人胎盘组织来源造血干/祖细胞及其特性

背景:近年来的研究表明,除已知的人骨髓、外周血和脐带血中存在造血干/祖细胞外,人胎盘组织中也有造血干/祖细胞存在.目前为止,还缺乏对人胎盘组织造血干/祖细胞的增殖分化特性及人胎盘组织淋巴细胞亚群组成和免疫原性等的深入研究.目的:探究人胎盘组织是否含有比脐带血更丰富的造血干/祖细胞,并对其造血祖细胞系增殖分化能力进行检测,同时对人胎盘组织淋巴细胞亚群组成及表型特征进行分析.设计、时间及地点:开放性实验,于2004-01/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.材料:经产妇知情同意,无菌采集遵义医学院附属医院产科健康足月分娩新生儿胎盘和脐带血共12份.淋巴细胞亚群检测试剂盒,CD34绝对计数试剂盒(Becton Dickinson公司):CD34磁珠分选试剂盒,FITC标记的CD38单克隆抗体,抗FITC磁珠和MS/LS免疫磁式细胞分选柱(Miltenyi Biotec).方法:脐带血与RPMI-1640培养基(含体积分数为0.1的胎牛血清)按1:1的比例混合,采用Ficoll-Histopaque分离液离心30min,吸取界面层细胞,PBS洗涤一次,获得脐带血单个核细胞.采用机械法加0.25g/L胶原酶消化制备胎盘组织单个细胞悬液,之后同脐带血单个核细胞分离步骤分离胎盘单个核细胞.流式细胞仪检测胎盘单个核细胞中CD34 CD38-, CD34 CD38 造血干/祖细胞(HSPCs)和淋巴细胞亚群的组成比例.免疫磁珠分选法分选人胎盘CD34 CD38-,CD34 D38 造血干/祖细胞,并分别进行粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位系集落形成培养,以评价其造血祖细胞系增殖分化能力.实验全程用脐带血作平行比较分析.主要观察指标:胎盘和脐带血CD34 造血干/祖细胞组成百分率、祖细胞系集落形成能力、淋巴细胞亚群表型及组成特点.结果:[1]胎盘CD34 造血干/祖细胞百分率是脐带血的8.8倍,差异有显著性意义(P<0.01).[2]胎盘中的淋巴细胞总数、T细胞(CD3 CD2 )、B细胞(CD19 )、Th(CD3 CD4 )细胞及Th/Ts比值均明显低于脐带血,而CD8 CD28-T抑制细胞则明显高于脐带血,差异有显著性意义(P<0.01).[3]胎盘CD34 CD38 造血干/祖细胞亚群培养形成的粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位集落数明显高于CD34 CD38-造血干/祖细胞亚群(P<0.01);胎盘与脐带血造血干/祖细胞中相同表型细胞亚群形成的各系集落数比较,差异无显著性意义(P0.05).结论:人胎盘组织富含CD34 造血干/祖细胞,其CD34 CD38 、CD34 CD38-两个造血干/祖细胞亚群均具有增殖分化为粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位的能力,并且人胎盘组织具有淋巴细胞亚群低比例和抑制性T细胞高比例的特点,使其有望成为造血干/祖细胞移植的新来源.     

人胎盘造血干/祖细胞的增殖分化能力

近年来有研究表明，人胎盘组织富含造血干细胞，而且其CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋造血干／祖细胞（HSPC）的百分率明显高于脐血。但有关人胎盘组织CD34^＋HSPC亚群的增殖分化能力的研究却未见报道。我们采用免疫磁珠分选人胎盘组织CD34^＋CD38^-和CD34^＋CD38^＋HSPC亚群，并用不同培养体系进行血细胞集落培养，以评价其增殖分化能力。     

人胎盘与脐动、静脉血造血干/祖细胞归巢相关黏附分子表达的研究

为了评价人胎盘组织造血干/祖细胞(hematopoieticstem/progenitorcell,HSPC)的归巢能力,采用机械法制备人胎盘组织单个细胞悬液,用流式细胞术分析胎盘组织及脐动、静脉血有核细胞中CD34+细胞及其亚群的含量,检测三者来源的CD34+细胞表面归巢相关黏附分子CD44、CD11a、CD62L、CD49d、CD49e和CD54的表达水平。结果显示,胎盘组织CD34+细胞及CD34+CD38-细胞百分率明显高于脐动、静脉血;脐动脉与脐静脉血中HSPC百分率没有明显差异。胎盘来源CD34+细胞高度表达黏附分子CD11a、CD49d、CD44、CD49e及CD54,其中表达CD49e及CD54水平明显高于脐动、静脉血CD34+细胞。胎盘来源的CD34+CD62L+细胞百分率为(64.58±15.52)%,低于脐静脉血来源的表达。结论:人胎盘富含HSPC。胎盘来源的CD34+细胞多数黏附分子的表达水平近似或高于脐血,提示胎盘HSPC的归巢能力有可能强于脐带血。     

