人CTLA-4Ig腺病毒载体的构建鉴定与表达

目的：运用PAdEasy系统构建了带荧光蛋白的人CTLA-4Ig腺病毒载体，为进一步研究CTLA-4Ig诱导免疫耐受的机制奠定了基础。方法：采用基因技术，将目的基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中，利用PAdEasy系统进行重组，然后在293细胞中进行扩增。并进行病毒滴度测定。体外感染人肾小管上皮细胞。结果：酶切鉴定和PCR证明重组人CTLA-4Ig腺病毒载体构建正确。结论：应用PAdEasy细菌内重组技术成功构建了人CTLA-4Ig带荧光腺病毒载体。     

小鼠降钙素基因相关肽基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的表达

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达.方法:采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP.经PmeⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重组腺病毒质粒在XL-Gold 细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果.通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量.结果:测序证实PUC57 -CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经Pac Ⅰ酶切可见长约3 kb与30 kb DNA片断.转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性.构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞.通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达.结论:成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础.     

利用Adeasy-1系统构建npcl基因非复制型腺病毒载体并鉴定

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,细菌内同源重组法构建有npcl基因的腺病毒载体.方法利用限制性内切酶kpnl HindⅢ从带有朊病毒启动子的质粒prp-pro-mlpcl中切下目的基因npcl-1,克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV,再与PAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,经抗性筛选和酶切鉴定的质粒再利用脂质体转染人293例细胞中扩增,利用Adeasy-1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒,RT-PCR鉴定目的基因的表达.结果切酶切鉴定,正确的目的基因片断已克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV;卡那霉素进行抗性筛选及Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d后见明显的绿色荧光蛋白表达.回收病毒,可重复感染293细胞,证实有感染能力的病毒颗粒包装成功.结论利用腺病毒载体系统Adeasy-1可构建能成功表达Pac Ⅰ基因的腺病毒载体,为对Niemann pick' s病C型的进一步研究提供了条件.     

小鼠窖蛋白-1 基因重组腺病毒载体的构建

目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠窖蛋白-1(caveolin-1)编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-caveolin-1。方法将质粒pTRE2-caveolin-1中的小鼠caveolin-1编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-caveolin-1,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-caveolin-1经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度和重组病毒插入片段的序列。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带caveolin-1基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,caveolin-1基因测序鉴定与GenBank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/mL。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-caveolin-1,通过该系统携带的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究caveolin-1在牙齿发育中的作用奠定了基础。     

小鼠IDO基因重组腺病毒载体的构建表达和鉴定

目的 构建携带小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,以期进一步进行研究其免疫学效应.方法 酶切含有小鼠全长IDOcDNA的PCOUS-2质粒,亚克隆至穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转染AD-293细胞进行包装,扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒并检测其滴度.RT-PCR和荧光显微镜鉴定和检测重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达,同时进行野生型腺病毒的检测.结果 经酶切及测序证实IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,且无野生型腺病毒的产生.结论 成功构建了含小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,为探讨IDO的生物学功能奠定了基础.     

热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体,为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础.方法 采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAd-HSP70,脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒vAdvHSP.收获病毒进行滴度鉴定, RT-PCR方法检测目的 基因在Hela细胞的转录表达.结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实HSP70基因正确插入腺病毒表达载体,并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒;荧光显微镜下可观察到GFP的表达,收获病毒的滴度为3.2×1012 U/L.结论 成功构建pAd-HSP70重组腺病毒表达载体,且重组腺病毒在Hela细胞能有效转录.     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.     

小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况.方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012) pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力.结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体.     

