骨巨细胞瘤TIMP-3启动子甲基化的研究

目的 检测骨巨细胞瘤(GCT)中TIMP—3启动子甲基化及其蛋白表达，探讨该肿瘤组织TIMP—3蛋白表达缺失的原因和TIMP-3启动子甲基化与GCT分级和复发的关系。方法 用免疫组织化学SP法和蛋白免疫印迹检测TIMP—3在GCT组织中的表达，用甲基化特异的PCR(MSP)法检测TIMP—3基因启动子的甲基化状态。结果 TIMP—3主要在单核基质细胞和多核巨细胞的胞质表达，后者的表达具有明显的极向性。17例GCT中有5例(29．4％)TIMP—3蛋白丢失，其中4例的TIMP—3启动子发生异常甲基化，且均为组织学分级为Ⅱ级的病例。结论 GCT的局部骨质破坏，可能与TIMP—3丢失有关；而TIMP—3启动子的异常甲基化，是TIMP—3基因失活和蛋白丢失的重要机制。     

白血病Reh、HL-60、K562细胞系RUNX 3 基因P2启动子甲基化状态与RUNX 3 基因表达

目的: 研究人白血病Reh、HL-60与K562细胞系RUNX 3 基因P2启动子甲基化状态及RUNX 3 基因的表达,分析P2启动子甲基化与基因表达之间的关系。方法: 运用甲基化特异性PCR(MSP)和RT-PCR检测Reh、HL-60与K562细胞系RUNX 3 基因P2启动子的甲基化状态及RUNX 3 基因的表达。结果: Reh及K562细胞系RUNX 3 基因P2启动子甲基化特异性扩增呈阳性,非甲基化特异性扩增呈阴性,RT-PCR扩增呈阴性;而HL-60细胞系相反,甲基化特异性扩增呈阴性,而非甲基化特异性扩增呈阳性,RT-PCR扩增阳性。结论: Reh及K562细胞中存在RUNX 3 基因P2启动子的甲基化,且在不同类型白血病细胞系中的甲基化状态不同。     

非小细胞肺癌组织中抑癌基因RUNX3 启动子甲基化与肿瘤侵袭相关基因E-Cad、MMP-7 和TIMP-1 蛋白表达的关系

目的:探讨非小细胞肺癌组织中抑癌基因RUNX3启动子甲基化与肿瘤侵袭相关基因E-Cad、MMP-7和TIMP-1蛋白表达的关系。方法:收集并分析我院2017年1月至2018年1月期间收治入院的65例非小细胞肺癌患者组织,采用巢氏甲基化特异性PCR(n MSP)法检测RUNX3启动子甲基化情况;链霉菌素-生物素过氧化物酶(S-P)染色法检测肿瘤侵袭相关基因E-Cad、MMP-7和TIMP-1蛋白表达并计数,并回顾性分析RUNX3启动子甲基化状态与临床病理特征、肿瘤侵袭相关基因表达的关系。结果:65例NSCLC组织样本中有27例出现RUNX3启动子的甲基化(41. 54%)。RUNX3启动子甲基化与病理类型有关,腺癌(81. 48%)高于鳞癌(18. 52%,P=0. 003);且与临床分期有关(P=0. 003),主要分布于Ⅲ期(55. 56%)和Ⅳ期(33. 33%)。S-P染色并计数结果显示,E-Cad、MMP-7和TIMP-1蛋白表达阳性率分别为56. 92%、46. 15%和52. 31%;且在RUNX3基因启动子甲基化组中阳性表达率与非甲基化组中阳性率相比差异均具有统计学意义(P0. 05)。结论:RUNX3基因启动子的甲基化与NSCLC的侵袭和转移密切相关,有望为NSCLC的临床诊疗提供新的思路。     

