醛脱氢酶8A1融合蛋白的表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:重组表达醛脱氢酶8A1(aldehyde dehydrogenase 8 family member A1,ALDH8A1)蛋白,制备其多克隆抗体,并进行抗体的特异性鉴定,以及蛋白在组织和细胞内的定位。方法:以成人肝cDNA文库为模板,PCR扩增ALDH8A1目的片段,并构建重组表达载体pGEX-4T-1-ALDH8A1和pET-32a-ALDH8A1,经测序鉴定插入载体的DNA片段序列正确后,转化大肠杆菌BL21,诱导表达GST-ALDH8A1和His-AL-DH8A1融合蛋白。经Western blot确定其为目的蛋白后,纯化重组融合蛋白,并以GST-ALDH8A1免疫家兔制备抗人AL-DH8A1多克隆抗体。用His-ALDH8A1包板,ELISA法测定兔抗人ALDH8A1血清效价;Western blot鉴定兔抗人ALDH8A1血清在重组蛋白和天然蛋白中的反应特异性;免疫组化法确定ALDH8A1蛋白在组织和细胞中的定位。结果:成功构建重组表达载体pGEX-4T-1-ALDH8A1和pET-32a-ALDH8A1;获得包涵体形式表达的GST-ALDH8A1和可溶性形式表达的His-ALDH8A1融合蛋白;应用纯化的重组蛋白GST-AL-DH8A1免疫家兔,获得兔抗人ALDH8A1血清,ELISA测定抗血清的效价为1∶256000。Western blot结果显示,制备的AL-DH8A1兔多抗可特异地识别成人肝总蛋白以及293T、A549、HeLa、U937、HepG2细胞总蛋白中一个相对分子质量(Mr)约53000的ALDH8A1天然蛋白,与文献报道的ALDH8A1的Mr一致,表明ALDH8A1在正常肝组织与癌细胞中都有表达。免疫组化结果表明ALDH8A1蛋白定位于人肝癌细胞胞质中。结论:成功制备出兔抗人ALDH8A1多克隆抗体,此抗体可应用于ELISA,Western blot和免疫组化检测,为进一步研究ALDH8A1的功能奠定了基础。     

兔抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备兔抗人羧酸酯酶1(CES1)多克隆抗体(pAb), 并对抗体进行特性鉴定.方法: 以人正常肝cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CES1(即CES1-GST)和pET-32a-CES1(即CES1-His).CES1-GST融合蛋白作为免疫原制备兔pAb, 辛酸-硫酸铵法纯化抗体, 采用Western blot和免疫组化鉴定抗体的特异性.结果: CES1-GST和CES1-His融合蛋白均在大肠杆菌中以包涵体形式大量表达.兔抗人CES1 pAb效价为1∶ 64 000.Western blot鉴定表明, 该抗体可识别重组人CES1蛋白, 也可特异地识别人肝微粒体中的CES1亚基.免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性识别正常肝组织中的CES1蛋白.结论: 成功地制备了兔抗人CES1 pAb, 该抗体可应用于ELISA、 Western blot、免疫组化等实验, 为进一步研究CES1的功能提供了特异性检测工具.     

FILIP-1L 蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的： 表达、纯化GST-FILIP-1L融合蛋白,制备FILIP-1L多克隆抗体。方法：pGEX-4T3-FILIP-1L重组质粒转化E-coliBL21大肠杆菌,IPTG诱导GST-FILIP-1L融合蛋白表达,Glutathion Sepharse 4B纯化GST-FILIP-1L融合蛋白。将纯化的GST-FILIP-1L融合蛋白免疫新西兰大耳白兔,制备FILIP-1L多克隆抗体,用ELISA方法检测多克隆抗体效价,Western blot检测多克隆抗体与FILIP-1L蛋白、细胞转染FILIP-1L蛋白及细胞FILIP-1L蛋白的结合能力。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的FILIP-1L融合蛋白,经Glutathion Sepharse 4B纯化后免疫新西兰大耳白兔,获得了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体,亲和层析获得纯度较高的多克隆抗体,WB检测显示多克隆抗体能够与FILIP-1L蛋白、293细胞转染FILIP-1L蛋白及肝癌细胞FILIP-1L蛋白结合。结论：成功表达、纯化了GST-FILIP-1L融合蛋白,制备了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体,为研究FILIP-1L蛋白生物学功能提供了有用的实验工具。     