Betatrophin重组腺病毒过表达载体的构建

［摘要］目的: 应用基因同源重组技术,构建及鉴定携带小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)的复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步研究betatrophin的功能奠定基础。方法: 根据基因库中登录的小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)序列,经化学合成得到含BamHⅠ/ AgeⅠ酶切位点的小鼠betatrophin基因全长cDNA质粒,将其酶切后插入到带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的GV314载体CMV MCS 3FLAG SV40 EGFP中,得到重组病毒穿梭质粒pGV314 betatrophin;经BamHⅠ/ AgeⅠ双酶切后,与线性化的pDC315病毒基因组质粒体外同源重组,构建含有目的基因的腺病毒载体Ad betatrophin,酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,利用聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹法及测序鉴定重组的腺病毒。结果： 阳性克隆质粒Ad betatrophin在HEK293T细胞中成功包装出重组病毒,经PCR、蛋白质印迹及测序检测表明重组腺病毒包装成功。结论： 成功构建了携带小鼠betatrophin基因的复制缺陷型重组腺病毒过表达载体。     

人骨形成蛋白-7基因重组腺病毒的构建及其在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的:克隆人骨形成蛋白-7(BMP-7)基因并构建其重组腺病毒,观察其在兔BMSc中的表达. 方法:用RT-PCR方法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序;将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体形成转移质粒pAdTrack-CMV-BMP-7,经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1 Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定,PacI酶切线性化后转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7,将AdBMP-7体外感染兔BMSc后,以RT-PCR方法及观察AdEasy系统上的绿色荧光蛋白表达鉴定BMP-7基因的表达. 结果:用RT-PCR方法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因;酶切鉴定表明BMP-7基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功;经293细胞包装3 d后可观察到绿色荧光蛋白表达(GFP),氯化铯梯度离心法最终获得约3×109 efu/L滴度的重组病毒;体外感染兔BMSc后RT-PCR方法及荧光显微镜证实BMP-7基因可在兔BMSc中表达. 结论:成功克隆人BMP-7基因并构建其重组腺病毒,证实了其在BMSc的表达,为骨再生的局部基因治疗打下基础.     

细菌内同源重组构建pAdeasy-1/hp27mt腺病毒质粒

目的 :采用细菌内同源重组法高效制备含hp2 7mt基因的重组腺病毒质粒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,亚克隆至腺病毒穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,构成穿梭质粒 pShuttle -CMV/hp2 7mt;然后再用经PmeI酶切的 pshuttle-CMV/hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAdeasy - 1 /hp2 7mt;筛选同源重组质粒阳性克隆 ,提取pAdeasy - 1 /hp2 7mt质粒经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定。结果 :线性化的pShuttle-CMV/hp2 7mt转化含pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,1 2 - 2 0h后获得了30 %阳性重组质粒克隆 ,经酶切获得一大于 2 0kb的大片段和 3 .0kb的特征性片段 ,PCR反应扩增出了 2 75bp的片段 ,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因hp2 7mt。 结论 :用细菌内同源重组法可制备含hp2 7mt的重组腺病毒质粒且经济高效、简便、快捷。为转染 2 93细胞制备高滴度重组腺病毒提供高纯度的重组腺病毒质粒     

Molecular cloning of human heat shock protein 27 and study of its protective effects on oxidative damage in rat cardiomyocte H9c2

INTRODUCTIONApgionsgt-imnit omtiuclt icceellllsu slaurch o ragsa nciasrmdiso imsy omcoysttes e vaindde nnte iurons[1].Cardiomyocytes aging is associated with an increasedincidence of cardiac arrhythmias and diastolic ansystolic dysfunction,which may ultimately lead to hearfailure.Because of enormous suffering and health-carburdenthat cardiac dysfunction causes,much effort hagoneinto both understanding the mechanisms leading tage-related myocardial decline and discovering the accesses to re…     

人突变p27重组腺病毒的构建及其在结肠癌细胞SW480中的表达

目的 :为了探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及突变 p2 7的抗肿瘤特性 ,构建复制缺陷型重组hp2 7mt基因腺病毒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,经 2次亚克隆 ,插入到穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,形成转移质粒 pShuttle -CMV -hp2 7mt;然后再用PmeI线性化的 pShuttle -CMV -hp2 7mt转化含腺病毒骨架质粒 pAdeasy - 1的超感受态BJ5 183,使其在细菌内发生同源重组。重组质粒鉴定正确后经PacⅠ酶切 ,转入Ad2 93细胞 ,包装成重组腺病毒Ad -hp2 7mt。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定 ,用紫外分光光度计进行滴度测定。用重组 p2 7mt的腺病毒Ad - p2 7mt感染大肠癌细胞SW 4 80 ,WesternBlot检测p2 7蛋白的表达。结果 :用含pShuttle -CMV -hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ5 183后 ,可获得约 30 %的阳性重组质粒。PCR检测表明重组腺病毒DNA中含有目的基因。重组腺病毒滴度为 7.95× 10 15pfu/L。转染大肠癌细胞后 ,p2 7在SW4 80中获得了高表达 ,而未转染细胞和Ad -LacZ转染的细胞中仅有低表达。结论 :腺病毒作为一种基因转移载体 ,可有效介导 p2 7在肿瘤细胞中的表达 ,在肿瘤基因治疗方面具有很大的应用前景。     

