In Vitro Expression of Hepatitis C Virus Non-structure 5 Antigen in the HepG2 Cell Line

ItisofgreatsignificancetoestablishasensitivepropagationsystemofHCVinvitroforstudyingthefeaturesofHCV,pathogenesisofHepatitisC,thetreatmentofanti--virusandstudyofvaccine.Wede-tectedthepositiveandnegativelineofHCVinTlymphcellsofhumaninndroinpreviousstudyLI],andpresentedinthispaPeristhefurtherstudyoninvljroexpressionofHCV.lMATERMisANDMETHODS1'1PositiveInocuIumsofHCVRNATheserumofHCVRNAwith1evelof2X10'copy/mlwasselected,anddefinedbyfluorescentquantificationmethed(Thereagentkitwa…     

丙型肝炎阳性血清直接感染HepG2细胞的初步研究

目的：用丙型肝炎（丙肝）阳性血清（抗ＨＣＶ阳性及ＨＣＶＲＮＡ ＲＴ－ＰＣＲ阳性）感染ＨｅｐＧ２细胞,以期建立稳定的ＨＣＶ感染的细胞模型。方法：采用丙肝阳性血清连续感染法感染ＨｅｐＧ２细胞,用逆转录多聚酶链反应检测传代ＨｅｐＧ２细胞内ＨＣＶＲＮＡ正链和负链,电镜观察感染后的细胞内的病毒颗粒,免疫组化方法检测感染后的细胞内丙肝病毒蛋白抗原（ＨＣＶＮＳ５、ＨＣＶ ｃａｐｓｉｄ）的存在。结果：感染后传代的     

丙型肝炎阳性血清直接感染HepG2细胞的初步研究

目的 :用丙型肝炎 (丙肝 )阳性血清 (抗HCV阳性及HCVRNART PCR阳性 )感染HepG2细胞 ,以期建立稳定的HCV感染的细胞模型。方法 :采用丙肝阳性血清连续感染法感染HepG2细胞 ,用逆转录多聚酶链反应检测传代HepG2细胞内HCVRNA正链和负链 ,电镜观察感染后的细胞内的病毒颗粒 ,免疫组化方法检测感染后的细胞内丙肝病毒蛋白抗原 (HCVNS5、HCVcapsid)的存在。结果 :感染后传代的第一代至第三代细胞内检出HCVRNA正链及负链 ;在感染后传代的细胞内发现球形、密集分布的类丙肝病毒颗粒 ,直径为 30～ 6 0nm ;免疫金银染色发现部分细胞内有聚集的银染颗粒 ;免疫电镜检查在细胞胞浆的囊泡样结构中发现聚集的金颗粒。结论 :HCV可在HepG2细胞内复制 ,可形成病毒颗粒 ,可随细胞传代。本研究初步建立了用丙肝阳性血清感染HepG2细胞的丙肝病毒感染细胞模型     

体外培养人肝癌细胞系7721中HCV复制和表达特性

建立支持ＨＣＶ体外长期复制的细胞培养体系,研究其体外复制和表达特性。方法：将ＨＣＶ感染血清接种人肝癌细胞系７７２１后,以逆转录－聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞内ＨＣＶ的感染和复制情况。结果细胞内和培养上清中在孵育后的３月余均可间断地检测出ＨＣＶ正链和／或负链ＲＮＡ,多种ＨＣＶ抗原在细胞内能稳定有达;ＨＣＶ ＲＮＡ和抗原多位于胞浆中,结论ＨＣＶ在７７２１细胞系中的复制和表达与体内感染状态接     

重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的 探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法 用人工构建的HCV感染易感细胞系7721,培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达,并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原E1在细胞中的表达。结果 人工构建的HCV感染7721细胞72h后,RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA,细胞培养上清中可检出HCV正链RNA,CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论 构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。     

人肝癌细胞系7721与原代人胎肝细胞用于体外培养HCV的对比研究

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）在体外培养原代人胎肝细胞和人肝癌细胞系7721中复制和表达的异同,探讨HCV体外培养条件。方法 原代人胎肝细胞系7721分别与HCV感染血清共孵育后,用逆转录-聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化检测细胞和培养上清中的HCV RNA和抗原表达。结果 从孵育的2～3天,即可在细胞内和/或培养上清中间断地检出HCV RNA（其中HCV在7721细胞株中的复制至少可达66d,HCV在 人胎肝细胞中的复制持续25d）;HCV抗原可在感染细胞内得到稳定表达,感染细胞内存在HCV负链RNA杂交信号,且多位于细胞浆。结论 两种肝细胞对HCV易感,尤其是7721细胞可以稳定地支持HCV体外复制,可用于HCV体外长期培养的靶细胞。     

