CCl4诱导大鼠肝硬化形成过程中Caspase-12蛋白表达与肝细胞凋亡的相关性

目的:探讨CCl4大鼠肝硬化形成过程中Caspase-12蛋白表达与肝细胞凋亡的相关性.方法:首次CCl4 3 mL/kg sc,以后500 mL/LCCl4橄榄油溶液2 mL/kg sc,2次/wk,共计12wk制备大鼠肝硬化模型.设4 wk、8 wk、12wk 3个时间点,动态观察肝细胞凋亡指数、肝组织Caspase-12免疫组织化学及蛋白表达.结果:模型大鼠4 wk时呈典型的急性肝损伤改变,8 wk时大鼠呈典型的慢性肝损伤肝纤维化的病理改变,12 wk时已形成肝硬化;随着肝损伤加重和肝硬化形成,肝细胞凋亡指数显著增加,模型对照4 wk与正常组、模型对照8wk比较有显著差异(70.4±11.59 vs 9.6±1.14,95.8±10.94,P＜0.01),模型对照12 wk与模型对照8 wk比较有统计学意义(122.8±17.51 vs 95.8±10.94,P＜0.05).Caspase-12蛋白表达亦显著增加,模型对照4 wk与正常组、模型对照8 wk比较有显著差异(0.071±0.014 vs 0.014±0.007,1.172±0.028,P＜0.01),模型对照12wk与模型对照8 wk比较亦有显著差异(1.84±0.083 vs 1.172±0.028,P＜0.01);且肝细胞凋亡指数和Caspase-12蛋白表达量之间呈正相关(r=0.89,t=9.125,P＜0.01).结论:内质网凋亡通路参与CCl4大鼠肝硬化形成过程中肝细胞凋亡事件,其关键的凋亡酶Caspase-12蛋白表达量基本能够反映肝细胞的凋亡程度.     

内质网应激凋亡通路中Caspase12激活介导的肝纤维化大鼠肝细胞凋亡

目的:观察内质网应激凋亡通路中关键信号分子Caspase12活性变化,探讨其在肝纤维化大鼠肝细胞凋亡中的可能作用.方法:将Wistar大鼠随机分为正常4 wk组、正常8 wk组、肝纤维化4 wk组和肝纤维化8 wk组.皮下注射40%CCl_4花生油溶液诱导肝纤维化形成,剂量0.3 mL/100 g体质量,2次/wk.肝组织中GRP78、GRP94及Caspase12基因水平的表达通过实时荧光定量PCR技术测定;GRP78、GRP94、Procaspase12及活性Caspase12蛋白的表达采用蛋白质免疫印迹法检测;肝细胞凋亡通过TUNEL法测定.结果:肝纤维化4 wk组大鼠肝组织中GRP78、GRP94及Caspase12 mRNA表达显著高于正常4 wk组大鼠;肝纤维化8 wk时,肝组织中GRP78、GRP94、Caspase12 mRNA的表达较正常8 wk组显著增加.通过Western blot对各指标蛋白水平的检测发现,肝纤维化4 wk时大鼠肝脏中GRP78、GRP94、Procaspase12及活性Caspase12蛋白的表达较正常4 wk组大鼠显著增加;肝纤维化8 wk时,肝脏中GRP78、GRP94、Procaspase12、活性Caspase12蛋白的表达仍保持在高水平,但与肝纤维化4 wk时比较无显著差异.细胞凋亡检测发现,与正常组大鼠比较,肝纤维化4 wk及8 wk组大鼠肝细胞凋亡均明显升高.结论:内质网应激凋亡通路中关键信号分子Caspase12活化可能介导了肝纤维化大鼠肝细胞凋亡的发生.     