不同分子亚型乳腺癌细胞系中RUNX3蛋白表达及定位研究

目的:检测人类Runt相关转录因子3(RUNX3)在不同分子亚型乳腺癌细胞系中的表达及其亚细胞定位情况,为进一步揭示RUNX3的失活机制和发现新的治疗靶点提供理论依据。方法:在5种乳腺癌细胞(MCF-7、T47D、SKBR-3、MDA-MB-231和BT-549)及正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)中,通过Western blot和免疫荧光实验检测RUNX3的蛋白表达和亚细胞定位情况;采用来普霉素B(Leptomycin B)抑制RUNX3的出核,利用CCK-8法检测细胞活力的改变,EdU染色检测细胞增殖情况,Western blot和免疫荧光实验检测RUNX3的蛋白表达和亚细胞定位的改变。结果:与MCF-10A细胞相比,5种乳腺癌细胞系中RUNX3的核定位减少、胞浆定位增多。经Leptomycin B处理后,CCK-8实验结果显示5种乳腺癌细胞的活力明显减弱,EdU染色显示5种乳腺癌细胞增殖能力明显降低,Western blot和免疫荧光实验显示5种乳腺癌细胞胞浆中的RUNX3蛋白表达量明显降低、胞核中的RUNX3蛋白表达量明显增多(P0.05)。结论:不同分子亚型乳腺癌细胞中均存在RUNX3的胞浆转位失活现象,针对性地逆转RUNX3的出核过程可以明显降低肿瘤细胞的活力和增殖能力,可能成为乳腺癌潜在的治疗靶点。     

骨髓增生异常综合征与白血病细胞p15INK4B基因甲基化及机制研究

目的:探讨p15INK4B基因甲基化异常和血液系统肿瘤发病的关系及甲基化异常的机制。方法:采用RT-PCR、甲基化特异PCR、Western blot法检测20例骨髓增生异常综合征(MDS)、20例急性白血病患者(AL)、14例慢性粒细胞性白血病(CML)患者骨髓单个核细胞p15INK4B基因 mRNA和p15INK4B蛋白的表达、p15INK4B基因甲基化及甲基转移酶(DNMTs)的表达。结果:高危组MDS患者p15INK4B蛋白表达阳性率低于低危组MDS患者(10% vs 80%,P<0.01),p15INK4B基因甲基化阳性率较高(60% vs 10%,P<0.01)。20例AL有9例(45%)存在p15INK4B基因甲基化。10例CML慢性期(CML-CP)患者仅1例存在p15INK4B基因甲基化。4例CML急变期(CML-BP)患者均检测到p15INK4B基因部分甲基化。DNMT_3A、DNMT_3B表达在AL、高危组MDS和CML-BP患者均明显高于低危组MDS(P<0.05)。结论:p15INK4B基因甲基化在AL、高危组MDS和CML-BP患者发生率高于低危组MDS,伴有甲基转移酶DNMT_3A、DNMT_3B表达较高。p15INK4B基因甲基化可能参与MDS和AL的发病机制并与MDS 及CML的预后有关。     

胃癌中RUNX3、cyclin E和P21蛋白表达与患者生存的关系

目的：探讨胃癌RUNX3蛋白表达对细胞周期蛋白的影响及其与胃癌患者生存和生物学特性的关系。方法:应用免疫组化，分析RUNX3蛋白的表达；应用流式细胞术，分析cyclinE和P21蛋白表达；采用Kaplan-Meier限乘法计算生存率。结果:在56例胃癌中RUNX3蛋白、cyclinE和P21蛋白的阳性表达率分别为44.6%、64.3%和32.1%。胃癌细胞RUNX3蛋白表达与淋巴转移和远处转移有关(P<0.05)。胃癌细胞cyclinE的表达与浸润深度、淋巴转移和远处转移有关(P<0.05)。而胃癌细胞P21的表达与远处转移有关(P<0.05)。胃癌细胞中RUNX3和P21的表达之间呈明显正相关(r=0.57,P<0.05)，而与 cyclinE的表达之间无相关性(r=0.25,P>0.05)。用Kaplan-Meier生存曲线经Log-rank检验发现，RUNX3和cyclinE的阳性表达与生存相关(P<0.05)，P21的阳性表达与生存无关(P>0.05) 。结论：RUNX3蛋白可能通过影响P21蛋白的表达影响胃癌的发生发展；检测RUNX3和cyclinE的表达可作为反映胃癌临床病理学特点和预后的指标。     

SHP-1和JAK1基因在初治急性白血病患者中的表达

目的：探讨SHP-1和JAK1基因在初治急性白血病（AL）细胞的转录表达及其与初治AL患者化疗效果的关系。方法：采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测60例初治AL患者骨髓单个核细胞及20例健康人外周血单个核细胞中SHP-1和JAK1 mRNA的表达。结果：60例初治AL患者SHP-1和JAK1的mRNA表达阳性率分别为30%，100%；初治AL患者SHP-1 mRNA表达水平明显低于正常对照组（P<0.001），JAK1 mRNA表达水平较正常对照组略增高，但差异无统计学意义（P=0.180）,初治AL患者SHP-1 mRNA阳性组的诱导化疗完全缓解（CR）率为88.9%，阴性患者组CR率为54.8%，差异有统计学意义（P=0.005）。SHP-1与JAK1 mRNA表达呈负相关（P=0.046）。结论：SHP-1可能是白血病潜在的抑制基因，可望作为判断初治急性白血病患者疗效和预后的指标。     