重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的 探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法 用人工构建的HCV感染易感细胞系7721，培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达，并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原EI在细胞中的表达。结果 人工构建的HCV感染7721细胞72h后、RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA，细胞培养上清中可检出HCV正链RNA，CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论 构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。     

丙型肝炎病毒感染细胞模型的实验研究

目的 建立接近体内自然感染状态并能长期复制的丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞模型．方法 用HCV阳性血清感染人肝癌细胞株HepG2、SMMC 7721及胎肝细胞株L02，继续培养60d，用巢式逆转录-聚合酶链反应(nested RT-PCR)检测培养细胞及上清中正、负链HCV RNA。结果 HepG2、SMMC 772l在感染后第2-30d，L02在感染后第3-30d细胞中可以间断检出HCV正链RNA；3株细胞的细胞内HCV负链RNA均在感染后第3-30d可以间断检出，检出率与正链RNA接近。3株细胞以HepG2细胞中HCV RNA正、负链检出率较高，并在第3l—60d仍可间断检出，但复制程度逐渐减弱。3株细胞的培养上清中HCV正链RNA感染后也呈间断阳性，检出率与细胞内正链RNA基本一致。培养上清中均末检出HCV负链RNA。结论 HePG2、SMMC772l及L02细胞均对HCV易感，并能支持HCV长期复制。而HePG2细胞是较为理想的HCV体外感染细胞模型。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法：扩增HCV NS5A基因，构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3．1(-)—NS5A；并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：质粒pcDNA3．1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白，共转染实验中pcDNA3．1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3．8倍。结论：构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因，深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。     

HCV发夹状siRNA表达质粒的构建及作用研究

目的建立HCV感染动物模型,并对HCV进行RNA干涉。方法制备HCV感染的HepG2细胞,RT-PCR法鉴定后腋下注射裸鼠,免疫组化法检测瘤组织内HCV NS3表达情况。制备带绿色荧光蛋白（GFP）的HCVsiRNA表达质粒,转染HepG2细胞,观察GFP表达情况。将此质粒注射模型小鼠,取瘤组织,RT-PCR及免疫组化法对其进行检测。结果在HCV感染的裸鼠实体瘤中检测到HCV NS3蛋白的稳定表达。成功构建了HCV发夹siRNA表达质粒,该质粒转染细胞后能够在其内正确表达。将该质粒尾静脉注射HCV感染的模型小鼠,注射4d后瘤组织内HCV NS3抗原阳性细胞阴转。结论成功建立了HCV感染的裸鼠模型,构建了HCV发夹siRNA表达质粒,该质粒能成功地干涉模型小鼠中的HCV。     

HBsAg/HBsAb double positive hepatitis B virus infection model <Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">in vivo</Emphasis>

The pathogenesis of HBsAg （＋）/HBsAb （＋） double positive hepatitis B virus infection was investigated by simulating HBsAg/HBsAb coexistence in vitro and establishing HBsAg/HBsAb double positive model in vivo. Eukaryotic expression plasmids PCI-SY, PCI-adw, PCI-adr, PCI-ayw, which expressed S gene product of different serotypes, were constructed and transfected into HepG2 cells. Recombinant proteins were purified from the transfected cells. At the same time, HBsAg mouse antiserum was obtained by immunizing mice with PCI-SY plasmid. HBsAg/HBsAb coexistence was simulated using these antigens and antiserum. Furthermore, the expression plasmids expressing different serotypes of S gene product including PCI-adw, PCI-adr, and PCI-ayw were injected into mice via tail vein. HBsAg and HBsAb in mice sera were tested at the first and 7th day respectively after antigen plasmids injection. Both in vitro simulation and in vivo animal models demonstrated that HBsAg antigen and HBsAb of the same serotypes Could not coexist, but HBsAg antigen and HBsAb of different serotype could coexist. HBsAg/HBsAb double positive hepatitis B virus infection could be due to infection of viruses of different serotypes.     

