表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株的构建

目的 采用平衡致死系统构建表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株。方法 PCR扩增幽门螺直菌尿素酶B亚单位,与pYA3149(asd^ ）载体质粒重组,转化减毒的伤寒沙门氏菌突变株,SDS-PAGE,用western-bolt分析其表达,并观察重组菌体外传代培养的稳定性。结果 利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的重组减毒沙门氏菌工程菌株,且在有选择压力的条件下在体外能稳定地繁殖、生长和传代。结论 表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒伤寒沙门氏菌工程菌株的成功构建为发展幽门螺杆菌的口服基因工程疫苗奠定了基础。     

重组尿素酶B亚单位和黏附素双价疫苗对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠的免疫保护作用

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是人慢性胃炎和胃溃疡的病原菌,并与胃腺癌和胃淋巴瘤的发生有密切关系。接种疫苗是预防Hp感染和控制Hp感染相关疾病最为有效的措施,但目前仍无Hp疫苗上市。Hp尿素酶B亚单位(UreB)和黏附素(HpaA)几乎存在于所有Hp临床菌株表面,高度保守且抗原性强。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及其A亚单位的突变体(LTKA6 3)和霍乱肠毒素B亚单位(CTB)有较强的免疫佐剂作用。本文检测了本实验室研制的重组UreB(rUreB)和HpaA(rHpaA)的免疫反应性和抗原性、重组LTB(rLTB)和CTB(rCTB)的佐剂活性,以Hp…     

抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体制备和鉴定及其应用

目的制备抗幽门螺杆菌(Hp)的单克隆抗体(mAb),并对该Hp mAb进行分析鉴定,建立一种检测患者由于Hp感染而在血清中产生Hp抗体的竞争ELISA检测方法。方法用灭活的Hp免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备Hp mAb。我们采用Hp混合蛋白包括毒素相关蛋白A(CagA)、空泡毒素A(VacA)和尿素酶以及灭活的Hp菌体筛选阳性杂交瘤细胞株,用ELISA和Western blot等技术对所获得的Hp mAb进行鉴定。利用辣根过氧化物酶(HRP)标记所筛选的Hp mAb来建立一个可检测患者血清中Hp抗体的竞争ELISA。结果通过大规模的杂交瘤筛选,我们选择了1株将其命名为C3 Hp mAb,其抗体亚型为IgG2a,腹水效价可达1×107。Western blot法、ELISA和质谱检测结果显示,该C3 Hp mAb能特异地识别Hp的尿素酶B亚单位。用这个C3 Hp mAb,我们建立了一种可检测患者血清中Hp抗体的竞争ELISA。结论成功获得一种可以特异识别Hp尿素酶B亚单位的mAb,建立了一种可检测患者血清中Hp抗体的竞争ELISA。     

幽门螺杆菌分子内佐剂三价疫苗的构建、纯化及活性研究

目的构建幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp）中性粒细胞激活蛋白基因napA、黏附素hpaA、尿素酶B亚单位活性功能片段ureB414与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（heat-labile enterotoxin Bsubunit,LTB）的分子内佐剂三价融合蛋白疫苗,并通过13服免疫小鼠研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础。方法利用分子克隆技术构建携带napA-hpaA．ureB414-LTB融合基因的重组原核表达质粒pET-22b-NHUL,转化E．coliB121（DE3）,进行原核表达,重组表达蛋白采用HK26／60Superdex-75分子筛和亲和层析柱Chelating Sepharose进行纯化,Tris-Tricine电泳和Westemblot鉴定,GM1-ELISA检测rNHUL与神经节苷脂的结合。口服免疫Balb／c小鼠,检测重组融合蛋白的抗原性。结果重叠延伸PCR扩增出了约1590bp的NHUL融合基因;其核苷酸序列与GenBank公布的相关序列一致。重组融合蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,表达量约占细菌总蛋白的25％,Tris-Tficine初步测定目的蛋白的肘,约59000,纯化后纯度大于90％。Westemblot检测其具有良好的抗原性。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性。动物实验表明,多亚单位疫苗口服免疫小鼠后血清特异性IgG、IsA和胃黏液、肠黏液的抗原特异性sigA抗体显著高于单一亚单位疫苗。结论所获得重组融合蛋白具有良好的抗原性和黏膜佐剂活性,为进一步的疫苗研究奠定了基础。     

