TC—1基质细胞系促进逆转录病毒介导的小鼠骨髓造血细？…

目的：摸索逆转录病毒介导的理想的造血细胞基因转染体系。方法：以人多药耐药基因１及增强型绿色荧光蛋白基因为报告基因,比较了小鼠骨髓细胞与病毒包装共培养、与骨髓基质细胞系ＴＣ－１共培养及单纯上清感染等不同体系的转染效率。结果：与单纯上志染法相比,ＴＣ－１基质细胞可明显提高外源基因的转染效率。３组中,以与病毒包装细胞共培养组转染效率最高。结论：骨髓基质细胞介导基因转染的方法,既可促进靶基因的转染效率,又     

人突变DHFR基因高效逆转录病毒载体及其在小鼠造血细胞…

本文用转染了人突变ＤＨＦＲ基因逆转录病毒载体的新一代产病毒细胞ＡＭ１２－Ｓ３１，研究了其耐药特性，产生的病毒滴度及ＤＨＦＲ基因在小鼠造血细胞的表达。ＭＴＴ法显示ＡＭ１２－Ｓ３１细胞对Ｇ４１８和氨甲喋呤耐受，对照细胞ＡＭ１２对Ｇ４１８和ＭＴＸ敏感。     

腺病毒和逆转录病毒载体介导外源基因导入造血细胞的研究

将LacZ基因重组于ElA、ElB缺失腺病毒载体中的SRα、EFα或CA启动子下游,应用辅助细胞(293细胞)获得非复制感染性重组病毒,测得病毒滴度为0.42×10~9PFU/ml。包装LacZ基因或GM-CSF基因的逆转录病毒载体产生细胞(CRIP)由美国Richard CM.Mullinan教授惠赠。病毒滴度为0.1-7.7×10~6PFU/ml。应用这两种病毒载体,将外源基因导入人外周血淋巴细胞、人白血病原代细胞与K562、TALL-1细胞以及小鼠白血病细胞M1与WEHI-3B细胞,探索提高基因导入效率和表达效率的试验方法,比较了两种病毒载体基因转移的特点。     

以逆转病毒介导对人脐血CD34+造血细胞进行人MDR1基因转染的实验研究

目的：探讨逆转录病毒介导的MDR1基因转导入脐血CD34^ 细胞的最佳方法，为MDR1基因转导的临床应用打基础。方法：用磷酸钙沉淀法将含有人全长MDR1cDNA的逆转录病毒载体pHaMDR1/A转到包培育细胞PA317中，建立产病毒细胞系，以人脐血中分离的CD34^ 造血干/祖细胞为靶细胞，在体外进行基因转染，转导的条件为：与含病毒的上清液共培养12天，每天更换病毒上清液，上清液中加入IL-3，IL-6和SCF三种造血生长因子（HGF），转染后用集落培养法测定对COL的耐药性，用PCR检测14-17天所形成集落的MDR1 cDNA，计算转染率，用免疫组化法检测P170的阳性程度，并观察不同时间间隔加HGF对脐血CD34^ 细胞的扩增和转染的影响。结果：脐血CD34^ 细胞转染阳性为86.4％，P170的阳性率为77.0％，77.1％的集落对6ng/ml的COL耐受，57.4％的集落对7ng/ml的COL耐受。结论：此转染系统既能有较好的转导效果，也有较好的扩增效果，有一定的临床实用价值。     

Neuropilin-1基因在髓细胞白血病和正常人骨髓基质细胞中的表达

目的了解neuropilin-1(NP-1)基因在髓细胞白血病(AML和CML)患者及正常人骨髓基质细胞中的表达情况。方法收集12例AML、14例CML和20例正常对照骨髓标本,分离单个核细胞。进行体外长期培养,收集贴壁细胞(骨髓基质细胞)。利用逆转录-聚合酶链反应分别检测3组骨髓基质细胞中NP-1基因的表达。结果成功建立了AML、CML和正常人骨髓基质细胞培养方法,NP-1基因在AML、CML骨髓基质细胞中的表达率分别为47.1%和50%,明显低于正常对照(85%)。结论NP-1基因可表达于部分AML、CML和大部分正常人的骨髓基质细胞中,其在髓细胞白血病患者骨髓基质细胞中的低表达, 可能与其调节造血功能异常有关。     