人胎盘组织造血干/祖细胞的分离富集

为了探索从胎盘组织中分离富集造血干/祖细胞(HSPC)的标化流程,采用机械法加胶原酶消化法制备人胎盘组织单个细胞悬液,用羟乙基淀粉(6%HES)法从中分离出单个核细胞(MNC),再经免疫磁珠分选法分选出CD34-、CD34+CD38-、CD34+CD38+3个细胞亚群,用流式细胞术对各阶段分选细胞进行表型分析并计算分选细胞的富集度和回收率。结果表明:机械法加胶原酶消化法制备的人胎盘组织单个细胞悬液中单个核细胞(MNC)数达(12.30±3.51)×108,与脐血初始样品所含的MNC数(8.86±5.38)×108比较差异无统计学意义,而其CD34+细胞所占百分率[(3.93±2.31)%]则明显高于脐血[(0.44±0.29)%]。胎盘组织单个细胞悬液经6%HES分离后MNC和CD34+细胞的回收率分别为(45.3±11.7)%和(51.1±9.8)%;MNC经免疫磁珠分选后,其CD34+细胞的纯度和回收率分别为(73.4±14.1)%和(52.7±11.7)%。结论:本实验所建立的"机械法加胶原酶消化法-HES分离MNC-MACS分选目标细胞"的分离纯化方法可从胎盘组织获得高丰度、高富集度、高活性的HSPC,为进一步研究胎盘HSPC提供了比较经济、效果较好的分离富集方案。     

脐血造血干/祖细胞免疫表型的流式细胞术双标法分析及其意义

目的比较脐血和骨髓中造血干/祖细胞(HSPC)的免疫表型差异.方法使用流式细胞术(FCM)双标法对38份脐血及10份骨髓HSPC进行免疫表型分析.结果①脐血有核细胞中CD34+细胞所占比例与骨髓中相近,约为0.5%;②脐血CD34+细胞中CD34+CD38-[(17.C4±5.37)%]、CD34+HLA-DR-[(32.65±10.71)%]及CD34+H-CAM+(CD44+)[(77.84±7.69)%]亚群含量均高于骨髓[含量分别为(8.26±3.19)%、(14.05±1.67)%和(70.02±6.40)%],CD34+CD13+、CD34+CD19+亚群比例低于骨髓.结论脐血与骨髓CD34+细胞比例相近,但前者较原始的干细胞含量更高,故脐血是极具潜力的HSPC来源;而脐血CD34+细胞中髓系及淋系祖细胞含量低于骨髓,可能是脐血移植后造血及免疫重建缓慢的原因之一.     

手足口病并发脑炎患儿外周血淋巴细胞亚群变化的临床研究

目的:研究手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)并发脑炎患儿外周血淋巴细胞亚群的变化,以探讨其免疫功能改变与疾病的关系。方法:收集2014年12月至2015年5月徐州市儿童医院收治的57例手足口病患儿的临床资料,根据病情严重程度分为手足口病并发脑炎组34例和手足口病未并发脑炎组23例,以20例同期进行腹股沟疝外科手术的儿童为对照组。应用流式细胞仪检测外周抗凝全血的淋巴细胞亚群:T淋巴细胞(CD3+CD19-)、辅助T细胞Th(CD3+CD4+)、抑制T细胞Ts(CD3+CD8+)、B淋巴细胞(CD3-CD19+)和NK细胞(CD3-CD56+/CD16+)的相对计数。结果:手足口病并发脑炎组患儿外周血T淋巴细胞(CD3+CD19-)、辅助T细胞Th(CD3+CD4+)、抑制T细胞Ts(CD3+CD8+)的百分率下降,明显低于手足口病未并发脑炎组及对照组(P0.05);B淋巴细胞(CD3-CD19+)的百分率较其它2组明显增高(P0.05);但手足口病未并发脑炎组与对照组之间辅助T细胞Th(CD3+CD4+)、抑制T细胞Ts(CD3+CD8+)、B淋巴细胞(CD3-CD19+)的差异无统计学意义(P0.05)。手足口病并发脑炎组及手足口病未并发脑炎组NK细胞(CD3-CD56+/CD16+)百分率均高于对照组(P0.05);但二者之间差异无显著性统计学意义(P0.05)。结论:手足口病患儿特别是合并有脑炎的重症手足口病患儿存在明显的免疫功能低下及免疫调节紊乱。     

