一种短期保存肺炎双球菌的简单方法

目的寻求一种简单易行的保存肺炎双球菌的方法. 方法在-20℃和-80℃条件下,用体积分数为10%的甘油新鲜兔脱纤维血(新鲜兔血)、体积分数为10%的甘油陈旧兔脱纤维血(陈旧兔血)和脱脂鲜奶作为保存剂,观察保存一定时间后肺炎双球菌存活百分率和其生物学性状的变化. 结果在-80℃保存18个月其存活率均达100%,且生物学性状保存前后无明显变化;在-20℃该菌株保藏12个月以上时,用新鲜兔血、陈旧兔血和脱脂鲜奶保存剂保存该菌,其存活率分别为70%、30%和55%,差异有显著性(P<0.01);而用新鲜兔血方法保存的菌株,其菌形、胆汁溶解和荚膜试验与保存前菌株相似,生化反应与保存前菌株相比稍有改变,而其它生物学性状无变化. 结论在-80℃保存该菌,上述3种保存剂均可使用;在-20℃保存该菌,应使用新鲜兔血作为保存剂.     

几种增菌液对志贺菌增菌效果的研究

目的：筛选对志贺菌高效果增菌的增菌液。方法：应用6种增菌液对30株志贺氏菌增菌，分离培养并计数。结果：增菌6h以SS、HE增菌液增菌效果最佳，检出率皆为100％；增菌22h以SS、肠道增菌液和亚硒酸盐增菌液增菌效果最好，检出率为60％。结论：若增菌时间为6h，以HE和SS增菌液增菌效果最好；长时间增菌22-24h，以肠道增菌液，亚硒酸盐增菌液效果好。     

新鲜羊膜与保存羊膜中HGF、bFGF表达的对照研究

目的:研究肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在新鲜和两种保存羊膜中的表达,探讨新鲜和保存羊膜的生物学活性差异.方法:取健康剖宫产产妇胎盘羊膜,随机分成三组:新鲜组、DMEM/甘油-80℃保存组、纯甘油4℃保存组(保存1、3个月),应用免疫组织化学方法,检测HGF、bFGF在各组羊膜中的表达.结果:HGF、bFGF主要分布于羊膜上皮层.HGF在DMEM/甘油组和纯甘油组保存1、3个月时的表达明显低于新鲜羊膜组,统计学上差异有显著性(P＜0.0001),bFGF在两组保存3个月时的表达明显低于新鲜羊膜组,统计学上差异有显著性(P＜0.01).结论:羊膜经DMEM/甘油-80℃、纯甘油4℃保存后,HGF、bFGF减少,并随保存时间的延长活性逐渐下降.     

医学微生物菌种长期保存方法探讨

目的 为探讨一种能长期保存菌种的理想方法,以便更好地为科研、教学提供标准菌株。方法将需保存的菌株纯化后,用保护剂鲜牛奶制成常用菌悬液、高浓菌悬液,分别分装菌种管中置-70℃超低温快速预冻过夜,冷冻干燥机真空干燥封口,-30℃保存。结果浓度为10^6-10^7／ml和5^10-10^10个/ml的菌液经15年保存后菌株的存活率分别为92．3％和100％。经20年保存后菌株的存活率分别为61．53％,98．46％。结论鲜牛奶高浓菌悬液冷冻真空干燥可长期保存各种微生物菌种。     

解脲脲原体低温保存方法的研究

该文报道4种不同保护剂在-10℃、－20℃、－70℃低温中煤存解脲脲原体的效果研究。结果显示：在-70℃条件下，5％与10％甘油保护剂中，解脲脲原体的存活率最高，其CCU’s／O．1ml为106与105，保存5个月后不失活。此外，亦证明菌落保存法优于菌液保存法。因此，该研究可认为是一种简便短期保存文原体的方法。     

医学微生物教学用菌种保存方法的比较

目的寻求一种简便实用的有效保存各种教学用菌种的方法。方法将各待保存的菌种纯化后用取菌环直接从平板上刮取，置于盛有0.5ml各保存液的菌种瓶中，甘油原液-20℃保存，石蜡油和兔防凝血4℃保存。结果在连续52个月的实验期内，甘油保存的各菌种效果较好，且各菌生化反应、形态结构、染色特性等与标准株相符。结论甘油保存法操作简便，保存时间长，适用于微生物教学用各菌种的保存。     