逆转录病毒介导高效的白血病细胞基因转移

目的建立安全高效的逆转录病毒介导的基因转移系统,为白血病基因治疗提供实验基础。方法分别用脂质体转染和小鼠逆转录病毒转导方法,将含标志基因ＮｅｏＲ的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ导入双嗜型包装细胞ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２,获得重组逆转录病毒;用含病毒上清感染白血病细胞系（ＮＢ４、Ｕ９３７和ＴＨＰ－１）,并分析对Ｋ５６２细胞的转导效率。结果脂质体ＤＯＳＰＥＲ转染法获得病毒滴度为８．０×１０５ＣＦＵ／ｍｌ,而病毒感染法高达１．６×１０７ＣＦＵ／ｍｌ。经Ｇ４１８选择,ＰＣＲ证实ＮｅｏＲ基因被整合到白血病细胞基因组中,巢式ＰＣＲ与补救分析均未检测到辅助病毒存在。单个集落Ｋ５６２细胞的ＰＣＲ分析证实,基因转移效率可达９３．３％～１００％。结论逆转录病毒介导的基因转移系统是高效、安全的,有助于人类白血病的基因治疗研究。     

受体介导的基因转移与基因治疗

基因治疗成功的关键在于将治疗基因靶向性转移到细胞或组织，受体介导的基因转移能满足此要求，很有发展潜力的基本转移方法。然而，要将这种转移方法用于基因治疗，与转移系统有关的万分的化学特性与物理反应，靶细胞的受体表达水平，DNA配体复合物怎样逃逸溶酶体的降解以及包含在复合物中的外源基因的表达等都是至关重要的。本文综述了受体介导的基因转移的基本原理。DNA配体复合物形成的最佳条件与性质，影响基因转移与表达的各种因素以及近年来国内外受体介导的基因转移用于基因治疗取得的进展。     

人突变DHFR基因高效逆转录病毒载体及其在小鼠造血细胞的表达

本文用转染了人突变DHFR基因逆转录病毒载体的新一代产病毒细胞AM12-S31,研究了其耐药特性、产生的病毒滴度及DHFR基因在小鼠造血细胞的表达.MTT法显示AM12-S31细胞对G418和氨甲喋呤耐受,对照细胞AM12对G418和MTX敏感.产生的病毒滴度为7.8×10~4～4.2×10~5CFU/ml,且为无复制活性病毒.将AM12-S31上清转染小鼠骨髓造血细胞后进行体内、外研究.CFU-GM分析显示:于不同C418浓度均有阳性克隆,而AM12上清转染组则无耐G418克隆.将转染后骨髓细胞从尾静脉回输给经致死剂量(900 rad)照射小鼠,MTX筛选(第一周为4mg/kg,每周二次;以后各周10mg/kg,每周二次),结果:实验组小鼠白细胞计数和红细胞压积逐渐恢复正常;对照组小鼠 30天内全部死亡.PCR分析耐G418 CFU-GM克隆和实验组小鼠骨髓细胞,均检测到标志基因Neo~R的存在.因此,初步研究表明该产病毒细胞能够产生高滴度、安全有效的非复制型逆转录病毒,并能成功转染小鼠造血细胞、表达目的基因,使在MTX筛选条件下重建小鼠造血功能.该研究为进一步开展耐药基因治疗打下了基础.     

