胞连接的影响

背景 活性氧中间产物可导致细胞氧化损伤,视网膜色素上皮(RPE)细胞对视细胞外节膜盘的吞噬产生了大量的活性氧中间产物过氧化氢(H2O2),易对RPE细胞本身造成反复的氧化损伤. 目的 探讨非致死性H2O2持续性损伤对RPE细胞连接的影响. 方法 ARPE-19细胞株以8×104个/L的密度接种在96孔板中,在24孔板中细胞爬片的接种密度为4×104个/L,并在DMEM/F12培养液中培养,无血清培养液饥饿培养24 h后用于实验.将不同浓度(0～0.60 mmol/L)的H2O2加入培养液,单溶液细胞增生(MTS)法检测不同浓度H2O2持续性损伤对RPE细胞活力的影响;用Transwell小室法培养细胞,跨上皮细胞电阻(TER)法检测细胞单层的形成时间;以罗丹明-异硫氰酸荧光素标记葡聚糖的量测定H2O2对RPE细胞单层通透性的影响;免疫荧光法检测RPE细胞之间紧密连接蛋白ZO-1的表达情况.结果 不同质量浓度H2O2作用组细胞活力(A490值)的差异有统计学意义(F=991.501,P=0.000),0.20～0.60 mmol/L H2 02组细胞活力明显低于对照组,差异均有统计学意义(t=3.200、11.368、4.256、2.929、10.818、15.433、64.125、98.805,P＜0.05).ARPE-19细胞接种于Transwell小室后l1d时TER值为(24.9±1.3)Ω ·cm2,7d时为(17.8±1.4)Ω·cm2,差异有统计学意义(t=5.228,P=0.014);至第15天左右达到稳定水平,约为(25.9±0.9)Ω·cm2.细胞通透性检测表明,无细胞的空白组葡聚糖渗漏量(相对荧光强度)为433.08±51.53,无H2O2的对照组渗漏量为255.39±16.44,明显低于空白组,差异有统计学意义(t=12.515,P=0.006);H2O2处理的实验组渗漏量为363.28±26.17,较对照组渗漏增加,差异亦有统计学意义(t=14.412,P=0.005).免疫荧光检测可见无H2O2对照组细胞ZO-1连接完整,H2O2组较无H2O2对照组细胞ZO-1连接呈断裂状. 结论 非致死性H2O2持续性损伤对RPE细胞连接有破坏作用.     

蛋白激酶C在缺氧人RPE细胞表达血管内皮生长因子中的作用

目的探讨蛋白激酶C(PKC)信号转导通路在缺氧诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达中的作用。方法在细胞培养液内加入CoCl2溶液以模拟缺氧环境,培养RPE细胞0·5、48h后,用免疫荧光法检测人RPE细胞内PKC的表达。将PKC激动剂佛波醇-12-豆蔻酰-13乙酸(PMA)及PKC抑制剂Chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液,在缺氧状态下分别培养6、12、24h后,用ELISA检测各组RPE细胞中VEGF的表达。对照组为常氧状态下培养的RPE细胞。结果免疫荧光染色显示缺氧及常氧状态下,RPE细胞浆及胞核内均有PKC的表达。PKC激动剂PMA可增强缺氧状态下RPE细胞对VEGF的表达,而PKC抑制剂Chelerythrine可减弱缺氧状态下RPE细胞对VEGF的表达。结论缺氧诱导VEGF在RPE细胞中的表达,其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的。     

缺氧条件下Hsp90抑制剂17-AAG对RPE细胞整联蛋白连接激酶表达的影响

目的：研究热休克蛋白（heat shock protein 90,Hsp90）抑制剂17-AAG对缺氧诱导的视网膜色素上皮（ retinal pigment epithelial,RPE）细胞整联蛋白连接激酶（ integrin - linked kinase,ILK）表达的影响。 方法：利用200μmol/L氯化钴（ cobalt chloride, CoCl2）建立体外RPE细胞的化学缺氧模型。不同浓度的Hsp90抑制剂17-AAG预处理RPE细胞1 h后给予12 h缺氧处理。实验分为缺氧对照组、二甲基亚砜（ DMSO）对照组和17-AAG预处理组。其中17-AAG预处理组根据浓度不同又分为6组：0.01,0.10,0.50,1.00,5.00,10.00μmol/L。应用RT-PCR和Western blot 方法检测ILK表达变化情况。 结果：缺氧对照组、DMSO对照组和17-AAG预处理组ILK mRNA与内参β-actin mRNA 光密度比值分别为1.32±0.04,1.29±0.03,0.93±0.06,0.70±0.05,0.53±0.03,0.44±0.04,0.32±0.04,0.30±0.03;ILK 蛋白与内参β-actin蛋白光密度比值分别为2.16±0.04,2.13±0.04,1.65±0.04,1.13±0.05,0.74±0.03,0.41±0.06,0.35±0.04,0.35±0.03。与缺氧对照组比较,17-AAG预处理组ILK mRNA和蛋白的表达明显降低（ P〈0.05）,呈浓度±赖性。 结论：Hsp90抑制剂17-AAG能够降低缺氧条件下RPE细胞ILK的表达。