mpt64-卡介苗重组疫苗的构建及鉴定

目的为提高卡介苗对结核病的保护力,构建结核分枝杆菌mpt64-卡介苗重组疫苗。方法采用基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原MPT64的编码基因与穿梭质粒pYUB295重组,通过电穿孔技术导入卡介苗中,应用PCR扩增、PAGE电泳鉴定重组卡介苗。结果通过PCR扩增获得mpt64基因,与穿梭表达载体pYUB295重组后,通过PCR扩增、酶切、DNA测序鉴定表明成功地构建了mpt64基因pYUB295重组质粒。将重组质粒通过电穿孔导入卡介苗,重组卡介苗在抗性培养基上生长良好。mpt64-卡介苗重组疫苗基因组DNA的PCR扩增及培养上清液PAGE电泳表明,mpt64-卡介苗重组疫苗构建正确,MPT64蛋白在卡介苗中分泌表达。结论成功构建了mpt64-卡介苗重组疫苗。     

埃可病毒9型VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的原核表达并纯化埃可病毒9型(ECHO9)VP1蛋白,免疫兔子制备多克隆抗体,鉴定重组蛋白的免疫活性,为ECHO9血清学检测试剂和疫苗研究提供依据。方法 PCR方法扩增VP1基因,构建原核表达质粒p ET28a-VP1并转化到大肠杆菌(E.coli BL21),诱导表达并纯化VP1重组蛋白,免疫兔子制备抗VP1多克隆抗体,ELISA检测抗VP1抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性。病毒中和试验鉴定抗体中和ECHO9病毒的能力。结果 VP1重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP1抗体效价为1∶105。Western blot检测结果显示,抗VP1多克隆抗体可以识别原核表达的VP1蛋白。中和试验显示抗体对ECHO9病毒有中和作用,其效价为1∶10。结论本研究成功原核表达了ECHO9的VP1蛋白并制备出抗VP1多克隆抗体,有助于ECHO9的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究。     

结核分枝杆菌Lsr2蛋白原核重组表达及其多克隆抗体制备

目的 利用原核系统获得重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备抗Lsr2多克隆抗体。 方法 以临床标准株 H37Rv DNA为模板,合成引物PCR扩增Lsr2核酸序列,插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,柱上复性纯化后,重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备并纯化抗Lsr2多克隆抗体,采用间接ELISA和Western-blotting实验对抗体进行验证。 结果 成功构建pET28a-Lsr2表达质粒,重组蛋白Lsr2经SDS-PAGE电泳鉴定分子量为14 kD。亲和层析及柱上复性后,纯化的重组蛋白纯度在95%左右。制备的抗Lsr2多克隆抗体效价在1:5.5×10⁶以上,并能特异性识别纯化的重组蛋白和结核分枝杆菌菌体蛋白。 结论 成功在原核系统内表达并纯化了重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备了高效价的抗Lsr2多克隆抗体,为进一步研究Lsr2蛋白的功能,筛选其下游相互作用蛋白以及相关分子机制研究奠定了基础。     

分泌蛋白在痰液及培养液中鉴定结核分枝杆菌复合群的应用研究

目的评价两种结核菌分泌蛋白试剂分别应用于痰液和培养液中鉴定结核分枝杆菌复合群(MTC)的效果。方法①采用结核分枝杆菌多克隆分泌蛋白试剂对20例健康人呼吸道分泌物以及151例疑为结核病病人痰标本进行检测,同时使用MGIT 960培养仪分离培养,阳性分离菌株进行传统方法鉴定,并使用结核分枝杆菌单克隆分泌蛋白MPT64鉴定。②23株分枝杆菌标准菌株采用MPT64单克隆试剂鉴定。③找出两种试剂的检出限。稀释H37RV标准菌株找出MPT64单克隆试剂的检出限,分析涂片阳性级别与多克隆分泌蛋白试剂结果关系找出该检出限并作比对。结果 MPT64单克隆试剂与多克隆分泌蛋白试剂的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为98.7%、100.0%、88.9%、98.7%和81.0%、85.9%、83.1%、84.0%、83.6%。MPT64单克隆试剂在3 000 CFU/ml的菌液浓度检出。多克隆分泌蛋白试剂在5 000～10 000 CFU/ml的阳性痰中检出。两者的平均检测时间为12 d和1 d。结论应用MPT64单克隆分泌蛋白试剂检测鉴定培养液中MTC是一种准确、快速、简便而又不需要任何仪器设备的实用型方法,值得临床推广应用;而多克隆分泌蛋白试剂可直接应用于痰液中检测鉴定MTC,尽管在灵敏度、特异性、准确度上未尽人意,但其快速性仍不失为一种让人期待的方法。     