HA20-Iys10在大肠埃希菌中的融合表达纯化和凝胶阻滞试验

目的表达和纯化流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合蛋白HA20-Iys10，并观察其与质粒结合的能力。方法用PCR方法构建流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合基因HA20-Iys10，并克隆于pET32a( )原核表达载体。将重组表达质粒pET-HA-K转化大肠埃希菌BL21（DE3)，当A(Abs)600nm达到0．6时，加入终浓度为1mmol／L IPTG诱导目的蛋白的表达。表达产物用亲和层析一步法进行纯化，然后用凝胶阻滞试验观察重组蛋白结合质粒的能力。结果IPTG诱导后可获得相对分子质量约为27000的目的蛋白，表达蛋白以可溶形式存在，占菌体蛋白20％以上。表达菌超声后，表达产物经亲和层析一步纯化后可获得纯度达85％以上目的蛋白。凝胶阻滞试验发现，纯化的重组蛋白在一定条件下可以与质粒结合，使质粒的迁移率明显改变。结论融合蛋白HA20-Iys10有望用于受体介导基因转移，以提高基因转移的效率。     

一种感受态细菌的制备方法

目前,尽管分子克隆实验中通常采用的感受态细菌的制备方法可满足一般的实验要求,但对于获得比较困难的DNA分子而言,最大限度地提高质粒转化细菌菌株的效率,对提高实验成功率无疑具有重要意义[1]。我们通过摸索,建立起一种方便、快捷、重复性好,转化效率高的感受态细菌的制备方法,介绍如下。1 材料与方法1.1 缓冲液的配制 配制100ml(pH6.2)缓冲液,各组分终浓度分别为:KCl 100mmol,CaCl2 50mmol,Glucose 10％,KAc 10mmol。0.22μm滤器滤过除菌,4℃保存,3个月有效。1.2 实验步骤 取单克隆细菌DH—5α接种于含有1ml LB培养基的试管中,37℃温育,振摇过夜;将上述菌液1ml加至100ml LB培养基中,37℃摇床(250r/min)振荡培养3h至OD≈0.5;菌液离心,4℃,4000r/min,离心10min,弃去上清液;     

弓形虫病诊断试剂盒阴性血清保存方法的研究

目的：研究SPA-ELISA弓形虫病诊断试剂盒不同稀释液及灭活处理对阴性血清的保存效果。方法：正常人阴性血清（n=5）分别用0．01MPBS缓冲液、1％胎牛血清、15％甘油1：100进行稀释后保存于4℃，分别于稀释后1d、1周、2周、4周、2个月、3个月用SPA-ELISA检测阴性血清OD410比较其变化情况：同时观察灭活对阴性血清的影响。结果：用15％甘油稀释的阴性血清可以保存至3个月，用0．01M PBS缓冲液和1％胎牛血清稀释的阴性对照一个月之后保存效果较差。结论：15％甘油稀释的阴性血清可以比较长期稳定的保存．保证了SPA-ELISA弓形虫病诊断试剂盒的稳定性。     

霍乱弧菌O139群新类型ig1-rstR-ig2结构和功能研究

目的研究霍乱弧菌（VC）O139群新类型ig1—rstR—ig2结构及功能。方法分别扩增CTXφ或net—CTXφ基因组串联体的第一个基因组核心区末端和第二个基因组RS区起始端之间的基因,PCR产物测序及序列分析。扩增rstA的操纵区,克隆入pRS591质粒lacZ基因前,转化入JM109菌株,检测β-半乳糖苷酶活性,以反映rstA启动子强度。将不同类型rstR及启动子区分别克隆人pACYC184质粒,再将重组pACYC184质粒转化入携带不同重组pRS591质粒的JM109菌株中,检测β-半乳糖苷酶活性,以反映rstR表达产物RstR对rstA表达的影响。结果cale、ET和newO139类型ig1—rstR—ig2序列同源性分别为85．1％～91．6％、9．4％～17．7％和8．0％～26．2％。不同类型rstA的启动子强度不同,calc和ET类型的较高,newO139类型的较低。RstR对同类型rstA启动子活性表达均有明显的抑制作用,而对不同类型的则无明显抑制作用。结论阐明了霍乱孤菌（VC）O139群calc、ET和newO139类型ig1-rstR—ig2结构及功能。     