自身免疫病患者造血干细胞移植后Ts及Tc细胞的变化

目的检测严重自身免疫病(SAID)患者自体造血干细胞移植(AHSCT)前后外周血中抑制性T(Ts)细胞、杀伤性T(Tc)细胞亚群的变化,探讨Ts、Tc细胞在AHSCT诱导自身免疫病缓解中的作用。方法使用流式细胞术(FCM)检测对照组及SAID患者AHSCT前1周及AHSCT后1~3月外周血中Ts、Tc细胞亚群。Ts细胞表型为CD3 CD8 CD28-,Tc表型为CD3 CD8 CD28 。分析各细胞亚群占T淋巴细胞的百分率,并比较AHSCT前后Ts、Tc的变化。结果SAID患者AHSCT前Ts与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),Tc高于对照组(P<0.05)。AHSCT前后比较,患者外周血中Ts细胞显著增高(P<0.05);Tc虽有下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。AHSCT后与对照组比较,Ts显著增高(P<0.05),Tc差异无统计学意义。结论AHSCT治疗SAID患者,能显著提高患者Ts细胞,降低Tc细胞的比例,是AHSCT诱导SAID缓解的机制之一。     

严重急性呼吸综合征患者淋巴细胞及其亚群的表型分析

目的 研究严重急性呼吸综合征(SARS)患者淋巴细胞及其亚群的表型变化，以期为SARS的诊断治疗提供新的监测指标。方法 采用多色流式细胞术结合血液分析仪测定38例SARS患者外周血淋巴细胞及其亚群的表达情况。结果 84％的患者其淋巴细胞绝对计数降低。各类淋巴细胞亚群[T／B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞]的绝对计数均有不同程度的降低，其中T细胞降低者最多(占95％)；在T细胞中，T辅助／诱导细胞(T4)降低者(100％)高于T抑制／杀伤细胞(T8)(87％)。从各类淋巴细胞分布看，T淋巴细胞百分率下降者最多(占58％)；B细胞和NK细胞百分率以相对正常或升高为主，相对下降者均很少，分别占2．6％和5．3％；在T细胞中，T4细胞的百分率降低者(82％)高于T8细胞降低者(34％)，二者比值降低者占44％。结论 SARS患者的淋巴细胞及其各亚群均受到破坏，以T淋巴细胞受损为主，且T4细胞较T8细胞受损严重；淋巴细胞亚群的绝对计数变化较相对计数更明显。     

人胎盘组织源造血干/祖细胞的初步研究

为了探讨足月胎盘组织源单个核细胞(human mature placenta tissue-derived mononuclear cells,hPTMNC)中CD34+细胞的体外增殖、分化能力,寻找新的造血干/祖细胞来源供临床应用,分别采用流式细胞术检测、造血干/祖细胞集落培养和体外无细胞因子长期培养的方法,测定胎盘组织源和脐血中的CD34+细胞及其亚群和集落形成单位的数量。结果表明:胎盘组织源CD34+细胞(2.74±0.61%)及其亚群CD34+/CD38-细胞(2.46±0.42%)、造血干/祖细胞集落CFU-GM(186.90±24.52)和BFU-E(101.40±13.35)水平都较脐血CD34+细胞(1.73±0·32%)、CD34+/CD38-细胞(0.80±0.25%)、CFU-GM(136.90±25.15)、BFU-E(49.20±8.13)高;前者在体外无细胞因子培养条件下存活时间长,且细胞数量增加约2倍。结论:胎盘是胎儿期的造血器官,胎盘细胞成分更幼稚,是一种造血干/祖细胞移植的新的种子细胞。     