人Polycomb家族成员NSPc1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的Polycomb家族成员NSPc1多克隆抗体的制备与检测。方法应用PCR技术扩增人NSPc1编码区全长序列并插入到pET-43.1a（＋）载体中,在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白HIS-NSPc1。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人NSPc1多克隆抗体。用Western blot检测抗体免疫反应的特异性。结果在大肠杆菌中表达并纯化了人NSPc1重组蛋白,纯度达95%,用其免疫新西兰大白兔,成功制备了相应兔源多克隆抗体,Western blot实验中该抗体可以特异识别内源及外源性NSPc1蛋白。结论原核表达的NSPc1融合蛋白可以被纯化,并具有足够的蛋白免疫原性,所制备的相应多克隆抗体具有良好的特异性,可以运用于NSPc1基因的功能研究。     

PPM1A蛋白的表达纯化及鼠多克隆抗体制备研究

目的 表达、纯化PPM1A-His融合蛋白及制备鼠多克隆抗体.方法 将pBEX1-PPM1A-His原核表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内进行诱导表达,用纯化的PPM1A-His融合蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA、免疫组化和免疫荧光检测抗体的灵敏度和特异性.结果 成功表达并纯化了PPM1A-His融合蛋白,纯化后纯度可达90%;ELISA法测定抗体效价为1:100 000;免疫组化和免疫荧光结果显示所制备的抗体可特异性检测肝和肝癌细胞的PPM1A.结论 获得的PPM1A鼠多克隆抗体有较高的效价和特异性,为PPM1A在肝癌的相关研究打下了基础.     

Nono蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Nono(non-POU-domain-containing,octamer-bindingprotein)融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a( )-Nono重组表达质粒,转入Rosetta(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Nono融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-Nono融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫小鼠,获得了高特异性的抗Nono抗血清。结论成功构建pET-28a( )-Nono原核表达质粒,表达并纯化出高纯度的目标蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体。     

人硫氧还蛋白cDNA的克隆、表达及其多克隆抗体制备

目的制备硫氧还蛋白1(thioredoxin-1,Trx-1)多克隆抗体。方法从乳腺癌细胞系MCF-7中用RT-PCR的方法得到了Trx-1全长基因,将它克隆到原核表达载体上进行大量的表达和纯化,纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40d后取其血清用梯度饱和硫酸铵沉淀的方法进行多克隆抗体的纯化。用ELISA和Western印迹实验测定抗体效果。结果成功获得了Trx-1全长cDNA,通过原核表达得到了大量Trx-1蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。结论此多克隆抗体对Trx-1蛋白具有良好的识别能力,可以应用于Trx-1的功能研究。     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体。方法应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度：用Western-blot、ELISA法检测纯化后IgG性质及效价。结果重组NS1蛋白获得分泌表达。其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1：6000。结论重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础。     

抗新生血管蛋白KBP多克隆抗体的制备及鉴定

目的激肽释放酶结合蛋白(Kallikrein-binding protein,KBP)具有抑制血管新生的高活性,但目前尚无KBP的特异性抗体,限制其进一步研究。本研究拟制备高灵敏度和高特异性的KBP抗体并对其进行初步评估。方法构建含大鼠源性KBP序列的pET-28a重组载体的大肠杆菌BL21(DE3),在此基础上,扩增表达菌,经异丙基B.D一硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-NTA色谱柱亲和层析纯化获得KBP重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot方法对KBP进行鉴定。以纯化产物为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗KBP血清,亲和纯化获得多克隆抗体。应用Elisa和Western-blot方法检测纯化抗体的效价和特异性。结果 KBP融合蛋白得到高表达,且纯度大于85%。用该融合蛋白免疫大白兔后得到的抗KBP抗体,效价达1∶512 000,并特异性识别大鼠和人组织中天然的KBP蛋白。结论以纯化的KBP重组蛋白为抗原,获得KBP多克隆抗体,具有较好的效价和特异性,为KBP功能和作用机制的深入研究提供了必要的工具。     