携带SLC基因的Birc5-siRNA质粒载体的构建及鉴定

目的：构建携带SLC基因的Birc5‐siRNA质粒载体,为肿瘤靶向治疗研究提供基础。方法使用Ambion公司siRNATarget Finder设计的Birc5 mRNA干扰序列,将Birc5‐siRNA插入载体 PEGFP6‐1后转化大肠埃希菌扩增培养,提取质粒;将SLC插入质粒pGenesil‐8后转化细菌扩增培养,提取质粒;挑取酶切鉴定正确的质粒转化菌液测序鉴定;采用分子克隆技术构建特异性沉默Birc5且携带SLC基因的质粒,命名为pgsiRNA‐Birc5＋SLC。结果质粒Birc5能被 EcoRⅠ酶切出1条约400 bp的DNA条带,说明Birc5‐siRNA 已插入质粒载体PEGFP6‐1;pGenesil‐8‐SLC能被BglⅡ＋ XbaⅠ酶切出1条约430 bp的DNA条带,说明SLC插入正确;酶切鉴定正确的质粒转化菌液Birc5‐siRNA和SLC测序结果显示均为插入正确的克隆质粒;经酶切鉴定分析显示pgsiRNA‐Birc5＋SLC符合酶切鉴定结果,表明携带SLC基因的Birc5‐siRNA质粒载体构建成功。结论成功构建了携带SLC基因的Birc5‐siRNA质粒,为进一步研究靶向沉默肿瘤Birc5基因并趋化淋巴细胞抗肿瘤研究提供了工具和基础。     

羊膜治疗翼状胬肉及术后观察

目的：对34例36眼翼状胬肉患者采用羊膜移植术治疗的效果和术后羊膜溶解时间进行跟踪。方法：采用DMEM培养液与纯甘油1：1比例的保存液-80℃保存的羊膜对翼状胬肉患者行AMT术，随防时间18个月，其中术后1月、2月、半年观察AMT术后及羊膜溶解的时间进行跟踪。结果：36眼患者中，治愈(角膜透明，巩膜术区结膜生长良好，充血消失)34眼，占94．5％，复发(手术后6个月纤维组织增生侵入角膜伴新生血管)2例，占5．5％。羊膜溶解：1个月3例，占8．3％、2个月30例，占83．3％，半年全部溶解。结论：AMT术治疗翼状胬肉效果良好，复发率低。大多数羊膜溶解时间是1～2月。     

脐血造血干细胞冻存和纯化的研究

为观察脐血造血干细胞—80℃保存以及脐血CD34~ 细胞的纯化效果,采用-80℃深低温冰箱冻存脐血干细胞,结果表明保存1个月脐血单个核细胞(MNC)数量、锥虫蓝拒染率、粒一单祖细胞集落(CFU—GM)数回收率分别为85.17％±5.38％、91.67％±3.22％、60.50％±4.42％。保存1、3、6个月动态观察3项指标除锥虫蓝拒染率1个月与6个月外均无显著性差异{均P>0.05)。用Isolex50免疫磁珠分离系统,可从脐血中获得高纯度CD34~ 细胞。上述研究为脐血造血干细胞移植的临床应用提供了实验依据。     

新鲜与保存人羊膜超微结构初步观察

目的:对新鲜和保存人羊膜的超微结构进行观察,从形态学角度探讨人羊膜超微结构与其眼表重建之间的关系。方法:采用扫描电镜、透射电镜和光镜分别对新鲜和低温(-80℃)纯甘油中保存6个月人羊膜的超微结构进行观察。结果:电镜下保存羊膜上皮细胞结构保持完整,分泌颗粒与细胞间连接、微绒毛和微皱褶结构均存在。光镜下保存羊膜仍维持完整立方上皮层,细胞形态整齐,两者基底膜完整。结论:新鲜和保存人羊膜均具有完整的上皮细胞层和基底膜,从形态学角度推测羊膜重建眼表的作用与此有关。     

结核分枝杆菌1hp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)1hp—esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法：用Gene SOEing法，将1hp基因和esat6基因体外重组，构建融合基因，克隆入pQE30质粒中进行表达。结果：构建的融合基因经测序证实完全正确，重组体转化表达菌DH5α后，经过IPTG诱导，表达出26kDa左右的CFP10-ESAT6融合蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的40％，Western blotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni—NTA柱纯化后，获得了纯度为98%的重组蛋白。结论：成功构建MTb 1hp—esat6融合基因，成功构建原核表达载体pQE30-CFP10-ESAT6，并获得重组CFP10-ESAT6融合蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