丁型肝炎病毒复制包装载体的构建

目的  构建一种可以实现丁型肝炎病毒（HDV）复制包装的HDV转座子载体。方法  采用分子克隆方法构建含HDV复制子和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表达框的转座子（PB）载体PB126I3,将构建好的载体转染HuH-7细胞,转染48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,转染48 h后收集细胞上清用酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBsAg的表达,质粒转染细胞8.5 d后提取病毒用逆转录荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测HDV核糖核酸（RNA）的含量;同时细胞上清病毒浓缩后感染HBV受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白（Na+/NTCP）稳定转染的HepG2.N9细胞系并于感染后第7天用免疫荧光检测细胞内HDVδ抗原的表达。结果  HDV复制包装载体PB126I3瞬时转染HuH-7后细胞上清可检测到HBsAg的表达和较高滴度的HDV颗粒,并且该病毒颗粒感染HepG2.N9细胞7 d后细胞内可检测到HDVδ抗原。结论  HDV复制包装转座子载体构建成功,为未来HDV的大规模复制包装以及尝试建立HDV稳定转染细胞系提供前期基础。

     

HBV转染肝癌细胞系基因表达谱改变的研究

目的 利用寡核苷酸芯片筛选HBV感染应答基因,探讨HBV感染分子致病机制.方法 选用Agilent Human 1A Oligo基因芯片进行乙型肝炎基因表达改变的研究,用Cy3标记实验细胞(HepG2.2.15细胞),Cy5标记对照组细胞(HepG2细胞),比较HepG2.2.15细胞与HepG2细胞之间的基因表达谱差异;用适时定量PCR(RQ-PCR)对部分差异基因进行验证.结果 通过杂交、扫描、统计学分析,根据P Value LogRatio值及gProcessed signal/rProcessed signal值从近20 000个基因中共筛选出差异表达基因744个,其中423个基因表达上调,321个基因表达下调.用RQ-PCR技术对其中4个相关基因胰岛素样生长因子2(IGF2)、甲胎蛋白(AFP)、干扰素同源序列结合蛋白(ICSBP)、核糖核苷酸还原酶缩多氨酸M1(RRM1)的表达差异进行了验证,与表达谱的结果基本保持一致.结论 通过验证,表达谱芯片的杂交结果真实可靠,为下一步继续进行差异表达基因的研究、了解HBV的致病机制打下了基础.     

高能X线照射对人肝癌细胞株HepG2凋亡及bcl-2、Fas表达的影响

目的:研究高能X线照射后不同时间点人肝癌细胞株HepG2凋亡及bcl-2、Fas表达的变化,为原发性肝癌放射治疗的时间剂量分割提供借鉴。方法:用吸收剂量为5Gy的6MVX线单次照射HepG2细胞,以流式细胞仪测定受照后不同时间的细胞凋亡率,以免疫细胞化学法检测细胞受照前后bcl-2和Fas的表达水平。结果:高能X线可诱导HepG2细胞发生凋亡,照射后6h细胞凋亡率达到高峰(32%),同时bcl-2表达水平下降,Fas表达水平升高。结论:高能X线能够诱导肝癌细胞株HepG2发生凋亡,bcl-2及Fas可能参与其细胞凋亡的调控。     

丙型肝炎病毒核心区蛋白在HepG2细胞中的表达

目的 :构建能稳定表达丙型肝炎病毒核心区蛋白的哺乳动物细胞系 ,以便对丙型肝炎病毒核心区蛋白的抗原性及其他功能作进一步研究。方法 :通过PCR扩增丙型肝炎病毒核心基因 ,将其亚克隆入真核表达质粒pcDNA3.1( )中 ,用脂质体包裹后转染肝癌细胞系HepG2 ,通过G4 18筛选获得稳定转染细胞系 ,并通过间接免疫荧光法检测HepG2中丙型肝炎病毒核心区蛋白的表达。结果 :克隆的基因全长 5 94bp ,并经测序和重组质粒双酶切证实为所需目的基因 ;经间接免疫荧光验证实转染了目的基因的HepG2细胞中有丙型肝炎核心区蛋白的表达。结论 :丙型肝炎病毒核心区蛋白能在HepG2细胞中稳定表达。     

丙型肝炎病毒核心蛋白抑制shRNA介导的RNA干扰作用

目的研究丙型肝炎病毒编码的蛋白对RNA干扰的抑制作用,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子。方法构建丙型肝炎病毒不同蛋白质的真核表达质粒,加入萤火虫荧光素酶基因的RNA干扰体系,共转染HeLa细胞,检测萤火虫荧光素酶活性以观察RNA干扰效果的变化,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子。在针对内源性GFP的RNA干扰体系中进一步确证该种抑制作用。利用共转染方法观察该蛋白抑制RNA干扰的剂量效应关系、在不同细胞系中的作用以及对siRNA介导的RNA干扰是否有相同的拮抗作用。结果加入核心蛋白后,萤火虫荧光素酶活性恢复到80%,与空白对照比较有显著性差异(P<0.05)。在绿色荧光蛋白RNA干扰体系中,核心蛋白使绿色荧光蛋白的表达强度明显增加。该种对抗RNA干扰的作用在HepG2、HEK293和HeLa细胞中均存在,且呈剂量依赖关系。在siRNA介导的RNA干扰体系中,加入核心蛋白后萤火虫荧光素酶活性无显著性变化(P>0.05)。结论核心蛋白能够对抗shRNA介导的RNA干扰作用,但不能对抗siRNA介导的RNA干扰作用,这种作用具有普遍性。核心蛋白对抗RNA干扰的作用可能有利于提高丙型肝炎病毒在宿主细胞内的生存能力并导致持续感染,亦可能在丙型肝炎病毒致病机制中发挥重要作用。     