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶Sap2多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶Sap2多克隆抗体,并对其进行鉴定。方法提取白假丝酵母菌基因组DNA为模板,经聚合酶链反应（PCR）获取SAP2目的基因;双酶切SAP2基因与原核表达载体pMAL c2x（+）,构建pMAL c2x/SAP2重组质粒;在大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达出可溶性的融合蛋白;用可溶性Sap2免疫小鼠制备抗血清,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗血清效价,亲和层析法纯化抗血清后,利用Western免疫印迹(Western Blot)检测抗体特异性。结果该研究成功制备了抗Sap2多克隆抗体,抗体效价＞1∶51 200;Western Blot检测结果表明,该抗体可特异性识别Sap2蛋白。结论纯化后的Sap2作为抗原免疫小鼠,有较好的抗原性和免疫原性,可成功制备多克隆抗体,并具有高特异性,为快速检测侵袭性白假丝酵母菌感染奠定了基础。     

乙型脑炎病毒E结构域蛋白表达、纯化与胶体金的制备

目的分离乙脑病毒临床株,制备高纯度E蛋白抗原,制作用于乙脑病毒抗体检测的胶体金快速检测试纸条。方法 PCR扩增乙脑病毒E蛋白基因、使用原核表达系统进行融合表达、Ni-柱亲和纯化,透析复性后多点皮下免疫动物获得兔抗乙脑病毒E蛋白的多克隆抗体,免疫印迹法检测该抗体与重组蛋白结合的特异性。对抗体处理后,制备快速检测乙脑病毒的胶体金试剂。结果成功克隆出乙脑病毒E蛋白基因并表达该蛋白,纯化后免疫印迹显示在蛋白分子量53kDa左右显出1条目的条带(乙脑病毒E蛋白);酶联免疫法检测多克隆抗血清的效价达到1:12 800,与阴性血清不发生特异性反应。结论成功对乙脑病毒E蛋白基因进行了克隆表达,制备的胶体金试剂能检测出乙脑患者血清中的抗体,操作简便快速,具有临床推广意义。     

结核分枝杆菌4种分泌蛋白血清学应用价值

目的通过对4种基因重组的结核分枝杆菌分泌蛋白进行包被,建立了酶联免疫检测方法,用于检测肺结核病患者、非结核肺部疾病患者、卡介苗接种者的血清抗体,并探讨结核分枝杆菌分泌蛋白的血清学应用价值。方法在酶标板上分别包被基因重组蛋白ESAT-6、Ag85A、MPT64、MPT81抗原,建立间接ELISA方法,分别检测肺结核病患者、非结核肺部疾病患者和卡介苗接种前后的血清抗体。结果肺结核组血清抗体除ESAT-6外,Ag85A、MPT64、MPT81的阳性率均显著高于非结核肺部疾病组(P0.01)。结核菌素试验阴性者注射上述卡介苗前阳性率分别为19.0%、13.8%、12.1%、12.1%,注射后阳性率分别为37.9%、24.1%、15.5%、17.2%,其中注射ESAT-6前后阳性率之间的差异有显著性(P0.05)。结论用结核分枝杆菌重组分泌蛋白检测结核病人血清抗体具有重要的诊断价值,有望作为结核蛋白芯片的候选抗原。     

人巨细胞病毒US31蛋白的特异性抗体的制备及鉴定

目的 制备人巨细胞病毒(HCMV) US31原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法 HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至p ET21a(+)原核表达载体,构建p ET21a(+)/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果 在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经镍柱亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的Ig G抗体,效价为1∶49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论 成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6的原核表达与纯化及免疫原性检测

