武汉地区耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变分析

摘要：目的：探讨武汉地区结核分枝杆菌（MTB）利福平耐药株rpoB基因的突变特征。 方法：对76例MTB临床分离株包括rpoB核心区域81 bp碱基在内的428 bp碱基进行PCR测定,并进行DNA序列分析。 结果：76例临床分离MTB中利福平耐药株56例,敏感株20例。耐药株中92.9%（52/56）存在突变,共涉及10个密码子的18种突变类型。 531、526为常见突变位点,其突变率分别为57.7%(30/52)、19.2%(10/52);联合突变率为13.5%（7/52）;同时发现了509位（AGC→AGA）新的突变类型和国内少见的517位CAG缺失类型。 结论：rpoB基因突变在武汉地区利福平耐药MTB中广泛存在,并存在新的突变位点。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变的测序研究

目的　了解南通地区耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特征。 方法　对 36株临床分离菌株rpoB基因 5 0 2～ 5 33位点进行序列测定。结果　耐利福平 (RFP)分离株 93 3% (2 8/30 )存在rpoB基因突变 ,5 31位突变率 5 3 3% (16 /30 ) ,5 2 6位2 3 3% (7/30 ) ,5 16位 6 7% (2 /30 ) ,联合突变 3 3% (1/30 ) ,敏感菌株均无突变。结论　rpoB基因突变与利福平耐药密切相关 ,以 5 31位突变为主。     

耐药结核分枝杆菌基因突变分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药表型与基因突变位点之间的相互关系.方法 采用序列特异性引物分别扩增92株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB,异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC,链霉素耐药基因rrs、rpsL,乙胺丁醇耐药基因embB及喹诺酮耐药基因gyrA,SSCP筛选出突变序列,DNA测序分析突变性质.结果 59株利福平耐药株rpoB基因突变检出率94.9%(56/59),以Ser450Trp突变最多;90株异烟肼耐药株中,katG基因突变检出率38.9%(35/90),以Ser315Thr最多,3株检出inhA基因突变,ahpC基因无突变检出;34株喹诺酮耐药株中gyrA基因突变检出率82.4%(28/34),主要为Asp94Gly,其次为Ala90Val;31株链霉素耐药株中,15株检出rrs突变,最常见为A514C和A1041G,10株发生rpsL Lys88Arg突变,总的链霉素基因突变检出率为77.4%(24/31);31株乙胺丁醇耐药株中embB 基因突变检出率19.4%(6/31),主要为Met306Val.结论 耐药结核分枝杆菌耐药情况较为严重,以DNA测序为基础的基因突变分析能快速有效地检测结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA、rrs、rpsL、embB 等耐药分子标识,显示了西安地区耐药性结核分枝杆菌的突变特点,为结核病的临床诊断和合理用药提供了实验依据.     

实时荧光定量PCR检测血浆结核分枝杆菌DNA的初步临床应用

目的 评价实时荧光定量PCR技术检测血浆（或血清）结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）DNA的技术。方法 建立实时荧光定期量PCR方法测定血浆MTB DNA,分别检测临床确诊的55例结核病患者血清43份,血浆25份以及非结核肺部疾病患者血清18份,健康体检血清18份和健康体检者血浆11份的MTB DNA含量。结果 18例非结板肺疾病患者血清、18例健康体检者血清以及11例健康体检者血浆MTB DNA全部阴性。55例初诊结核患者中10例（18．2％）治疗前血浆（或血清）MTB DNA阳性。在痰涂片阴性的18例结核患者中,血浆（或血清）MTB DNA阳性检出率为27．8％（5／18）,其特异性达100％。结论 本研究证实了结核患者血浆（或血清）循环MTB DNA的存在,其定量检测对痰涂片阴性及无痰患者的结核病诊断有重要参考价值。     

DNA芯片快速检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 开发快速检测耐利福平结核分枝杆菌(结核菌)rpoB基因突变的DNA芯片。方法 根据结核菌rpoB基因序列设计探针并制作基因芯片，从临床样品中分离出结核菌的基因组DNA，PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段，荧光标记后与芯片上含有的检测特异突变位点的寡核苷酸探针进行杂交，同时与DNA直接测序法测定序列比较。结果 35株耐利福平结核菌中有91．4％(32／35)用直接测序法检测出存在rpoB基因突变，DNA芯片的检测效率为71．4％(25／35)。结论 用DNA芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的特异性和敏感性，可用于临床结核菌耐药性检测。     

荧光定量PCR检测技术在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用价值

目的 分析荧光定量PCR检测技术在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用价值.方法 选取2018年1月至2020年1月在漯河市第七人民医院肺科门诊或住院部结核患者1100例,所有患者均进行荧光定量PCR检测,与传统的罗氏药敏比例法对比,评价两种检测方法检测结核分枝杆菌耐药性的结果.结果 荧光定量PCR检测链霉素耐药的敏感度、特...     