Characteristics of HCV replication and expression in a cultured human liver carcinoma cell line in vitro

ProgressonhepatitisCresearchhasadvancedquickly.However,theabsenceofcellculturesystemofHCVinfectionhashamperednotonlytheunder-standingofitslifecycle,butalsotheanalysisofthemoleculardeterminantsofitspersistence.Toidentifycriticalepitopesthatelicitaneutralizingantibodyre-sponseandtounderstandthepathogenesisofpersis-tentHCVinfection,efficientcellmodelsofHCVin-fectionisneeded[1].HumanT-lymphocytecelllines[2-5],humanfibroblastcells[6](VH3),peripheralbloodmono-nuclearcells[7](PBMCs)andhepatocy…     

肝癌细胞乙酰胆碱酯酶表达水平与丙型肝炎病毒感染之间的相互影响

目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）感染对乙酰胆碱酯酶（AchE）表达水平的影响以及细胞内AchE活性的变化对HCV感染的影响。方法 以细胞培养来源的HCV（HCVcc）感染人肝癌细胞系Huh7细胞,用蛋白质印迹法以及实时荧光定量PCR（qPCR）进一步验证HCV感染对AchE表达水平的影响,AchE活性检测试剂盒检测细胞内AchE活性的变化。以AchE抑制剂多奈哌齐和伊托必利处理Huh7细胞,同时用HCVcc感染,通过蛋白质印迹法以及免疫荧光法检测Huh7细胞的HCV感染情况。用针对AchE基因的小干扰RNA（siRNA）转染Huh7细胞,随后用HCVcc感染Huh7细胞,通过蛋白质印迹法和免疫荧光法检测AchE的表达以及HCV感染情况。结果 HCVcc感染Huh7细胞60 h后,AchE蛋白表达水平升高,同时酶活性也增强（P均<0.01）。AchE抑制剂呈浓度依赖性抑制HCV对Huh7细胞的感染（P<0.01）。用siRNA敲低AchE的表达后,HCV对Huh7细胞的感染降低（P<0.01）。结论 HCV感染Huh7细胞能上调AchE的表达并增强AchE活性,AchE表达增加和活性增强都能促进HCV的感染,表明AchE在HCV感染Huh7细胞的过程中起着正反馈增强感染的作用。     

Expression of core gene cDNA of Chinese hepatitis C virus in HepG2 cell line

AlthoughthegenomeofseveralstrainsofhepatitisCvirus(HCV)havebeenclonedandscquenced,theHCVparticleshavenotbeenobservedsofar.Currently,becauseofverylowInfectionefficiency,oneofthemajorimpedimentstothestructuralanalysisofHCVgenomeandgeneticanalysisofviralreplicationisthelackofareliablecellculturesystempermissiveforH(IVreplicanon.Inthisstudy,usingrecomblnantDNAtechnlque,weconstructedarecombinantplasmidbysubcloningcoregenecDNAofChineseH(7VisolateIntoaeukaryoticexpressionvectorPTM3andexpres…     

中国人丙型肝炎病毒核心基因cDNA在HepG2细胞中的表达

目的：将中国人丙型肝炎病毒（HCV）核心基因cDNA克隆到真核细胞表达载体pTM3中，并在HepG2细胞中表达HCV核心蛋白．方法：利用DNA重组技术,将HCV／C基因cDNA定向克隆到pTM3中,采用痘苗病毒／噬菌体T7多聚酶短暂表达体系,在Lipofectin介导下将重组质粒转染HepG2细胞。结果：重组质粒转化Top10F＇细菌,随机挑取10个Amp抗性克隆,经EcoRⅠ、PstⅠ酶切鉴定，得到2个pTM3-Q534克隆。HepG2转染细胞以间接免疫荧光法鉴定证实存在HCV核心蛋白的表达．结论：HCV／C基因cDNA在粘粒载体中已获得克隆和初步表达．