急性淋巴细胞白血病患者GLUT3、TSLC1的表达及临床意义

目的:探讨急性淋巴细胞白血病患者葡萄糖转运蛋白-3(Glucose transporter 3,GLUT3)、肿瘤抑制物1(Tumor suppressor in lung cancer 1,TSLC1)的表达及临床意义.方法:选取2018年4月至2020年4月期间我院诊治的59例急性淋巴细胞白血病患者作为研究对象的研究组,另选取53例同期非急性淋巴细胞白血病患者作为研究对象的对照组.比较两组患者骨髓单个核细胞中GLUT3、TSLC1的表达情况,以及患者的不同临床病理特征对骨髓单个核细胞中GLUT3、TSLC1表达的影响.结果:研究组GLUT3阳性表达率高于对照组、TSLC1阳性表达率低于对照组(P<0.05);血红蛋白(异常)、白细胞计数(异常)者GLUT3阳性率明显高于血红蛋白(正常)、白细胞计数(正常)者(P<0.05).白细胞计数(异常)者TSLC1阳性率明显高于白细胞计数(正常)者(P<0.05).结论:在急性淋巴细胞白血病患者骨髓单个核细胞中GLUT3阳性表达率高、TSLC1阴性表达率高.     

急性髓系白血病中DLX4基因异构体的差异性表达及其临床相关性分析

目的探索DLX4基因异构体在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)中的表达与甲基化态势及其临床意义。方法采用RT-qPCR法检测37例健康骨髓捐献者(对照组)、8例人白血病细胞株及153例AML患者骨髓单个核细胞中DLX4基因异构体(BP1及DLX7)表达及甲基化水平,并分析其临床意义。结果 DLX4异构体BP1在AML中表达上调,异构体DLX7在AML中表达下调。异构体BP1启动子区域CpG岛呈完全未甲基化,异构体DLX7启动子区域CpG岛呈高甲基化态势。ROC曲线分析揭示DLX4异构体表达可作为AML辅助诊断的潜在分子标志。相关性分析发现,异构体BP1高表达与患者高白细胞计数、FLT3-ITD突变有相关性,异构体DLX7表达与临床参数无相关性。预后相关性分析揭示异构体BP1高表达非M3患者经过诱导化疗后完全缓解率显著低于BP1低表达非M3患者,而在异构体DLX7中无明显差异。此外,非M3及正常核型患者中,与BP1低表达组相比,异构体BP1高表达组的总生存期明显缩短。结论 DLX4的2个异构体BP1和DLX7在AML中表达态势不同。其中,BP1表达上调与启动子甲基化无相关性,DLX7表达下调可能受其启动子高甲基化调控。此外,BP1高表达可能是AML患者预后不良的影响因素。     

金属蛋白酶组织抑制因子—3的结构、表达调控和生物学功能

金属蛋白酶组织抑制因子 3(TIMP 3)是一种结合细胞外基质 (ECM)的非可溶性蛋白。TIMP 3参与正常组织的发育和重建过程 ,也参与了许多疾病的发生。TIMP 3一方面可以刺激成纤维细胞增殖 ,另一方面却诱导恶性肿瘤细胞的凋亡。由于TIMP 3能以 1∶1克分子比例与基质金属蛋白酶 (MMPs)非共价结合 ,抑制MMPs的活性 ,因此TIMP 3有抑制肿瘤生长、侵袭和转移的作用 ,肿瘤组织中TIMP 3表达水平的下调或丢失将促进肿瘤的进程。TIMP 3基因启动子区甲基化是其表达水平下调或丢失的主要原因。运用去甲基化因子可使TIMP 3启动子区去甲基化 ,使TIMP 3得以重新表达 ,这可能成为肿瘤治疗的新途径     

Dysmegakaryopoiesis predicting response to therapy in acute myeloid leukaemia. A histologic and clinical study