兔抗人PIWIL4蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类正常及肿瘤组织中的分布.方法 合成特异性PIWIL 4多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔, 制备兔抗人PIWIL4多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体.用ELISA和western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行PIWIL4的免疫组化研究.结果 通过构建P IWIL4多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,我们制备了兔抗人PIWIL4蛋白多克隆抗体,经ELIS A 及Western blot证实兔抗人PIWIL4抗体可特异性识别PIWIL4多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在BU部分正常组织和肿瘤组织中呈阳性染色.结论 本项研究成功制备兔抗人PIWIL4多克隆抗体,为进一步研究PIWIL4在人类疾病中的意义提供了有利工具.     

人UNC5CL原核蛋白的表达及多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建UNC5CL基因的原核表达载体,纯化GST-UNC5CL融合蛋白,并以其为抗原免疫家兔,制备抗人UNC5CL多克隆抗体,并鉴定其反应性和特异性。方法:用PCR方法扩增UNC5CL基因(表达其280-518位氨基酸)片段并克隆至pGEX-4T-2原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21诱导融合蛋白GST-UNC5CL(aa 280-518)表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化,免疫家兔制备抗血清,再采用ELISA、Western blot和免疫组化的方法检测抗体的效价及特异性。结果:测序证实原核重组质粒构建成功;经IPTG诱导,可表达Mr为52 000的GST-UNC5CL(aa280-518)的融合蛋白;谷胱甘肽亲和层析柱纯化的融合蛋白免疫家兔制备的抗血清经Western blot和免疫组化检测证实可识别目的蛋白。结论:制备了兔抗人UNC5CL的多克隆抗体,且抗体对内源性UNC5CL具有较好的反应性和特异性,为进一步研究UNC5CL的功能奠定了基础。     

小鼠抗人Myosin Va多克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备Myosin Va多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具.方法:PCR扩增编码人Myosin Va C末端(MyoVaCT)278个氨基酸的cDNA片段,DNA重组入原核表达质粒pET28a,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基β-D硫代半糖苷(IPTG)诱导表达His-MyoVaCT融合蛋白.经电泳纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗血清.通过ELISA和免疫荧光法鉴定血清特异抗体效价和特异性.结果:成功构建了pET28a/MyoVaCT原核表达载体,转化BL21后可高效表达融合蛋白His-MyoVaCT,纯化蛋白免疫小鼠后产生的Myosin Va多抗可特异检测细胞内源性Myosin Va的表达及定位情况,同时能特异识别细胞内外源表达的Myosin Va分子.结论:获得了效价和特异性都良好的Myosin Va抗体,适合应用于Myosin Va的检测.     

DNA修复基因OGG1融合蛋白表达及多克隆抗体的制备

目的 表达及纯化8羟基脱氧鸟苷DNA糖苷酶-1(OGG1)融合蛋白制备多克隆抗体.方法 在大肠杆菌BL21中诱导表达OGG1融合蛋白,应用Ni-NTA亲和树脂进行纯化.纯化后的OGG1融合蛋白多次免疫大耳白兔,应用Westernb1otting的方法检测抗体活性,间接酶联免疫吸附分析(ELISA)法检测抗体效价.结果 ...     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