四氯化碳诱导鼠肝组织血管病变的动态观察

目的研究CCl4诱导鼠肝内血管病变的动态变化及其在肝纤维化(LF)及肝硬变(LC)病变中的意义.方法SD♂6月龄鼠50只,随机分成2组,40只用于造模,10只为对照.实验鼠以剂量3 mL/kg,皮下多点注射,500 mL/LCCl4(用液状石蜡配制),2次/wk.对照组不处理.分别于实验2,5,8,12 wk解剖造模鼠10只,作冰冻及石蜡切片观察.对照鼠方法同上.结果实验2 wk鼠体质量略下降而肝质量增加,5 wk始肝质量下降,至8 wk～12 wk最明显(P＜0.01),且肝表面伴结节形成,组织学证实已发生LC.在LC的发展中肝内血管病变起引爆和桥梁作用,通过血管炎症-血管阻塞-血管增生和改建-血管纤维化而最终形成纤维带,致肝组织血液循环障碍引发肝实质变性坏死.结论肝内血管病变是导致LC及肝细胞病变的关键因素.     

牛磺熊去氧胆酸抑制四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化

目的:探讨牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)对四氯化碳(CCl4)诱发大鼠肝纤维化的抑制作用.方法:健康6周龄♂SD大鼠75只,随机分为空白对照组、模型对照组、TUDCA低剂量组、TUDCA高剂量组、己酮可可碱(PTX)阳性对照组,每组15只.用40%的CCl4油溶液,大鼠背部皮下注射3 mL/kg(首次5 mL/kg)造大鼠肝纤维化模型.各组给予相应浓度干预药物溶液灌胃8 wk,检测血清纤维化指标HA、LN、Ⅳ-C:胶原纤维染色(Masson三色染色)观察各组胶原纤维面积比变化;免疫组织化学SP法观察TGF-β1及α-SMA在大鼠肝组织中的表达及分布变化.结果:8 wk后,TUDCA及PTX干预组与模型组相比,血清HA、LN、Ⅳ-C有明显降低(146.33±35.13,162.2±24.80,137.14±22.24 vs 252.83±51.94;77.20±11.84,66.80±16.78,82.00±10.74 vs 108.00±30.00;14.14±2.59,12.60±3.17,10.09±2.22 vs 25.08±5.93,均P<0.05);肝组织纤维间隔变细或消失,形成弥漫性肝硬化结节减少,胶原面积比降低(P<0.05);免疫组织化学结果显示,TUDCA及PTX干预组与模型组相比,TGF-β1及α-SMA阳性表达减少,图像软件半定量分析结果显示差异有显著性(P<0.05).而TUDCA低剂量组与高剂量组及PTX组三者之间结果差异无显著性.结论:TUDCA对CCl4诱发的大鼠肝纤维化有拮抗作用,主要是通过减少TGF-β1合成,抑制HSC细胞活化,降低细胞外基质合成.延缓肝纤维化进程.     

p38MAPK在大鼠实验性肝纤维化发生中的表达及其意义

目的:观察p38MAPK在实验性大鼠肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)发生过程中表达量的变化及其定位,从而揭示p38MAPK信号传导通路与HF形成之间的关系.方法:采用CCl4 sc诱导大鼠HF模型,36R ♂sD大鼠(体质量在180-220 g)随机分为正常对照组(12只)和CCl4造模组(24只),造模3、6、9 wk结束时分别随机处死各组大鼠.取其肝脏观察HF形成过程中不同时间段各组大鼠肝组织病理变化,用RT-PCR技术检测p38MAPKmRNA在造模过程中肝组织中的表达变化,免疫组化方法检测p38MAPK在造模过程中肝组织中蛋白表达量的变化,及其在肝组织中的表达分布情况.结果:与正常对照组比较,CCl4诱导的实验性大鼠HF不同时间段纤维化程度明显加重,随着HF的形成,p38MAPK在mRNA水平和蛋白水平都表现出增加的趋势,并且主要表达于肝脏的间质细胞,肝细胞未见染色.结论:p38MAPK在HF的形成中持续上调,参与HF形成的病理过程,p38MAPK信号传导通路活化可能促进CCl4诱导的HF的形成.     