UreA/KatA双价减毒沙门菌疫苗株抗幽门螺杆菌的免疫保护作用

目的探讨由2种幽门螺杆菌(Hp)抗原组合的双价疫苗在防治Hp感染中的作用以及减毒鼠伤寒沙门菌作为传递Hp抗原的活疫苗载体的可行性.方法PCR技术扩增尿素酶A亚单位(ureA)和过氧化氢酶(katA)基因片段,构建表达UreA/KatA融合蛋白的重组质粒,重组质粒宿主菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE和Westernblot分析UreA/KatA的表达情况.将该重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261株中构建重组口服活疫苗株,经口服免疫C57BL/6小鼠,再用Hp悉尼株进行攻击,用快速尿素酶试验和细菌定量培养对胃粘膜中Hp的定植及生长情况进行观察.结果SDS-PAGE电泳图上显示1条相对分子质量(Mr)约108×103的新生蛋白带,占细菌总蛋白的5%,并能与抗GST抗体发生特异性反应.动物实验结果显示,经UreA/KatA双价疫苗免疫的小鼠能有效防御Hp的感染.结论表达UreA/KatA融合蛋白的双价减毒沙门菌疫苗株能诱导抗Hp保护性免疫反应,有望在Hp感染及其相关性疾病的防治中发挥积极作用.     

幽门螺杆菌表位疫苗的设计、构建、表达及其免疫原性研究

目的 设计幽门螺杆菌（Hp）的表位疫苗并对其免疫原性进行研究。方法 将Hp的尿素酶B亚单位的三个Th表位及一个B细胞表位串联,表位之间用两个赖氨酸（KK）间隔,合成全基因,克隆到pET-22b载体上,在大肠杆菌B121（DE3）中表达;表达的重组蛋白经鉴定纯化后皮下免疫Balb／c小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果 克隆表达的重组表位疫苗蛋白纯化后纯度达到95％,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,Th表位多肽（U546-561、U229-244、U237-251）、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖（SI〉2）,并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论 本研究中表位疫苗的设计方法能够使疫苗中包含的四个表位均发挥功能,并且具有较强的免疫原性,为研究Hp预防性和治疗性疫苗提供实验基础。     

特异性抗原幽门螺杆菌尿素酶B的体外表达

目的：建立自患者体内分离的幽门螺杆菌菌株及其抗原尿素酶B(ureB)体外表达的方法。方法：分离培养胃病患者感染的幽门螺杆菌，采用基因体外重组技术分离ureB基因，并经测序鉴定，所表达的抗原蛋白用Western blot进行鉴定。结果：测序结果证实克隆的基因与GeneBank中的序列相符，经Weslern blot证实获得ureB的重组蛋白。结论：获得了高表达的重组抗原蛋白，为ureB检测及Hp感染的诊断提供了物质基础。     

免疫佐剂联合中药治疗Hp感染BALB/c小鼠免疫状态的研究

本文研究用SS1HP株以约10^9／ml的菌液，每次0．4ml／只连续灌喂SPF级BABL／c小鼠4次，10d完成，灌喂后8周经组织学等检查证实全部感染Hp后，随机分成5组，并灌喂：A组尿素酶＋霍乱毒素B亚单位（CTB）＋羟磷灰石（HAP），B组中药胃泰＋尿素酶＋CTB＋HAP，C组单纯中药胃泰，D组尿素酶，E组为空白对照。治疗剂量：尿素酶250mg、CTB4μg、HAP1mg，中药为胃泰胶囊（主要由黄莲、     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位H-2d限制性TH表位的预测与鉴定

目的 鉴定幽门螺杆菌（Hp）尿素酶B亚单位（ureB）的H-2^d限制性TH表位，为研究场表位疫苗奠定实验基础。方法 用RANKPEP软件预测尿素酶B亚单位可能的H-2^d。限制性TH细胞表位，合成表位肽，采用淋巴细胞增殖试验、流式细胞分析及CD4^＋T淋巴细胞增殖试验进行表位鉴定。结果 经软件预测获得7条可能的H-2^d限制性TH细胞表位，多肽合成经分析各表位肽纯度均〉85％，其中3条表位肽U546-561,U229-244,U237-251能够刺激rUreB致敏的BALB／c（H-2^d）小鼠的CD4^＋T淋巴细胞增殖（SI〉2）。结论U546,561,U229-244,U237-251是UreB的H-2^d限制性TH细胞表位，可进一步用于Hp表位疫苗的研究。     

