人核迁移蛋白shRNA慢病毒载体的构建及转导

目的:通过绿色荧光蛋白(GFP)标记,构建可示踪的人核迁移蛋白(hNUDC)慢病毒RNA干扰载体,并实现其对靶细胞的转导。方法:通过分子克隆技术将人核迁移蛋白的发夹RNA(shNUDC-F)克隆至慢病毒表达载体中,构建成靶向针对hNUDC的RNA干扰载体,通过磷酸钙转染法,将获得的慢病毒高纯度质粒转染进低次代293T细胞中进行包装,通过高速离心收获慢病毒颗粒,经滴度测定后,对Dami巨核细胞进行转导实验。用显微镜观察转导效率,用Westernblot检测RNA干扰效果。结果:慢病毒携带的shNUDC-F片段对Dami巨核细胞能高效转导,并使其内源hNUDC基因发生基因沉默,干扰效果较好。结论:成功构建出慢病毒hNDUC RNA干扰载体,并在293T细胞中实现包装并成功转入Dami细胞。     

STAT3ER慢病毒表达载体的构建及体外对神经元再生作用的研究

目的构建携带信号转导和转录激活蛋白STAT3和基因突变的雌激素受体ER的慢病毒载体,并转染受损的大鼠背根神经节神经元,研究其对神经元突起再生的作用。方法运用基因重组技术,将STAT3、ER和核糖体介导的绿色荧光蛋白(IRES-GFP)片段插入慢病毒载体pRRL-MCS+的PmeI位点构建慢病毒载体pRRL-STAT3ER-IRES-GFP,经RT-PCR、Western blotting和测序分析加以鉴定其正确性。将慢病毒载体3质粒细胞包装系统(主体质粒pRRL-STAT3ER-IRES-GFP、包装质粒pCMVdeltaR8.74和包膜质粒VSV-G)共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。切断大鼠左L5近神经节的神经根,摘取L5背根神经节做分离神经元培养,将pRRL-STAT3ER-IRES-GFP感染神经元细胞并观察神经元细胞核转运和突起的长度。结果构建的慢病毒载体pRRL-STAT3ER-IRES-GFP经RT-PCR和Western blotting鉴定正确,测序分析与Genbank报道的STAT3基因序列完全一致。3质粒共转染293T细胞后,测定慢病毒滴度为1010-11TU/ml。转染pRRL-STAT3ER-IRES-GFP的神经元经4-羟基三苯氧胺(4HT)激活,STAT3ER有明显的核转运,并增强突起的生长,经χ2检验与对照组有显著性差异。结论成功构建了表达小鼠STAT3ER基因的慢病毒载体并证实STAT3信号转导有利于轴突生长。     

BIRC5 shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用RNA干扰技术,以人BIRC5基因为靶基因,设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,构建慢病毒干扰载体并鉴定。方法:将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列,连接入经AgeI和EcoR I双酶切线性化的pMAGic慢病毒质粒载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性克隆,采用PCR扩增和DNA测序鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳阳性克隆得到335 bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含设计合成序列。结论:4对BIRC5 shRNA重组慢病毒表达载体构建成功,为研究靶向BIRC5 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

SIRT1基因shRNA慢病毒载体构建及干扰效应检测

背景：SIRT1基因在细胞能量代谢、凋亡及衰老过程中发挥极重要的作用,另有研究发现SIRT1可能在炎症反应方面起着调控作用。 目的：构建SIRT1特异性的shRNA慢病毒载体,并初步检测其对THP-1细胞SIRT1基因的抑制效应。 方法：设计SIRT1靶点特异性的寡核苷酸序列,连接到经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切线性化的pGCSIL-GFP载体,包装293T细胞产生慢病毒,再转染THP-1细胞,通过实时荧光定量PCR实验及Western Blot检测对SIRT1靶基因的抑制情况。 结果与结论：阳性克隆PCR及测序证实SIRT1基因shRNA慢病毒载体构建成功,实时荧光定量PCR及Western Blot检测该载体在mRNA和蛋白水平能抑制THP-1细胞的SIRT1表达。     