GATA-3 基因在白血病骨髓基质细胞中的表达

 目的　了解转录因子GATA-3 基因在白血病和正常骨髓基质细胞(BMSC) 中表达的情况。方法　体外扩增培养BMSC ,运用RT-PCR-EL ISA 方法检测GATA-3 基因的表达情况,并对其相对表达水平进行半定量比较。结果　GATA-3 基因在正常和白血病的BMSC 中均有一定的表达。BMSC 中急性髓性白血病(AML) 和慢性粒细胞白血病(CML) 组的GATA-3 基因表达率与正常组比较无明显差异,而急性淋巴细胞白血病(ALL) 组的GATA-3 表达率比正常组低,且AML BMSC 中GATA-3 基因表达水平> ALL > 正常> CML 。结论　转录因子GATA23 基因可在正常和白血病骨髓基质细胞中表达,并可能影响骨髓微环境的造血调控作用,其表达模式的改变可能与白血病发生发展有一定的关系。     

IL-3基因修饰的骨髓基质细胞辅助大剂量化疗后造血功能恢复

为研究基因治疗在造血功能损伤后恢复中的应用,本课题以携带小鼠IL-3基因的复制缺陷型重组腺病毒载体转染骨髓基质细胞,对大剂量化疗后的小鼠进行脾内移植观察造血功能的恢复情况.结果表明,缺陷型腺病毒载体能有效地转染小鼠原代骨髓基质细胞,转染效率在80%以上(MOI=10);基因修饰的骨髓基质细胞体外分泌IL-3的水平可达110U/ml/10~6细胞/24小时;在大剂量环磷酰胺治疗后脾内移植IL-3基因修饰的基质细胞能有效地升高实验小鼠外周血白细胞总数;病理检测发现IL-3基因修饰的基质细胞治疗组小鼠脾脏和骨髓中细胞增生较其它组明显活跃;经IL-3基因修饰的基质细胞治疗组小鼠脾淋巴细胞对ConA反应明显增强.结果提示IL-3基因修饰的骨髓基质细胞体内移植对大剂量化疗后机体造血与免疫功能的恢复都有较好的促进作用.     

Regulation of Myeloid and Lymphoid Development of Hematopoietic Stem Cells by Bone Marrow Stromal Cells

Development of hematopoietic stem cells is regulated by stromal cells of the bone marrow. Many stromal cell lines have been established from temperature-sensitive SV40 large T-antigen gene transgenic mice and used to examine regulation of the purified stem cells. When the sorted stem cells were cocultured on the stromal cell layers, cobblestone formation was induced by the stromal cells. The cobblestones were formed by finite cell division (8 divisions on average) of sorted Lin c-Kit⁺ Seal⁺ stem cells committed to myeloid or lymphoid lineages. These stromal cell lines showed variable activities supporting the stem cell development. In one stromal cell line, TBR59, two waves of cobblestone formation committed to either myeloid lineage or lymphoid lineage were induced. TBR31-1, another bone marrow stromal cell line, induced only the cobblestone formation committed to lymphoid lineage. These results indicate that the bone marrow stromal cells selectively induce lineage-specific commitment of the stem cells. Both cobblestone formations require c-Kit function as well as adhesive interaction through VLA4 and VCAM1.     

Neuropilin-1某因在髓细胞白血病和正常人骨髓基质细胞中的表达(英文)

目的了解 neuropilin-1(NP-1)基因在髓细胞白血病(AML 和 CML)患者及正常人骨髓基质细胞中的表达情况。方法收集12例 AML、14例 CML 和20例正常对照骨髓标本,分离单个核细胞。进行体外长期培养,收集贴壁细胞(骨髓基质细胞)。利用逆转录-聚合酶链反应分别检测3组骨髓基质细胞中 NP-1基因的表达。结果成功建立了 AML、CML 和正常人骨髓基质细胞培养方法,NP-1基因在 AML、CML 骨髓基质细胞中的表达率分别为47.1%和50%,明显低于正常对照(85%)。结论 NP-1基因可表达于部分 AML、CML 和大部分正常人的骨髓基质细胞中,其在髓细胞白血病患者骨髓基质细胞中的低表达,可能与其调节造血功能异常有关。     

Current Status of Retroviral Vector Mediated Gene Transfer into Human Hematopoietic Stem Cells

Genetic modification of hematopoietic stem cells (HSCs) has been proposed as a treatment strategy for a variety of hematologic diseases, tracking marked cells or conferring resistance to chemotherapeutic agents. Despite early enthusiasm, the results of clinical studies involving gene transfer into HSCs has not resulted in therapeutic benefits for the vast majority of treated patients. This review describes the limitations and advances that have been made in the areas of gene transfer vectors, identification of the appropriate HSCs to target for genetic modifications and the methods used to perform gene transfer.     