幽门螺杆菌双亚单位表位融合蛋白的构建、表达及鉴定

目的 构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)黏附素(HpaA)和尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(HUepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白(HUepi-LTB),并对其进行纯化和鉴定.方法 采用PCR技术分别扩增HpaA-UreB表位多肽编码基因HUepi和LTB的编码基因LtB,重叠延伸PCR将2段基因拼接起来,T-A克隆后构建融合基因表达质粒pET-22b( )-HUepi-LtB,经酶切鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用阳离子和阴离子交换层析进行纯化,PAGE检测、N端测序和western blotting、ELISA检测、GM1活性检测.结果 成功构建表位串联体(HUepi)与LTB融合蛋白的高效表达质粒pET-22b( )-HUepi-LtB,重组工程菌pET-22b( )-HUepi-LtB/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约20.7×103,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达97 %,免疫学鉴定该融合蛋白与兔抗LTB抗血清可以发生特异性的结合.结论 Hp HpaA-UreB表位串联体(HUepi)与LTB融合蛋白(HUepi-LTB)经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性.为新一代Hp疫苗的研制奠定基础.     

幽门螺杆菌HspA和UreB双价侯选疫苗株的构建

目的 构建表达幽门螺杆菌的组成成分热休克蛋白Ａ亚单位（ＨｓｐＡ）和尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）的重组蛋的白质的侯选菌株。方法 用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌的染色休ＤＮＡ上分别扩增出ＨｓｐＡ和ＵｒｅＢ基因片段,将它们融合插入原核表达载体ｐＥＴ－２３ｂ（＋）中,并在ＢＬ２１（ＤＥ３）大肠杆菌表达。结果 经测序,ＨｓｐＡ－ＵｒｅＢ（ＨＵ）事例基因片段由２０６１ｂｐ组成,为编码６８７个氨基酸残基的多肽。ＳＤＳ－     

人清道夫受体A胞外段的原核表达

目的获得具有生物学活性的人清道夫受体A（SRA）胞外段蛋白。方法从人外周血单个核细胞（PBMC）中提取RNA,逆转录为eDNA,采用PCR技术从PBMC．eDNA中扩增出目的基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a（＋）,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达。包涵体经变性、复性后以Ni—NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,以SDS-PAGE、Western blowing进行分析鉴定。FCM及EHSA方法检测SRA胞外段对ConA诱导PBMC细胞增殖及分泌细胞因子IL-2的影响。结果PCR扩增得到长约1100bp的目的基因片段,插入pET41a（＋）载体所获重组表达载体pET41a—SRAECD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达。表达产物主要以包涵体形式存在。以Ni-NTA亲和层析柱纯化获得约75000Mr的SRA胞外段融合蛋白。纯化的人SRAECD蛋白能与抗人SRA单克隆抗体特异性结合并具有活性,可抑制T细胞增殖及细胞因子IL-2的分泌。结论获得了具有生物学活性的人SRA胞外段蛋白．为进一步探索SRA的效应功能提供了实验材料。     

细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95的构建及其在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达

目的构建细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,并研究该质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达。方法超声粉碎细粒棘球蚴组织提取总RNA,通过RT—PCR扩增Eg95抗原编码基因;克隆至原核表达载体pGEX—1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95;转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β—D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS-PAGE和Western blowing对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出471bp的Eg95抗原编码基因;双酶切证实Eg95抗原编码基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约42500的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的21％;Western blot鉴定显示重组蛋白能被细粒棘球蚴感染鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,该质粒在大肠杆菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

乳腺癌特异性转导小肽融合表达载体的构建以及目的蛋白的表达

目的构建乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化。方法合成PI的DNA序列,将其定向插入到p EGFPN2中,经双酶切获取PI-EGFP的核苷酸序列,再将其克隆入原核表达质粒pET-28a(+),构建出pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;重组质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导表达,利用His-tag对蛋白进行分离纯化,SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹免疫分析(Western blot)鉴定纯化蛋白质。结果成功构建了pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;其经诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以可溶性形式存在;SDS-PAGE分析显示,在相对分子量约33kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经His TALONTM Cartridge亲和层析纯化获得了高纯度的重组的PI-EGFP融合蛋白,Western blot鉴定结果显示获得了目的蛋白。结论成功构建出乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白原核表达载体,并能够表达出PI-EGFP的融合蛋白,为进一步研究小肽的乳腺癌特异性转导功能奠定基础。     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的:构建人CIDE-3基因的原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA,经RT-PCR扩增人CIDE-3基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a( )中,构建重组质粒pET28a( )-CIDE-3。经限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得全长为516bp的人CIDE-3基因片段。以构建的重组质粒pET28a( )-CIDE-3转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为23000的重组CIDE-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21(DE3)的胞质中,表达量约占全菌蛋白的32%。结论:成功地构建了原核表达载体pET28a( )-CIDE-3,并表达出重组CIDE-3蛋白,为进一步多克隆抗体的制备和凋亡的相关研究奠定了实验基础。     