With standard induction therapy between 50 to 85% of patients with Acute Myeloid Leukaemia (AML) achieve Complete Remission (CR). We investigated whether any morphological feature of bone marrow (BM) plastic embedded biopsies could predict failure of therapy. We reviewed BM plastic embedded biopsies from 54 adult patients presenting with untreated AML. The main histologic parameters analysed were cellularity, dysmegakaryopoiesis (DysM), percentage of marrow blasts and fibrosis. CR was obtained in 34 of 49 treated patients (69%). The rate of CR was significantly lower in the group of patients presenting with DysM: CR was achieved in 54% of the 28 treated patients with DysM and in 90% of the 21 treated patients without DysM (p less than 0.02). Patients with DysM had a significantly lower blood count and bone marrow blasts at presentation. Median age was not significantly different in the 2 groups. Cellularity and fibrosis were not predictive. DysM may be the hallmark of an AML subgroup with distinct clinical behaviour and lower rate of CR with conventional therapy. DysM should be carefully looked for on BM marrow biopsies and aspirate from AML patients at diagnosis.     

急性白血病细胞系中SFRP基因启动子甲基化及去甲基化诱导表达的研究

 目的：探讨分泌型卷曲相关蛋白（SFRP）基因家族启动子CpG岛异常甲基化状态与急性白血病（AL）发生发展的关系,以及DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷酸（5-Aza-CdR）去甲基化诱导SFRP基因表达作用的可能机制。方法：采用甲基化特异性PCR检测不同AL细胞系（Molt-4、Jurkat、HL-60和NB4）和不同浓度5-Aza-CdR作用下Jurkat细胞系中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因启动子区的甲基化状态,采用实时荧光定量RT-PCR检测SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5 mRNA表达,采用半定量RT-PCR检测DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达。结果：在正常人细胞中不存在SFRP基因的甲基化。SFRP1、SFRP2和SFRP5基因在HL-60、NB4、Molt-4和Jurkat细胞系中均呈完全甲基化状态;SFRP4基因在NB4、Molt-4和Jurkat细胞系中完全甲基化,在HL-60细胞系中则部分甲基化。5-Aza-CdR可逆转SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的高甲基化状态,并能够下调DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA水平,诱导SFRP基因恢复表达。结论：在AL细胞系中,SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因出现高甲基化,与AL的发生密切相关,可能成为AL新的基因标志物。5-Aza-CdR通过抑制DNMT表达,逆转SFRP基因的甲基化状态,恢复其表达。     

hPer3 基因启动子甲基化检测在慢性粒细胞白血病急变监测中的临床意义

目的: 探讨慢性粒细胞白血病(CML)急变中 hPer3 (human period 3)基因启动子甲基化检测的临床意义以及诱导 hPer3 表达对CML细胞株K562的作用。方法: 应用甲基化特异性PCR(MS-PCR)和实时荧光定量PCR检测29例CML患者骨髓 hPer3 基因启动子甲基化状态和mRNA表达,以40例缺铁性贫血(IDA)患者骨髓作为对照。将pcDNA3.1- hPer3 表达质粒经脂质体介导转染CML细胞株K562,MTT法检测生长抑制率,Annexin V/PI染色法检测细胞凋亡。结果: IDA组、CML慢性期、CML加速期和CML急变期中, hPer3 启动子甲基化阳性率(例)分别为0%(0/40)、17.65%(3/17)、66.67%(4/6)和83.33%(5/6),CML急变期和加速期甲基化阳性率均高于CML慢性期,差异显著(χ²=8.44,P＜0.01;χ²=5.03,P＜0.05)。对照组和CML慢性期、CML加速期和CML急变期中, hPer3 mRNA表达分别为75.03±18.16和5.13±2.29、0.40±0.18、0.17±0.05,两两之间差异显著(P＜0.01)。与空载体转染组相比, hPer3 转染后各时点的细胞抑制率和凋亡率均升高(P＜0.01)。结论: CML中 hPer3 启动子高甲基化导致了基因表达沉默,可能作为CML急变的监测指标。 hPer3 的过表达能抑制CML细胞株增殖,并促进其凋亡。     