Current Status of Retroviral Vector Mediated Gene Transfer into Human Hematopoietic Stem Cells

Genetic modification of hematopoietic stem cells (HSCs) has been proposed as a treatment strategy for a variety of hematologic diseases, tracking marked cells or conferring resistance to chemotherapeutic agents. Despite early enthusiasm, the results of clinical studies involving gene transfer into HSCs have not resulted in therapeutic benefits for the vast majority of treated patients. This review describes the limitations and advances that have been made in the areas of gene transfer vectors, identification of the appropriate HSCs to target for genetic modifications and the methods used to perform gene transfer.     

转染人突变dhfr基因的小鼠骨髓细胞对小鼠造血功能的长期保护作用

目的:将转染了人突变dhfr基因的第二代小鼠骨髓,移植给经致死剂量照射的第三代小鼠,观察该基因对小鼠造血功能的长期保护作用.方法:分离存活的第二代小鼠骨髓有核细胞,直接移植给经致死剂量照射的同系小鼠,以MTX筛选,观察小鼠血象和生存率变化,PCR和Southem印迹杂交分析目的基因在小鼠染色体DNA中的整合与表达情况.结果:在大剂量MTX筛选下,实验组小鼠造血功能逐渐恢复,对照组3周内全部死亡.实验组生存率和生存期明显高于对照组,但较前两代生存率低.PCR和Southern印迹分析结果提示,实验组脾脏和肝脏组织中均检测到前病毒标志基因neo~R和dhfr基因的特异务带.结论:转染了人突变dhfr基因的第二代小鼠骨髓,能有效地重建经致死剂量照射的第三代小鼠造血功能.保护骨髓免遭大剂量MTX所致的严重骨髓抑制,dhfr基因在小鼠基因组DNA中的稳定整合是这种长期保护作用的物质基础.     

Osteoprotegerin (OPG) Produced by Bone Marrow Stromal Cells Protects Breast Cancer Cells from TRAIL-Induced Apoptosis

Advanced breast cancer is often associated with metastatic bone disease, causing a number of serious complications for the patients such as hypercalceamia, pain, nerve compression and fractures. The formation of bone metastases depends on complex interactions between tumour cells and the cells of the bone microenvironment, but the precise molecular mechanisms involved in the development of tumour-induced bone disease have not been identified. We have investigated the ability of bone marrow stromal cells (BMSC) isolated from breast cancer patients to generate osteoprotegerin (OPG), a molecule involved both in bone turnover and cell survival. The potential survival effects of OPG are mediated through binding to a member of the TNF super family, TNF-related Apoptosis Inducing Ligand (TRAIL), preventing association between TRAIL and its death-inducing receptors present on a number of tumour cell types. In the present report we show that bone marrow stromal cells isolated from breast cancer patients produce OPG when grown in culture. The levels of OPG present in BMSC conditioned medium is sufficient to protect breast cancer cells from undergoing TRAIL induced apoptosis. Our data suggest that bone-derived OPG may increase survival of breast cancer cells that reach the bone microenvironment as part of the metastatic process.     

IL-2基因疗法对骨髓移植后免疫及造血重建的影响

本文以大剂量化疗后骨髓功能严重损伤做为实验模型．动态观察了成纤维细胞介导的IL-2基因疗法对同基因骨髓移植后免疫及造血功能重建的影响。结果表明，IL-2基因疗法能显著增强实验小鼠骨髓细胞的NK活性、LAK活性及ConA刺激的增殖反应，但对骨髓CFU-GM，CFU-MK、CFU-E集落形成无影响，提示成纤维细胞介导的IL-2基因疗法能加快和增强骨髓移植后的免疫功能重建过程，提高骨髓移植抗肿瘤作用，并可减少骨髓移植后感染等并发症。该结果为IL-2基因疗法应用于骨髓移植提供了一定的实验依据．