反复呼吸道感染儿童T淋巴细胞亚群的变化

目的研究儿童反复呼吸道感染(RRTI)时T淋巴细胞亚群的变化。方法采用流式细胞术检测RRTI患儿(观察组)和健康儿童(对照组)外周血T淋巴细胞亚群的表达水平。结果观察组CD3+、CD4+与CD8+T细胞百分率分别为(61.82±7.25)%、(32.87±6.73)%及(20.39±3.72)%,均明显低于对照组(P<0.01);CD4+/CD8+比值(1.65±0.42)显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RRTI患儿存在细胞免疫功能紊乱,表现为CD3+、CD4+/CD8+T细胞比例下降和CD4+、CD8+上升。流式细胞术检测T淋巴细胞亚群可用于快速、简便、准确评估患儿的免疫功能状况。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者外周血T淋巴细胞亚群及活化分子表达的研究

目的　探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (PNH)患者T淋巴细胞的功能及活化状态与PNH临床的关系。方法　应用流式细胞术及免疫磁珠分选术 ,测定了 18例PNH患者外周血单个核细胞 (PBMNC)及CD59+ 和CD59-PBMNC中CD3 + 、CD4+ 及CD8+ 细胞表型 ,并测定了新诊断的未经治疗的 6例PNH患者外周血中NK细胞及CD4+ CD2 8+ /CD4+ 、CD8+ CD2 8+ /CD8+ 、CD4+ HLR DR+ /CD4+ 、CD8+HLR DR+ /CD8+ 及CD8+ CD3 8+ /CD8+ 淋巴细胞表面分子表达比值。结果　PNH患者PBMNC中CD3 +CD8+ /CD3 + CD4+ 细胞比值增加 ,为 1.2 2± 0 .5 1,对照组为 0 .86± 0 .2 7,两者比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。分选后PNH患者CD59-PBMNC中CD3 + CD8+ /CD3 + CD4+ 细胞比值增加 ,为 2 .31± 1.5 6 ,CD59+PBMNC为 0 .6 2± 0 .2 7,两者比较 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 1)。CD3 + CD8+ /CD3 + CD4+ 细胞比值与骨髓衰竭 (BMF)的级差相关分析呈正相关。PNH患者CD4+ CD2 8+ /CD4+ 细胞比值明显减少 ,为 0 .5 2±0 .11(对照为 1.0 0± 0 .0 6 ) ,而CD8+ HLR DR+ /CD8+ 增加 ,为 0 .4 5± 0 .2 6 (对照为 0 .10± 0 .0 6 )。结论　PNH患者CD3 + CD8+ /CD3 + CD4+ 细胞比值增加 ,病变表型细胞更易发生在CD8+ 细胞群中。CD4+ 细胞中CD2 8+ 辅助刺激因     

人脐血造血细胞扩增后表面标志的动态研究

目的 探讨脐血造血细胞体外扩增及其移植的最佳时机。方法 用粒细胞集落刺激因子、粒－巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素３、重组白细胞介素６、干细胞因子和红细胞生成素长期培养脐血造血细胞,并对其表面标志及细胞增殖周期进行动态分析。结果 脐血中ＣＤ３＾＋细胞、ＣＤ４＾＋／ＣＤ４５ＲＯ＾＋和ＣＤ８＾＋／ＣＤ４５ＲＯ＾＋细胞培养３ｄ稍有增加,培养７ｄ达高峰,１４ｄ显下降,培养２１ｄ时处于更低水平。ＣＤ     

脐血干/祖细胞短期体外扩增后归巢相关粘附特性的研究

探讨体外扩增对脐血（UCB)造血干／祖细胞(HSPC)原有粘附功能的影响。将从新鲜UCB标本中纯化的CD34^ 细胞接种于无血清、无基质的悬浮扩增体系，分别于培养第7天、第10天和第14天从扩增产物中再次纯化CD34^ 细胞，比较扩增前后CD34^ 细胞表面VLA—4(CD49d)、VLA—5(CD49e)、LFA—l(CDlla)、L-selecin(CD62L)、PECAM—l(CD3l)、ICAM—l(CD54)和HCAM(CD44)等归巢相关粘附分子(SAMs)的表达情况，并检测CD34^ 细胞与纤连蛋白(FN)间的自发粘附率和基质细胞来源因子—l(SDF—1)诱导粘附率。①在第14天的培养扩增中，表达上述CAMs的各CD34^ 细胞亚群均有不同程度(15～72倍)的扩增；②扩增后CD34^ 细胞表面粘附分子CD44、CD11a、CD49e和CD49d的表达与原代CD34^ 细胞持平或高于培养开时水平，而CD62L、CD54和CD31的表达则有不同程度下调；③在前10d的扩增中，CD34^ 细胞与FN间的自发粘附率和SDF—l诱导粘附率均呈上升趋势。所建立的短期培养体系不仅可以支持表达重要CAMs的UCB CD34^ 细胞亚群的有效扩增，而且扩增后的HSPC总体上保持原有的粘附功能。     