目的构建及鉴定含有GST标签的结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法 PCR扩增结核分枝杆菌esat-6基因,并构建到pGEX4T-1上,重组质粒经测序鉴定后进行诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌esat-6基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-1-ESAT-6,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物,蛋白纯化后可被结核病患者血清特异性识别。结论构建了质粒载体pGEX4T-1-ESAT-6,并经诱导后高效表达了ESAT-6融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原LRRC15蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建猪带绦虫重组质粒pET30a-富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域15(LRRC15), 原核表达纯化的LRRC15重组蛋白, 制备兔多克隆抗体。方法采用全基因合成方法, 获得猪带绦虫LRRC15蛋白编码基因;将其克隆至pET30a载体, 构建重组质粒pET30a-LRRC15, 并进行双酶切PCR鉴定;将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞, 用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达LRRC15重组蛋白, 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析鉴定表达产物;用Ni-IDA亲和层析柱纯化LRRC15重组蛋白, SDS-PAGE进行分析鉴定;蛋白质印迹法(Western blot, WB)鉴定纯化重组蛋白特异性;用纯化的LRRC15重组蛋白免疫新西兰兔, 制备LRRC15多克隆抗体, 用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定纯化多克隆抗体的效价。结果经PCR鉴定, 扩增出长度为1 506 bp的条带, 与LRRC15基因相符;经SDS-PAGE和WB鉴定, 获得相对分子质量(Mr)约为55.36 × 103的LRRC15目的蛋白;用LR...     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的克隆、表达、纯化和复性

目的构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的重组质粒,并在大肠杆菌中表达及纯化和复性重组蛋白。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出mpt 64基因片段,插入PKRX-T载体中,再亚克降到表达载体PET30a中,在大肠杆菌中表达;应用组氨酸标签(His-Tag)纯化重组蛋白;在PBS中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构。结果构建了含MPT 64重组质粒的大肠杆菌工程菌,并以包涵体形式表达重组蛋白MPT 64,其占细胞总蛋白的20%~30%;重组蛋白变性后经镍柱纯化,其纯度达90%以上;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构。结论具有天然结构和高纯度的重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原。     

结核分支杆菌MPT83蛋白基因在大肠杆菌表达载体中的克隆、表达与鉴定

[目的]从分支杆菌培养物中提取DNA,扩增结核分支杆菌MPT83蛋白基因,并在大肠杆菌中进行表达、克隆和鉴定. [方法]从分支杆菌培养物中提取总DNA,扩增MPT83因并克隆入T载体,将目的基因插入表达载体pET-32a( )中,转化BL21宿主菌,IPTG诱导表达构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamHⅠ HindⅢ双酶切进行鉴定. [结果]经SDS-PAGE分析,在约42 ku处出现新的蛋白条带,5 h后表达量即达到高峰;Western blotting分析表明,融合蛋白能够被分支杆菌阳性血清所识别;纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳,出现清晰的单一条带.表明MPT83基因原核表达载体构建成功. [结论]结核分支杆菌MPT83蛋白基因在大肠杆菌表达载体中的克隆、表达与鉴定,为结核病的诊断以及亚单位疫苗、核酸疫苗的制备和应用奠定基础.     

结核分枝杆菌分泌蛋白NPT64的克隆、表达、纯化和复性

目的 构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的重组质粒,并在大肠杆菌中表达及纯化和复性重组蛋白.方法 用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出mpt64基因片段,插入PKRX-T载体中,再亚克降到表达载体PET30a中,在大肠杆菌中表达;应用组氨酸标签（His-Tag）纯化重组蛋白;在PBS中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构.结果 构建了含MPT64重组质粒的大肠杆菌工程菌,并以包涵体形式表达重组蛋白MPT 64,其占细胞总蛋白的20%～30%;重组蛋白变性后经镍柱纯化,其纯度达90%以上;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构.结论 具有天然结构和高纯度的重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原.     

Ⅰ型登革病毒prM抗体的制备及初步鉴定

目的以Ⅰ型登革病毒pr M蛋白为靶抗原,制备相应的多克隆和单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法 RTPCR扩增Ⅰ型登革病毒全长pr M基因,转入克隆载体和构建重组表达载体,以原核表达及纯化后的pr M蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,采集免疫兔血清,制备抗pr M蛋白多克隆抗体;取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经HAT选择培养、间接ELISA筛选阳性克隆,获得特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备抗pr M蛋白单克隆抗体,应用亲和层析法纯化抗体,Western-blot鉴定抗体特异性,间接ELISA检测抗体效价。结果获得全长pr M的多克隆抗体及1株能稳定分泌抗pr M蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗体的效价高,特异性好。结论制备了Ⅰ型登革病毒pr M多克隆抗体和1株单克隆抗体,为进一步探讨登革病毒pr M抗体依赖的感染增强作用奠定基础。     

结核分枝杆菌85B基因原核表达及间接ELISA方法的建立

目的原核表达结核分枝杆菌85B融合蛋白,建立该抗原对结核病患者诊断的ELISA方法。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中进行PCR扩增85B基因并构建至表达载体p GEX4T-1上。原核表达GST-85B融合蛋白,并通过包涵体对其进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化得到可溶性的目的蛋白。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白,ELISA检测表达融合蛋白的抗原性。结果扩增出了结核分枝杆菌85B基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体p GEX4T-85B,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多。将包涵体变性、复性后用GST亲和层析纯化,蛋白纯化后可被结核病患者血清特异性识别。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-85B融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础。     

抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6的新型单克隆抗体的制备及其临床应用

目的制备抗结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)单克隆抗体,以应用于多种检测技术和临床研究。方法设计并合成结核分枝杆菌ESAT-6特定抗原肽序列,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测、多次有限稀释亚克隆建立能稳定分泌抗结核分枝杆菌特异抗原肽单克隆抗体的杂交瘤细胞系,纯化后行免疫球蛋白亚型分析,并鉴定分析该单克隆抗体在蛋白质免疫印迹法、免疫沉淀法和酶联免疫法(ELISA)检测中的应用效果。收集结核分枝杆菌培养上清液样本38份,非结核分枝杆菌培养上清液样本20份,结核性胸水样本32份,非结核性胸水样本24份以及健康对照血清样本20份。结果单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示抗体类型为IgM、κ型,并可应用于Western blotting和免疫沉淀法。ELISA定量检测显示该特异性抗体检测结核分枝杆菌的敏感度为95.7%(67/70),特异度为100%(64/64)。结论 ESAT-6单克隆抗体用于结核分枝杆菌检测有较高的敏感性和特异性,可用于结核病的早期诊断。     

Sao蛋白多克隆抗体制备鉴定及促全血杀菌作用

目的 制备2型猪链球菌（S.suis 2）表面抗原一（Sao）重组蛋白的多克隆抗体,鉴定其免疫学特性。方法 通过PCR从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中扩增基因Sao,构建重组表达质粒pET28a-Sao,转化E.coli BL21,异丙基硫代半乳糖苷诱导表达目的蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物,His亲和层析柱纯化重组蛋白,利用纯化后Sao蛋白制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,评价Sao多克隆抗体的促全血杀菌作用。结果 构建的重组质粒可以在宿主菌中高效表达,纯化后获得的重组蛋白纯度可达90%;间接酶联免疫吸附试验测定Sao多克隆抗体效价为1：102400;Western blot结果显示,Sao多克隆抗体有较好的特异性;全血杀菌实验显示,05ZYH33在含有Sao多抗血清的全血中相对存活率下降85%。结论 本研究制备的2型猪链球菌重组Sao蛋白多克隆抗体效价高,特异性好,可明显增强全血对细菌的杀伤作用。     

结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达载体并进行表达,为进一步研究奠定基础。方法PCR扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT获得重组表达质粒pGEX-2994,转化大肠杆菌测序后诱导表达,纯化目的蛋白并免疫新西兰大白兔获取多价抗体。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv2994基因,成功构建了融合表达质粒pGEX-Rv2994,转化大肠杆菌JM109后,经IPTG诱导,表达出约73kDa重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体。结论成功构建了原核表达载体pGEX-2994,获得并纯化了GST-Rv2994融合蛋白,制备了高效价的多价血清,为Rv2994基因的功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3428c重组蛋白表达与纯化及其单克隆抗体的制备

目的 制备并鉴定Rv3428c的单克隆抗体，为结核分枝杆菌快速特异性抗原检测奠定基础。方法 同源重组得到pET28a-Rv3428c表达载体，转入E.coli BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达，用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠后进行细胞融合，间接ELISA、Western Blot筛选阳性杂交瘤细胞系，以筛选获得的阳性杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹水，蛋白A亲和层析法纯化抗体，BCA法测定浓度，ELISA和SDS-PAGE进行单克隆抗体的鉴定及亚型和效价的测定。结果 成功构建pET28a-Rv3428c表达载体、表达并纯化出目的蛋白。Rv3428c蛋白免疫小鼠使小鼠产生致敏B淋巴细胞，在聚乙二醇作用下，淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。筛选得到的阳性杂交瘤细胞株，通过体内诱生法制备获得Rv3428c单克隆抗体。该单抗属于IgG2a亚类，κ型轻链，效价约为1∶128 000,浓度为4 mg/ml。结论 本研究制备并纯化了Rv3428c重组蛋白，获得了抗Rv3428c单克隆抗体，为Rv3428c用于结核分枝杆菌快速特异性抗原检测奠定基础。     

结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶-GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX4T-1构建表达载体pGEX4T-pncA,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH10b,再经IPTG诱导表达谷胱甘肽S转移酶(GST)-吡嗪酰胺酶融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌pncA基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-pncA,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。