四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝窦毛细血管化的形成

目的：观察四氯化碳（CCl4）诱导的大鼠肝纤维化过程中肝窦毛细血管化的形成过程,探讨其与肝纤维化的关系。方法32只清洁级雄性SD大鼠,随机分为正常对照组,肝纤维化模型组,正常对照组大鼠腹腔注射0．9％氯化钠溶液2 mL/kg ,模型组大鼠腹腔注射50％ CCl4-蓖麻油混合液2 mL/kg ,每周2次,共8周;分别于造模第2、4、6、8周处死大鼠,观察肝组织炎症及纤维化程度,放射免疫法检测血清中透明质酸（HA）的含量,透射电镜观察肝窦窦壁结构,S-P 免疫组织化学检测各组大鼠肝组织CD31、层黏连蛋白（LN）、IV型胶原（Col-IV）的表达。结果肝脏组织学证实CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型构建成功,6周可见纤维间隔形成;透射电镜显示,CCl4诱导2周时,部分肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells ,LSEC）窗孔减少,内皮下未见基底膜（Basement membrane,BM）,随着造模的进程,LSEC 窗孔进一步减少,部分甚至消失,第6、8周时局部肝窦内皮下形成连续的BM。同时,随着肝纤维化的进程,HA浓度逐渐升高,肝窦内皮细胞表面标志物CD31及基底膜主要成分Col-IV、LN表达逐渐增强。结论在CCl4诱导大鼠肝纤维化过程中,肝窦毛细血管化是逐渐形成的,LSEC失窗孔早于纤维间隔的形成,而肝窦内皮下基底膜出现在纤维间隔形成以后。     

四氯化碳诱导鼠肝血管生成因子免疫组织化学观察

目的研究CCl4诱导鼠肝血管生成因子表达与肝纤维化(LF)及肝硬变(LC)病变的关系.方法SD雄性6mo龄鼠50只,随机分成2组,40只用于造模,10只为对照.实验鼠以3 mL·kg-1皮下多点注射500 mL·L-1CCl4(用液状石蜡配制),2次·wk-1.对照组不处理.分别于实验2,5,8及12wk解剖造模鼠10只,作冰冻、石蜡切片及VEGF,α-SMA及ⅧR Ag免疫组化观察.结果实验2 wk鼠体质量略下降而肝质量增加,5 wk始肝质量下降,至8 wk～12 wk最明显(P＜0.01),且肝表面伴结节形成,组织学证实已发生LC.免疫组化显示,在实验2 wk VEGF阳性肝细胞局限于病变周围,部分肝窦内皮细胞α-SMA,ⅧR Ag示阳性表达,以后随肝血管病变加重而上述因子表达强度及分布范围渐增加,提示两者关系密切.结论肝细胞在LF及LC发展中担当一重要角色.     

补锌对大鼠血清锌和实验性肝纤维化的影响

目的:观察不同剂量补锌对大鼠血清锌含量及实验性肝纤维化的影响. 方法:将Wistar大鼠46只分为正常对照组、四氯化碳(CCl4)模型组、高糖组、补锌高剂量组和低剂量组.后四组动物每只给CCl4油溶液0.15 mL腹腔内注射2次/wk, 共注射8 wk;后三组大鼠分别给予高糖、葡萄糖酸锌,观察每一种情况对大鼠血清锌含量、肝功能和肝纤维化形成过程产生的影响. 结果:实验的4 wk和8 wk时,补锌组与模型组及高糖组血清ALT均增高,各组间差异不明显,但补锌组AST均明显降低,与模型组及高糖组比较有较明显差异(164.8±54.72a,143.5±46.6b vs 262.0±142.4,260.4±125, aP<0.05,bP<0.01).补锌组大鼠血清锌含量在8 wk时均较模型组明显增高(30.4±4.6,30.4±4.6 vs 16.2±4.3, P<0.01),维持在正常水平,并对大鼠肝纤维化有一定抑制作用,但两个剂量组间未见明显差异(36.3±5.4 vs 30.4±4.6).高糖使大鼠的体重明显增加,未见大鼠肝纤维化的改善. 结论:补锌对肝损伤动物血清锌及肝纤维化的影响表现在后期,采用低剂量较长期的补锌方法可能有效安全.     