HSP27基因的克隆与表达

目的构建热休克蛋白27(Heat shock protein 27,HSP27)真核表达质粒以用于肾脏缺血预适应(ischemia Preconditioning,IP)的作用及机制研究.方法利用乳腺癌细胞系MCS-7,用RT-PCR方法扩增HSP27全长基因,将HSP27基因克隆到真核表达载体pAAV-MCS中.重组质粒转染NIH3T3细胞,Western blot法鉴定重组质粒HSP27/pAAV-MCS能在哺乳动物细胞中正确表达.结果RT-PCR方法正确地扩增出全长HSP27基因.限制性内切酶酶切和测序结果证实HSP27基因克隆完全正确.重组质粒转染哺乳动物细胞系NIH3T3后,ECLWestern blot法证实了目的基因能在其中正确表达.结论成功地克隆真核表达重组质粒HSP27/pAAV-MCS,为下一步研究HSP27对肾脏缺血预适应的作用及其机制打下了基础.     

脂多糖通过上调热休克蛋白27的表达减轻小鼠肾缺血再灌注损伤

目的 探讨热休克蛋白27 (heat shock protein-27,HSP27)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)减轻小鼠肾缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)损伤中的作用.方法 雄性C57BL/6小鼠随机分为4组:假手术组、LPS+假手术组、肾IR组和LPS+肾IR组,每组又分为槲皮素(quercetin,200mg/kg)亚组和溶剂对照亚组.采用右肾切除+左肾肾蒂夹闭25 min后再灌注建立肾IR模型,在肾IR前3d腹腔注射LPS(3mg/kg)进行预处理,采用槲皮素(200 mg/kg)灌胃抑制HSP27的表达.再灌注后24 h,各组小鼠经腹主动脉采血检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平评估肾IR损伤模型,取左肾评估炎症反应程度、HSP27蛋白表达水平及凋亡相关蛋白easpase-3的活性.结果 LPS预处理可明显降低肾IR后的血清Cr、BUN水平,并减少肾小管损伤程度,同时能提高肾内HSP27的表达水平(P＜0.05);槲皮素能明显抑制肾内HSP27的表达水平,且能明显削弱LPS预处理对肾脏IR的减轻作用,包括升高Cr、BUN水平和造成更严重的炎症反应(P＜0.05).另外,LPS能明显降低肾脏IR后肾内caspase-3的活性,但槲皮素能明显削弱这种作用(P＜0.05).结论 LPS通过上调HSP27的表达减轻小鼠肾脏IR损伤.     

鼻咽癌放疗残灶中HSP70/HSP27蛋白的表达

目的：分析鼻咽癌原发组织HSP70/HSP27蛋白表达与放疗残灶的相关性,探讨HSP70/HSP27表达对鼻咽癌放疗残灶的预测价值。方法：应用SP免疫组织化学法检测58例鼻咽癌原发组织HSP70/HSP27热休克蛋白表达,其中规范放疗后有残存癌灶的28例鼻咽癌为实验组,随访5年无癌灶复发的30例为对照病例。结果：HSP70和HSP27在实验组阳性表达率分别为92.9％(26/28)和53.6%(15/28),而在对照组的阳性表达率为53.3％(16/30) 和53.3%(16/30),HSP70阳性表达率在两组间比较有统计学差异(P<0.05),而HSP27阳性表达率在两组间比较无统计学差异(P>0.05);HSP70和HSP27在实验组共同阳性表达率为50.0%(14/28),对照组为16.7%(5/30),两者比较有统计学差异(P<0.05);两者共同阴性表达率在实验组和对照组分别为3.6%(1/28) 和10.0%(3/30),两者相比无统计学差异（P>0.05）。结论：HSP70在鼻咽癌抗放射损伤中可能起重要作用,检测鼻咽癌组织HSP70蛋白表达对预测鼻咽癌放射后癌灶残存可能有重要价值。     