骨髓增生异常综合征患者SFRP5基因启动子区甲基化状态研究

背景：SFRP5基因启动子区的甲基化与急性髓系白血病的发生密切相关。作为白血病的前期,骨髓增生异常综合征患者中SFRP5基因启动子区的甲基化状态尚不清楚。 目的：探索骨髓增生异常综合征中WNT/β-catenin信号传导通路拮抗基因分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)基因的甲基化状态。 方法：应用甲基化特异性PCR(MSP)法对43例骨髓增生异常综合征患者的骨髓或外周血进行SFRP5基因启动子区甲基化状况检测,并以70例门诊普通患者的外周血作为对照。 结果与结论：113例样本均成功进行了MSP检测,进入结果分析。43例骨髓增生异常综合征患者中检出5例(11.6%)SFRP5的甲基化,70例正常对照中检出1例(1.4%)SFRP5的甲基化,并且均为不完全甲基化状态。SFRP5在骨髓增生异常综合征患者中的甲基化率显著高于正常对照(χ²=5.511,P=0.019)。43例患者样本中,17例为骨髓样本,26例为外周血样本。而5例甲基化的样本中,2例为骨髓样本,3例为外周血样本。样本的来源(骨髓/外周血)对于甲基化状态的结果无显著差异(χ²=0.001,P=0.982)。提示,SFRP5基因的甲基化与骨髓增生异常综合征有相关性,SFRP5基因的甲基化可能是引起骨髓增生异常综合征的分子机制之一。     

TIMP-3基因甲基化与结直肠癌临床病理的关系

目的：探讨TIMP-3基因甲基化与结直肠癌临床病理指标和转移复发的关系。 方法： 采用巢式甲基化特异性PCR技术（nMSP法）检测100例结直肠癌组织和100例癌旁非癌组织TIMP-3基因甲基化；采用RT-PCR检测100例结直肠癌组织和100例癌旁非癌组织TIMP-3 mRNA的表达。 结果： 肿瘤组织TIMP-3 mRNA的表达阳性率为64%，肿瘤组织TIMP-3 mRNA的表达率明显低于癌旁非癌组织（P＜0.01）；TIMP-3 mRNA的表达率无淋巴结转移组（34/42）高于淋巴结转移组（30/58）（P＜0.01），甲基化阳性率Duke’s C+D期伴淋巴结转移组明显高于Duke’s A+B期不伴淋巴结转移组（P＜0.05）。结肠近端、分化程度差的结直肠癌组织甲基化阳性率明显高于远端直肠和分化程度高者（P＜0.05）。 结论： TIMP-3基因甲基化容易发生在结肠近端、Duke’s C、D期、伴淋巴结转移、细胞分化差和浸润型结直肠癌患者。     

Hypermethylation of the RUNX3 gene promoter in testicular yolk sac tumor of infants

Testicular yolk sac tumor (YST) of infants is biologically distinct from its adult counterpart. Cytogenetically, YSTs in infants generally lack i(12p), which is highly characteristic of adult germ cell tumors (GCTs), whereas they frequently show a deletion of 1p36, indicating that the loss of a certain gene(s) in this region is an important event in the pathogenesis of infantile YSTs. In the present study, we examined 10 testicular YSTs from infants for promoter methylation status of the RUNX3 gene, localizing in 1p36.1, and loss of heterozygosity (LOH) in this region, on the presumption that RUNX3 acts as a tumor suppressor. Methylation of RUNX3 and LOH at 1p36.1 were detected in 8 of 10 (80%) and 6 of 8 (75%) infantile YSTs examined, respectively. All six cases harboring LOH showed RUNX3 methylation. In contrast, 0 of 12 adult GCTs showed RUNX3 methylation, and LOH at 1p36.1 was less frequent (1 of 6 cases: 16%) in adult GCTs. There is a significant difference in RUNX3 methylation between these 2 groups (P < 0.001). In normal testes of the young group, RUNX3 methylation was not detected. These results strongly suggest that RUNX3 is one of the tumor suppressors involved in the pathogenesis of testicular YSTs in infants.     

Quantitative analysis of clonal bone marrow CD19+ B cells: use of B cell lineage trees to delineate their role in the pathogenesis of light chain amyloidosis

Light chain amyloidosis (AL) is a bone marrow (BM) plasma cell neoplasia with systemic deposition of Ig light chain amyloid fibrils. Here, we report the identification of clonal CD19 B cells in the BM and the use of a novel mathematical algorithm to generate B cell lineage trees of the clonal CD19 B cells and CD138 plasma cells from the BM of AL patients to delineate the relationship between these two clonal populations. The CD19+ clonal B cells in the BM of AL patients related to the clonal plasma cells represent a pre-plasma cell precursor population. The B cell lineage trees from AL patients also show significant differences in clonal diversification and antigenic selection compared to clones from normal, healthy controls. These data provide a robust example of the use of graphical quantification methods in delineating the role of neoplastic precursors in the pathogenesis of hematopoietic malignancies.