胆管结扎和四氯化碳诱导Wistar大鼠肝纤维化模型的建立及相关指标的对比分析

目的比较胆管结扎(BDL)、四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化的生化指标、肝脏病理学及纤维连接蛋白(FN)的表达。方法 90只健康雄性Wistar大鼠,分为CCl4肝纤维化模型组(44只)及其对照组(6只)和BDL肝纤维化模型组(30只)及其对照组(10只)。CCl4肝纤维化模型组是采用50%的CCl4橄榄油溶液对大鼠进行腹腔注射的方法来制备模型,而BDL肝纤维化模型组则采用结扎大鼠胆总管的方法来制备。观察大鼠一般情况,生化方法测血清ALT、AST、TBil、DBil;ELISA法测血清透明质酸(HA)和层黏连蛋白(LN)水平。HE和Masson染色观察肝组织的病理学变化,免疫组织化学染色观察肝组织FN表达。计量资料组间比较采用t检验。结果血清生化学结果显示,BDL组大鼠自胆管结扎术后第7天开始,TBil及DBil即上升到较高水平且随后一直保持此水平,CCl4肝纤维化模型组大鼠2周始逐渐升高,至8周达高峰;BDL大鼠纤维化指标HA、LN水平显著高于同期CCl4模型组;CCl4模型组大鼠可见肝细胞弥漫性脂肪变性,汇管区-汇管区或汇管区-中央静脉间纤维间隔形成极为显著,BDL大鼠则表现为肝内胆管显著增生,炎性细胞浸润及纤维间隔形成同时存在;BDL组中FN的表达呈分散无规则型,且纤维组织细小,而CCl4组的FN多集中表达于小叶之间的间隔处,纤维组织粗大。结论 BDL和CCl4均可诱导大鼠肝纤维化,BDL较早引起肝功能及肝纤维化指标升高,可见明显胆管增生,CCl4则以脂肪变性为主;FN在两种模型中表达分布不同。     

硫代乙酰胺诱导大鼠持久性肝纤维化模型的制备

目的:用硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)灌胃法诱导大鼠形成肝纤维化,建立一种稳定持久实用的大鼠肝纤维化模型.方法:将♂SD大鼠随机分为正常组和模型组,模型组采用质量浓度为3%的TAA对SD大鼠进行隔天灌胃,灌胃量为160 mg/kg体质量[灌胃体积(m L)为体质量(g)/187.5];正常组采用溶剂蒸馏水代替TAA灌胃.灌胃6 w k后处死大鼠,采集血清和肝组织,血清分别进行肝功能(血氨、碱性磷酸酶、总胆红素、白蛋白/球蛋白)和细胞因子[肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、肝素结合表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor,HB-EGF)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、a-平滑肌抗体(a-smooth muscle antibody,a-SMA)]水平检测,肝组织分别进行HE和Masson染色,并对纤维化程度进行病理分级.留取部分成模大鼠,停止灌服TAA 11 wk后,取肝组织做HE染色,观察肝纤维化自愈情况.结果:TAA灌胃6 wk后,大鼠肝纤维化形成率为100%.与对照组相比,模型组大鼠肝功能变化显著,其中血氨、碱性磷酸酶和总胆红素浓度显著升高,白蛋白/球蛋白比值显著降低(P0.01);血清中细胞因子HGF与HBEGF水平显著降低,IL-6、a-SMA水平显著升高(P0.01).停用TAA 11 wk后,与11 wk前相比,HE染色显示肝组织纤维化程度,未见显著变化.结论:TAA灌胃6 wk可以形成稳定和持久的肝纤维化,肝纤维化形成率高且速度快,是一种简便实用的肝纤维化模型制备方法.