人抗菌肽HBD-2的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

制备人β-防御素2(HBD-2)多克隆抗体,以用于HBD-2蛋白水平表达的检测。提取人肠腺上皮细胞株Caco-2总RNA,设计引物,应用RT-PCR从其总RNA中扩增HBD-2成熟肽cDNA片段,以pGEX-1λT为载体,构建原核表达质粒pGEX-1λT-HBD-2。大肠杆菌裂解物经亲合层析纯化后获得分子量约30kDa的融合蛋白,将此融合蛋白免疫新西兰兔,并用正辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,ELISA法显示抗血清对HBD-2的效价为1∶12800,Western印迹显示抗血清可识别HBD-2。本实验结果证明应用重组融合小肽代替白蛋白或甲状腺-肽偶联免疫可获得其高效价的识别HBD-2的多克隆抗体,为今后从蛋白质水平研究HBD-2基因的诱导表达,包括组织分布和基因表达调控等研究打下了基础。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

人致肺纤维化因子的重组表达和抗体制备

目的:进行人致肺纤维化因子的原核和真核表达,并利用原核表达蛋白制备兔抗人致肺纤维化因子多克隆抗体。方法:人致肺纤维化因子为同一基因的一组可变剪切产物,将其共有cDNA序列(ChS)插入质粒pQE-30,构建ChS-pQE表达质粒,转化大肠杆菌M15,表达菌株经IPTG诱导,获得大量不可溶的包涵体蛋白。以之为抗原免疫新西兰大白兔,制备出多克隆抗体。对该多克隆抗体初步检测证明获得较高滴度和较高特异性的抗体,并用Western blot鉴定这组cDNA连接到pcDNA3.1D载体后在真核细胞的重组表达。结果:原核表达的不可溶性重组蛋白也能成功地制备出多克隆抗体。结论:成功地表达了人致肺纤维化因子,并制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体,人致肺纤维化因子的表达和功能研究提供了一条途径。     

CD83重组蛋白的原核表达、复性纯化及多克隆抗体制备北大核心CSCD

目的:利用原核表达系统表达、纯化CD83蛋白,制备CD83多克隆抗体。方法:构建CD83胞外结构域的原核表达质粒,利用TOP10F’菌株表达,使用IPTG诱导并寻找最佳条件;采用0.3%SKL将包涵体溶解变性,透析复性后通过GST亲和层析纯化GST-CD83蛋白;通过QuickAntibody免疫佐剂免疫SD大鼠制备CD83多克隆抗体,ELISA分析抗体的反应活性和特异性。结果:成功构建重组质粒pGEX-2T-CD83(Met1-Arg133),获得最佳诱导条件:0.2 mmol/L IPTG、25℃、O/N。成功获得CD83重组蛋白,免疫大鼠后获得了特异性及活性较高且效价为1∶104~1∶105的多克隆抗体。结论:获得的CD83重组蛋白及多克隆抗体,为后期深入开展CD83蛋白及CD83抗体的免疫抑制特性研究提供支持。     

人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达纯化人星状体病毒（ human astrovirus, HAstV）非结构蛋白nsP1a／1,免疫动物制备多克隆抗体。方法利用PCR技术扩增nsP1a／1基因序列,构建到大肠埃希菌原核表达系统中表达重组nsP1a／1蛋白,使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化,十二烷基磺酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS?PAGE）和二噻啉甲酸（BCA）实验对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,以重组的nsP1a／1蛋白为抗原,免疫雄性SPF级SD 大鼠获得多抗血清,用 ELISA 测定抗体效价、 Western 印迹检测抗体特异性。结果nsP1a／1?pET28a原核表达载体构建成功,将其转化至大肠埃希菌BL21（DE3）细菌中诱导表达了重组蛋白,免疫大鼠获得的多抗血清几何平均效价达到1∶406374。结论本实验成功地运用原核表达系统表达并鉴定了人星状体病毒非结构蛋白nsP1a／1,为进一步研究人星状病毒的复制及病毒感染的临床诊断奠定基础。     

肿瘤睾丸抗原OY-TES-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

目的获得原核表达的OY-TES-1氨基端截短蛋白(OY-TES-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码OY-TES-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/OY-TES-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/OY-TES-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/OY-TES-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。