辐照同种异体血管移植的实验研究

目的探讨在不用免疫抑制的条件下，开展同种异体血管移植的可行性。方法（1）在无菌条件及无刨伤原则下切取Wistar大鼠股动脉，-10℃～-20℃保存或真空包装常温保存，16kGy ^60Coγ射线照射。（2）分辐照同种异体血管移植组、新鲜同种异体血管移植组和新鲜自体血管移植组进行血管移植。于移植后1周、2周、1个月、2个月、3个月5个时间点观察移植血管的通畅率，并取材作组织学检测。结果：（1）辐照处理的同种异体动脉无任何组织学结构改变，肉眼观察外形无明显变化。（2）辐照同种异体血管移植组、新鲜同种异体血管移植组和新鲜自体血管移植组移植血管的通畅率分别为90％（27／30）、30％（9／30）和93．3％（28／30）。辐照同种异体血管移植组和新鲜自体血管移植组移植后2周移植血管内膜出现内皮细胞，移植后3个月移植血管内膜内皮细胞覆盖完整。新鲜同种异体血管移植组移植早期有淋巴细胞及炎性细胞浸润，有明显血管结构破坏出现，移植血管内膜未见内皮细胞覆盖。结论辐照同种异体血管完全符合理想的血管移植物所具备的条件；在不使用任何免疫抑制的条件下，应用辐照同种异体血管进行同种异体血管移植是可行的。     

抗冻缓冲液保存冰冻切片的研究

目的: 研究抗冻缓冲液（anti-freeze buffer, AFB）对冰冻切片的长期保存作用。方法：4只12~15月龄的雌性C57BL/6NIA小鼠常规灌注取脑，50 μm冰冻切片，将切片于-20℃保存于抗冻缓冲液中，分别于切片的当日、切片后３个月、６个月和12个月, 行β-NADPH酶组织化学和GFAP免疫组织化学染色。 结果: 于-20℃冰箱保存在AFB内的冰冻切片，至6个月时,β-NADPH 酶组织化学显示的含一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS) 的神经元和毛细血管与新鲜标本没有区别；至12个月时，GFAP免疫组织化学染色显示的星形胶质细胞与新鲜标本没有区别。结论: AFB可较长时间保存组织切片的抗原成份和酶活性，是形态学研究领域较好的保存冰冻切片的方法。     

大量提取质粒的简便方法

0　引言　质粒提取是分子生物学实验室一项最基本的工作 .我们介绍一种非常简便的大量提取质粒方法 ,此法提取的质粒可直接用于酶切鉴定、转化、探针标记等 .菌种为转化了重组 p U C19质粒的 DH5α E.coli.重组 p UC19质粒为在 H inc II位点插入不同的 PCR产物连接而成 .1　方法　挑一个单菌落接种于 5 m L L B/ Amp(含氨苄青霉素0 .1g· L-1 )培养液中 ,37℃振荡过夜 (A=0 .6 ) ,转 1m L菌液于 10 0 m L L B/ Amp培养液中 ,37℃振荡过夜 (A=0 .6 ) ,将菌液倒入两个 5 0 m L离心管 ,10 0 0 0 g离心 2 min,弃去上清 ,沉淀中加入 4…     

应用质粒图像鉴定在孟加拉国分离出的志贺氏菌属

美国肠道疾病爆发中已应用质粒分析作为流行病学判断传染来源或评价防治措施效果的工具。为了评价质粒图像分析在志贺氏菌属高度地方性流行区一个区域中的应用价值,检查了两组从孟加拉国国际腹泻病研究中心(ICDDC,B)就诊病人中的分离菌株:24株为1982年12月的4%随机监测样本(一个月内收集的菌株所含质粒更相近),112株为同年1—10月的保存样本。这些菌株包括了志贺氏菌属的四个     

HA20-lys10在大肠埃希菌中的融合表达纯化和凝胶阻滞试验

目的表达和纯化流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合蛋白HA20-lys10,并观察其与质粒结合的能力.方法用PCR方法构建流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合基因HA20-lys10,并克隆于pET32a(+)原核表达载体.将重组表达质粒pET-HA-K转化大肠埃希菌BL21(DE3),当A(Abs)600nm达到0.6时,加入终浓度为1 mmol/L IPIG诱导目的蛋白的表达.表达产物用亲和层析一步法进行纯化,然后用凝胶阻滞试验观察重组蛋白结合质粒的能力.结果IPTG诱导后可获得相对分子质量约为27 000的目的蛋白,表达蛋白以可溶形式存在,占菌体蛋白20%以上.表达菌超声后,表达产物经亲和层析一步纯化后可获得纯度达85%以上目的蛋白.凝胶阻滞试验发现,纯化的重组蛋白在一定条件下可以与质粒结合,使质粒的迁移率明显改变.结论融合蛋白HA20-lys10有望用于受体介导基因转移,以提高基因转移的效率.