十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白（Ad-FAR-1）基因的克隆及原核表达

目的克隆十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白（Ad-FAR-1）基因并在大肠杆菌中表达。方法运用3′RACE及RT-PCR技术分别扩增Ad-FAR-1 cDNA部分片段,获得序列经拼接后利用在线BLAST程序检索GenBank中相似的核酸序列及推导的氨基酸序列;设计引物,将Ad-FAR-1成熟肽编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。结果成功克隆到Ad-FAR-1全长cDNA序列并构建了pET32a/Ad-FAR-1原核表达重组质粒,Ad-FAR-1融合蛋白在大肠中得到了高效表达。结论成功获得并表达了十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白（Ad-FAR-1）基因,为进一步研究该蛋白的特性与功能奠定了基础。     

尿激酶型纤溶酶原激活因子cDNA的克隆与原核表达

目的构建尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21中表达,为进一步研究uPA奠定基础。方法应用逆转录RT—PCR,从人肝细胞cDNA中扩增人尿激酶型纤溶酶原激活因子基因序列,与原核表达质粒pET32a重组,获得表达质粒uPA—pET32a。用氨苄青霉素平板筛选转化子。双酶切与DNA测序进行鉴定,用IPTG诱导表达,并用Westernblotting进行鉴定。结果从肝细胞cDNA中扩增的uPA基因片段长1296bp,酶切及DNA测序证实uPA-pET32a重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为68900Mr,经Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒uPA—pET32a。并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期的相一致．为进一步的研究奠定了基础。     

人胃癌组织中期因子的克隆表达及其对NIH3T3细胞生长促进作用

根据GenBank报道的序列,设计一对引物,通过RT-PCR从胃肿瘤患者肿瘤组织中获得了Midkine(MK)成熟肽DNA编码序列,与pMD18T-vector连接测序后,将该片段克隆入大肠杆菌表达载体pET30(a+)中,转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),筛选得到可诱导表达MK重组蛋白的工程菌株pEMK,经IPTG低温诱导表达产生的总可溶蛋白用Heparin结合的亲和柱纯化,并用MTT法验证表明大肠杆菌表达产生的可溶性MK蛋白具有促进NIH3T3细胞增殖的作用。     

日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST—Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST—Sj32,分析该质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达情况。方法超声粉碎日本血吸虫成虫提取总RNA,通过RT—PCR扩增获得Sj26GST和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法（geneSOEing）剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST—Sj32融合基因,克隆至原核表达载体pET32α（＋）,构建重组质粒pET32α一Sj26GST—Sj32,转化人大肠埃希菌BL21（DE3）,经异丙基硫代-β—D．半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS—PAGE和Westem—blot对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出约1991bp的Sj26GST—Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST—Sj32融合基因成功插入pET32α（＋）中,SDS—PAGE分析显示表达产物为分子质量约82000Mr的重组蛋白．与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的22％：Western—blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET32α一Sj26GST—Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原一件     

人Toll 样受体-9胞外区N端蛋白的表达及其抗体的制备

目的:构建人Toll样受体-9(hTLR-9)基因5′端序列的表达质粒,在大肠杆菌中表达,并以表达的hTLR-9-N免疫小鼠制备抗体。方法:构建hTLR-9基因5′端(707~1167bp)的硫氧还蛋白(thioredoxin)融合表达质粒pET32a-hTLR-9-N。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,在0.5mmol/LIPTG诱导下表达。表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。以8mol/L尿素溶解的包涵体作为免疫原,免疫昆明种小鼠制备抗hTLR-9-N的抗体。结果:融合表达质粒pET32a-hTLR-9-N在E.coliBL21(DE3)中以相对分子质量(Mr)为31000的包涵体形式表达;Westernblot分析证明hTLR-9-N在大肠杆菌中得到正确表达。表达的目的蛋白初步纯化后的纯度达90%以上;以hTLR-9-N为抗原制备的抗血清效价为1∶25600;该抗血清可以与转染后稳定表达全长hTLR-9的HEK293细胞产生结合反应。结论:成功地在大肠杆菌中表达hTLR-9N末端蛋白,制备的抗hTLR-9-N抗体可特异性结合表达全长hTLR-9的真核细胞。