大鼠VGLUT2基因shRNA慢病毒载体的构建和鉴定

目的:构建可以表达针对2型囊泡膜谷氨酸转运体(VGLUT2)shRNA的慢病毒载体,特异性下调中枢神经系统内VGLUT2的表达,从而为研究VGLUT1和VGLUT2的功能差异提供有力的工具。方法:首先在体外合成四对互补并靶向作用于编码大鼠VGLUT2序列四个位点的特异性短发卡RNA(short hairpin RNA)序列和一个阴性对照的寡核苷酸,克隆到pGCSIL-GFP质粒(经Age I和EcoRI双酶切)载体内,经酶切及测序鉴定正确后,将该质粒与辅助质粒pHelper1.0以及pHelper2.0共转染T293细胞,包装得到病毒颗粒。各组病毒载体转染原代培养的大鼠皮层神经元后,运用免疫荧光和Western Blot检测各组蛋白的表达水平。结果:pGCSIL-GFP质粒克隆得到的VGLUT2 shRNA序列正确,包装得到的病毒可以有效转染原代培养的皮层神经元,Western Blot检测结果显示:VGLUT2 shRNA-1与VGLUT2 shRNA-2病毒组的VGLUT2表达水平与空白组相比有显著性差异(P<0.05),分别为空白组的63.9±5.82%,73.8±3.18%;VGLUT2 shRNA-3与VGLUT2 shRNA-4病毒组的VGLUT2表达水平与空白组相比同样有显著性差异(P<0.05),分别为空白组的39.1±1.99%,35.1±1.72%;VGLUT2shRNA-1与VGLUT2 shRNA-2病毒组相比无显著性差异(P>0.05);但VGLUT2 shRNA-3与VGLUT2 shRNA-4病毒组与VGLUT2 shRNA-1和VGLUT2 shRNA-2病毒组相比有显著性差异(P<0.05)。表明VGLUT2 shRNA-3与VGLUT2 shRNA-4组病毒能较为高效的下调培养的皮层神经元VGLUT2的表达,下调效率超过60%。结论:本研究成功构建出表达针对大鼠VGLUT2基因shRNA的慢病毒载体,并可有效下调VGLUT2的表达,为进一步研究VGLUT2的功能及其与VGLUT1之间的功能差异提供了有力的工具。     

Slug基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建Slug基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体。方法针对人Slug基因的序列,设计出RNA干扰的靶序列,合成靶序列Oligo DNA,退火形成双链DNA,通过Age I和EcoR I酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒载体,质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆并用插入鉴定引物进行PCR鉴定阳性克隆并测序,同时应用Real-time PCR和Western blot方法检测HCT116结肠癌细胞中Slug基因mRNA和蛋白的表达情况。结果 PCR鉴定与DNA测序证实合成的含Slug shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。Western blot证实Slug RNAi慢病毒载体能够抑制Slug的表达。结论成功构建Slug基因RNAi慢病毒表达载体,为后续感染结肠癌细胞,为探索在结直肠癌发生和发展中的作用奠定基础。     

靶向MAG基因shRNA慢病毒载体的构建及其对MAG基因表达的沉默

 目的：设计以MAG基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对MAG基因表达的影响。方法：将3条靶向大鼠MAG基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pWPI,与pCDNA3-MAG-FLAG质粒用Lipofectamine　2000共转染293T细胞,Western blotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pAX2和pMD2G经293T细胞包装后,产生的重组慢病毒感染少突胶质细胞,48 h后Western blotting法检测MAG蛋白的表达情况。结果：经双酶切后测序鉴定,构建了MAG shRNA慢病毒载体pWPI-MAG,鉴定出shRNA-2为最为有效的shRNA。重组慢病毒能明显抑制少突胶质细胞中MAG的表达。结论：慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性阻断MAG的表达,为进一步探讨MAG特异性shRNA治疗神经系统髓鞘损伤奠定了基础。     

靶向TPX2基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体,获得稳定感染的人宫颈癌He La细胞株,为宫颈癌细胞TPX2基因的相关研究奠定基础。方法以TPX2基因为靶点,设计并合成四组对应于目标shRNA的双链DNA发卡结构,分别与慢病毒载体Pglv2-U6-Puro连接经转化感受态细胞,阳性克隆经测序、病毒包装、滴度测定、感染细胞、嘌呤霉素筛选得到TPX2基因沉默稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot检测TPX2 mRNA和蛋白的沉默效果。流式细胞计量术检测其对细胞周期分布及凋亡的影响。结果测序结果证实5种慢病毒载体均包装成功,采用0.4μg/m L嘌呤霉素成功筛选出TPX2沉默细胞株。He La细胞感染4种载有TPX2-shRNA的重组慢病毒后,均发挥了沉默效应,尤以TPX2-shRNA-1沉默效果最佳,TPX2 mRNA相对表达量为0.21±0.07,低于对照组的1.08±0.07(P0.01);TPX2蛋白质相对表达量为0.19±0.28,低于对照组的0.64±0.03(P0.01);G2及S期细胞高于对照组(P0.05);细胞凋亡率明显多于对照组(P0.05)。结论获得了一种有效TPX2基因的干扰序列,成功构建了TPX2 shRNA慢病毒干扰载体,并筛选出TPX2基因沉默的He La细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