体外扩增脐血CD34+细胞的实验研究

目的 探讨体外扩增脐血干／祖细胞用于成人脐血移植的可能性。方法 从１０份新鲜的脐血标本中纯化的ＣＤ３４＾＋细胞接种于含体积分数为２０％的胎牛血清（ＦＢＳ）的ＩＭＤＭ培养基的悬 培养体系中,分别加入由ＳＣＦ、Ｆｌｔ－３Ｌｉｇａｎｄ（ＦＬ）与ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ、Ｅｐｏ（合称１３６ＧＥ）组成的３组细胞因子（Ａ组：１３６ＧＥ＋ＦＬ;Ｂ组：ＳＣＦ＋１３６ＧＥ;Ｃ组：ＦＬ＋ＳＣＦ＋１３     

造血微环境决定脐血造血干/祖细胞的早期分裂行为

目的 在特定生长因子的培养体系中，观察模拟造血微环境及粘附因素对人类脐血造血干/祖细胞早期分裂行为影响。方法 （1）应用流式细胞仪（FACS）分选CD34^ CD38^-细胞；（2）细胞培养体系中应用干细胞支持性基质AFT024及单一粘附因素纤维结合素（Fn)。并观察其对细胞早期分裂行为的影响。结果 （1）在联合生长因子的条件下，人类脐血CD34^ CD38^-细胞早期分裂呈现固定比例的静止，慢分裂，快分裂以及不对称分裂状态；（2）未观察到单一粘附因子Fn对其早期分裂行为的影响；（3）干细胞支持性基质AFT024所模拟的体外造血微环境可促使脐血造血干/祖细胞广泛增殖并更多地进行不对称分裂。结论 （1）CD34^ CD38^-细胞群体具有异质性。由具有不同增殖行为的亚群组成，在体外培养早期存在不对称分裂；（2）体外模拟的骨髓微环境AFT024基质滋养层较细胞因子及单一粘附因素能够更好地支持造血干/祖细胞的增殖并保持其自我更新的特性。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34+CD59+细胞与CD34+CD59-细胞生物学性能的研究

目的 探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患CD34^ CD59^ 细胞的特性及PNH克隆呈优势造血的可能原因，以探索PNH发病的内在机制。方法 用免疫磁珠吸附法富集纯化CD34^ 细胞，再用流式细胞仪分选出PNH患的CD34^ CD59^ 细胞、CD34^ CD59^ 细胞及正常对照CD34^ 细胞。分别进行体外扩增液体培养2周，并对扩增前、后的细胞进行半固体培养。结果 ①PNH患CD34^ CD59^ 细胞与正常对照CD34^ 细胞形成集落形成单位(CFU)均在第7天达到扩增高峰，并且扩增后的细胞仍能保持CD59抗原，无GPI锚连蛋白的丢失。②正常对照的CD34^ 细胞在生存、增殖、形成CFU及扩增能力上均明显强于FHN患的CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^-细胞.③PNH患CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^ 细胞体外半固体培养，其形成CFU的能力无明显差异。④PNH患CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^ 细胞在SCF IL3 IL6 FL Tpo及SCF IL3 IL6 FL Tpo Epo组合下液体培养，其生存、增殖、扩增等能力上均无明显差异。但在SCF IL3 IL6 FL Tpo Epo GM-CSF组合下液体培养，CD34^ CD59^ 细胞的生存、增殖、扩增能力均明显强于CD34^ CD59^ 细胞。结论 ①正常对照的CD34^ 细胞在生存、增殖、形成CFU及扩增能力上均明显强于PNH患的CD34^ CD59^ 细胞。②PNH患CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^ 细胞体外半固体培养，以及在SCF IL3 IL6 LF Tpo及SCF IL3 IL6 FL Tpo Ep组合下液体培养，其生存、增殖、扩增等能力上均无明显差异，说明CD34^ CD59^ 细胞在造血能力上并无内在的优势。GM—CSF或许是使PNH克隆呈造血优势的原因之一。