短期学习记忆对小鼠脑组织内热休克蛋白表达的影响

目的：建立小鼠短期学习记忆模型,研究热休克蛋白70（HSP 70）、热休克蛋白27（HSP 27）是否参与学习记忆过程．方法：采用Morris水迷宫建立学习记忆模型,同时设立游水对照组及空白对照组．训练结束后处死小鼠,取脑,灌注固定脑组织,冰冻切片,免疫组化染色检测脑组织中HSP70,HSP27的表达情况．结果：学习记忆模型组小鼠的海马、杏仁核簇及大脑额叶皮质高表达HSP70,游水对照组HSP70免疫阳性细胞数较少,空白对照组HSP70几乎无表达;HSP27在各组均无表达．结论：HSP70可能是参与学习记忆的重要分子之一．     

热休克蛋白27在单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质损伤中的表达

目的：研究肾小管间质损伤大鼠肾组织中热休克蛋白27(HSP7)的表达及其可能的作用。方法：建立单侧输尿管梗阻(UU0)肾小管间质损伤大鼠模型，应用组织病理学和免疫组织化学SP法观察模型组和对照组大鼠肾小管间质损伤情况，以及HSP27的表达。结果：对照组肾小球、少数肾小管和集合管HSP27弱阳性。模型组梗阻肾皮质HSP27的表达明显上调，分布于扩张的肾小管，肾小管HSP27阳性表达率于实验第3天达高峰，以后随着肾小管间质损伤程度的加重逐渐下降，并与肾小管损伤指数呈负相关。结论：肾小管间质损伤过程中，皮质肾小管HSP27表达明显上调：HSP27的表达可能是损伤肾小管上皮细胞的自身保护反应。     

热休克蛋白27在大肠癌中的表达及其与淋巴结转移的关系

目的 探讨热休克蛋白27(HSP27)表达与大肠癌淋巴结转移的关系.方法 应用免疫组化方法检测68例临床大肠癌组织标本中Hsp27的表达情况.应用RT-PCR、Western blotting和免疫组化方法检测不同转移潜能大肠癌细胞株中Hsp27 mRNA和蛋白的表达情况.结果 在大肠癌组织中,热休克蛋白27的表达率与年龄、性别、淋巴结转移、临床分期无相关性(χ2test,P＞0.05),但其过表达和大肠癌淋巴结转移显著负相关(Fisher's exact test,P=0.035).应用RT-PCR、Western blotting和免疫组化方法检测结果显示Hsp27基因和蛋白在高淋巴结转移潜能的SW620细胞中呈低表达,在低淋巴结转移潜能的SW480细胞中呈高表达.结论 Hsp27和大肠癌肿瘤细胞的转移行为可能为负相关,可能在阻止其转移中发挥重要作用.     

DJ-1和HSP27在侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤中的差异表达

目的: 研究垂体腺瘤中癌基因蛋白DJ-1、热休克蛋白27(HSP27)的表达是否与侵袭性相关。方法: 采用Western印迹法检测侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤各20例组织中DJ-1和HSP27蛋白的表达,并分析DJ-1和HSP27蛋白水平与侵袭性的关系。结果: 20例侵袭性垂体腺瘤中DJ-1和HSP27蛋白表达的强阳性率分别为70%(14/20)和80%(16/20),20例非侵袭性垂体腺瘤中DJ-1和HSP27蛋白表达的强阳性率均为10%(2/20),侵袭性垂体腺瘤明显高于非侵袭性垂体腺瘤(P<0.05)。DJ-1和HSP27的表达水平与垂体腺瘤侵袭性之间均呈正相关(分别r=0.350,P<0.05;r=0.400,P<0.05)。结论: DJ-1和HSP27在侵袭性垂体腺瘤中的异常表达可能在侵袭性垂体腺瘤的形成和发展中发挥重要作用,与垂体腺瘤的侵袭性密切相关。