人CDK2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的： 构建人细胞周期素依赖蛋白激酶2(CDK2)基因RNA干扰慢病毒载体。〖HJ1.8mm〗方法: 利用Invitrogen公司在线软件设计人CDK2（NM001798）shRNA序列，退火形成ds oligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端，测序，再与慢病毒载体重组，测序鉴定，在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和CDK2基因重组慢病毒载体转染293FT细胞，包装成病毒后，收集细胞培养上清液，测定病毒滴度。结果: 测序证实pENTRTM/U6- CDK2-shRNA为阳性克隆，与慢病毒载体重组后测序结果显示也为阳性克隆，CDK2基因重组慢病毒载体传染293FT细胞后48 h, 细胞培养上清液，病毒的滴度为6×108TU/L。结论: 成功构建人CDK2基因RNAi慢病毒载体，为研究CDK2在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。     

靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建

背景：端粒酶反转录酶对端粒酶活化起重要作用。 目的：利用pLentilox3.7.U6载体构建靶向大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA干扰分子表达载体并鉴定其作用。 方法：选择端粒酶反转录酶基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的正义链和反义链模板序列,经退火成互补双链,与线性化pLentilox3.7.U6载体连接、转化大肠杆菌和序列测定,应用蛋白质印迹和免疫荧光技术,在体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞模型上验证构建的干扰载体抑制端粒酶反转录酶基因表达的效果。 结果与结论：蛋白质印迹和免疫荧光检测结果表明,重组质粒干扰组中星形胶质细胞端粒酶反转录酶均呈低表达。结果证实,实验成功构建了针对大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA质粒表达载体,此载体能有效抑制体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶的表达。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

骨桥蛋白短发卡样RNA质粒载体的构建与筛选

目的 构建携带骨桥蛋白双链小干扰RNA(OPN-siRNA)的质粒表达载体,筛选出基因沉默效果最明显的短发卡样RNA(shRNA)质粒表达载体.方法 设计并合成2个针对OPN的shRNA寡核苷酸片段(shRNA1,shRNA2),退火形成双链并分别克隆进入载体pGenesil-1.酶切鉴定后,采用LipofectamineTM2000介导的转染方法将重组的shRNA质粒转入大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),筛选出稳定转染株.采用RT-PCR及Western免疫印迹检测其对OPN表达的抑制效果.结果 shRNA质粒成功转染入VSMC且效率达50%以上.转染含OPN shRN A1的VSMC的OPN mRNA和蛋白的表达分别为0.16±0.04和0.30±0.09,含OPN shRNA2分别为0.23±0.06和0.44±0.06,两组之间及分别与正常细胞组比较差异均有统计学意义(P<0.01).空载体组和阴性对照组与正常细胞组比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 成功构建了靶向OPN基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为shRN A1质粒.     

兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定*

背景：膜联蛋白A1参与细胞凋亡的调控。 目的：针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,并检测其对成骨细胞的沉默效率。 方法：针对兔膜联蛋白A1基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI 双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒颗粒LV-shANXA1,并测定其滴度,随后将LV-shANXA1感染兔成骨细胞。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1的滴度为3.8×108 TU/L。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。Real-time PCR 和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达71.2%。表明实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

Mcl-1短发夹RNA在Raw264.7细胞内特异性的筛选

目的:将Mcl-1shRNA转染到Raw264.7细胞内,针对shRNA对小鼠Raw264.7巨噬细胞系中Mcl-1表达的影响,筛选出沉默Mcl-1基因效果最明显的特异性shRNA真核表达质粒。方法:将特异性shRNA经脂质体介导转染小鼠巨噬细胞系Raw264.7;半定量RT-PCR和Western blot分别检测转染24、48 h后Mcl-1 mRNA水平变化和Mcl-1蛋白表达情况,分析对应不同位点的三对特异性shRNA片段对Mcl-1的沉默效果。结果:特异性shRNA片段在24、48 h均能有效降低Mcl-1 mRNA和蛋白水平,沉默效率高于正常组、脂质体组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P0.05);对应不同位点的三对shRNA真核表达质粒,其中Mcl-1 shRNA3对Mcl-1 mRNA和蛋白的抑制作用均最强。结论:RNA干扰技术可有效下调小鼠Raw264.7巨噬细胞系中Mcl-1 mRNA水平,明显下调Mcl-1蛋白表达。成功筛选出了沉默Mcl-1基因效果最明显的特异性shRNA真核表达质粒。     

STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用.方法:根据siRNA设计原则, 结合pSilencer2.1-U6-neo质粒特点, 针对STAT3基因设计并合成两条寡聚DNA片段, 退火后克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒, 脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞.RT-PCR和Western blot检测SiHa细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平;MTT法和流式细胞术(FCM)检测细胞的增殖和凋亡.结果:成功构建了STAT3基因shRNA真核表达载体, 转染人宫颈癌SiHa细胞.细胞STAT3蛋白及mRNA表达下降;同时SiHa细胞增殖能力下降, 细胞凋亡增加.结论:构建的STAT3基因shRNA真核表达载体能够通过下调STAT3基因表达, 抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力, 诱导细胞凋亡.     

Attenuation of SARS coronavirus by a short hairpin RNA expression plasmid targeting RNA-dependent RNA polymerase

Severe acute respiratory syndrome (SARS) is a highly contagious and sometimes a lethal disease, which spread over five continents in 2002-2003. Laboratory analysis showed that the etiologic agent for SARS is a new type of coronavirus. Currently, there is no specific treatment for this disease. RNA interference (RNAi) is a recently discovered antiviral mechanism in plant and animal cells that induces a specific degradation of double-stranded RNA. Here, we provide evidences that RNAi targeting at coronavirus RNA-dependent RNA polymerase (RDRP) using short hairpin RNA (shRNA) expression plasmids can specifically inhibit expression of extraneous coronavirus RDRP in 293 and HeLa cells. Moreover, this construct significantly reduced the plaque formation of SARS coronaviruses in Vero-E6 cells. The data may suggest a new approach for treatment of SARS patients.     

靶向髓样细胞表达的激发受体1基因短发夹RNA真核质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码髓样细胞表达的激发受体1(TREM-1)基因短发夹RNA(shRNA)真核质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 针对TREM-1的靶位点设计含shRNA的靶序列,分别构建pGCsi-TREM-1 shRNA1和pGCsi-TREM-1 shRNA2的质粒表达载体和pGCsi-NegshRNA阴性质粒表达载体,通过酶切及测序进行鉴定.鉴定后以脂质体包裹转染肺泡上皮A549细胞,分为未转染对照组(A组)、转染空质粒载体pGCsi对照组(B组)、转染阴性shRNA质粒表达载体pGCsi-NegshRNA对照组(C组)、转染TREM-1 shRNA1质粒表达载体组(D组)和转染TREM-1shRNA2质粒表达载体组(E组),48 h后观察转染细胞绿色荧光蛋白表达效果.转染24、48、72 h后,以A组为对照采用MTT法测定B、C、D、E组细胞的存活率.转染48 h后,通过荧光定量PCR检测各组TREM-1 mRNA的表达水平并与转染前相比较.结果 经酶切和测序鉴定证实,目的 TREM-1基因shRNA1和shRNA2片段已被克隆到pGCsi载体中.荧光显微镜下,B、C、D、E组A549细胞有明显的绿色荧光蛋白表达.各时间点B、C、D、E组细胞存活率均达90%以上.A、B、C 3组转染前后TREM-1mRNA的表达水平差异无统计学意义,D、E组转染的重组质粒均能有效抑制A549细胞的TREM-1mRNA的表达([(1.945±0.252)×105比(1.010±0.194)×105,(1.933±0.216)×105比(1.202±0.171)×105,均P＜0.05],抑制率分别为48.07%和37.82%.结论 成功构建了靶向TREM-1基因的shRNA质粒表达载体,可有效抑制细胞中TREM-1目的 基因的表达,为后续脓毒症的基因治疗提供了依据.     

Screening effective short interfering RNA/short hairpin RNA for inhibition of human astrovirus ORF2 gene expression in cultured cells

In this study, we have evaluated four different 21-nt duplexes of small interfering RNA (siRNA-469, siRNA-852, siRNA-1802 and siRNA-1806) that specifically target the ORF2 gene of human astrovirus (HAstV) in inhibiting HAstV capsid protein expression in transfected BHK-21 cells. Furthermore, fluorescence analysis, real-time quantitative PCR (RT-qPCR) and western blot assays showed that pGPU6/GFP/Neo-shRNA inhibits ORF2 gene expression in Caco2 cells. The results indicate that siRNA/shRNA-469 and siRNA/shRNA-1802 can interfere with capsid protein expression in cell culture, and this provides a powerful tool for the study of HAstV gene functions and the biological properties of the capsid protein.