全自动PCR检测系统检测痰中结核分枝杆菌

应用全自动PCR系统检测痰中结核分枝杆菌，因其克服了以往传统定性PCR的诸多不良，在确保PCR高特异性的基础上，大幅度提高了检出的敏感性，拓展了PCR技术的应用，从而为国内外所重视。本文概述了目前国外几种用于痰中结核分枝杆菌的全自动PCR系统的原理，检测方法及评价，并略述其临床意义，以便更好地认识和应用该项技术。     

PCR检测CSF巨噬细胞内结核分枝杆菌DNA的探讨

[目的]病原诊断结核性脑脊髓膜炎。[方法]PCR检测分离分纯的CSF中巨噬细胞内TB-DNA,并与PCR直接检测CSF中TB-DNA进行比较。[结果]本法特异性为95％,精确度为95．12％,灵敏度为95．24％。假阳性和假阴性均少于PCR直接检测CSF。[结论]PCR检测分离分纯的CSF中巨噬细胞内TB-DNA优于PCR直接检测CSF中TB-DNA。本法可作为临床病原诊断结核性脑脊髓膜炎的实用方法之一。     

结核分枝杆菌培养及PCR法研究进展

自８０年代后期以来,全球结核病患者人数呈上升趋势,因此结核分枝杆菌的检出对结核病的诊断和治疗就显得尤为重要。本文综述了有关结核分枝杆菌培养及ＰＣＲ法的研究进展。     

耐药结核分枝杆菌基因变异研究

目的 研究多药结核分枝杆菌ｋａｉＧ、ｉｎｈＡ基因的变异机理。方法 用ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ基因片引物,聚合酶链反应扩增产物,克隆后制质粒、直接测定ＤＮＡ序列。结果 １５株耐异烟肼菌株均有ｋａｔＧ基因突变,主要为点突变,其中１４株有４６３位和３１５位ＡＡＰ２密码改变,在１８个耐异烟肼菌株中,全部出现基因ｉｎｈＡ 基因变异,主要为点突和人,以单个点变异主,各菌株变异不同,ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ基因同时出现变异     

结核病3种实验诊断方法比较与分枝杆菌耐药性分析

目的 比较结核病3种实验诊断方法,分析目前深圳市分枝杆菌耐药情况.方法 统计2009～2010年深圳市第三人民医院临床确诊结核病患者痰标本涂片镜检、培养和PCR检测结果,并对分枝杆菌菌种及对治疗药物耐药情况进行统计分析.结果 共有640例资料齐全的结核病确诊病例入选,其中肺结核537例、结核性胸膜炎82例、结核性脑膜炎21例,分枝杆菌涂片镜检阳性率分别为44.1%、5.3%和13.3%,分枝杆菌培养法阳性率分别为59.9%、12.9%和30.0%,PCR检测阳性率分别为52.2%、16.7%和26.3%.经分枝杆菌菌种鉴定,人型结核分枝杆菌占67.0%、牛型结核分枝杆菌占16.8%、非结核分枝杆菌占16.2%,人型结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素的耐药率分别为16.4%、14.8%、4.7%和15.6%.结论 目前结核病实验诊断方法主要有涂片镜检、培养和PCR检测,病原菌以人型结核分枝杆菌为主,对3种主要抗结核药物的耐药率较高.另外,菌阴结核约占40%,目前对菌阴结核、活动性结核与陈旧性结核的诊断和鉴别诊断困难,期待新的方法.     

聚合酶链反应杂交梳法鉴定结核杆菌

目的:探讨一种快速、简便、特异性较强的结核菌鉴定方法。方法:采用聚合酶链反应(PCR)结合反向探针膜杂交对痰液标本中的结核杆菌的特异性DNA片段进行检测。结果:32例阳性标本经过聚合酶链杂交结果与常规鉴定结果相符。结论:聚合酶链反应杂交梳法鉴定结核杆菌简便、快速、特异性强,有较高的临床应用推广价值。     

反相斑点杂交快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 建立以聚合酶链反应(PCR)为基础的寡核甘酸探针反相斑点杂交方法快速检测对利福平耐药的结核菌相关的rpoB基因突变，并评价其临床应用价值。方法 应用PCR-反相斑点杂交方法对利福平耐药的62株结核菌和对其敏感的40株结核菌进行检测，所得结果与传统药敏试验结果以及102株结核菌的直接测序结果进行比较。结果 62株对利福平耐药的菌株中，54株碱基突变被准确鉴定，灵敏度为87．1％(54／62)，阳性预测值为：100％；40株对利福平敏感的菌株均被准确鉴定，特异性为100％，阴性预测值为83．3％(40／48)；准确度为92．2％(94／102)。与测序法结果符合率为99％。结论 以PCR为基础的反相斑点杂交方法其敏感度和特异性均高，无假阳性结果，因此适用于大批量结核菌对利福平耐药性的初筛。     

探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变

目的 评价探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的应用价值,为临床检测提供指导依据.方法 613份痰标本于2009年9月至2010年4月收集自厦门市疾病预防控制中心、厦门市第一医院和漳州市疾病预防控制中心.结核分枝杆菌H37Rv标准株来源于国家结核病参比实验室.37株包含结核与非结核分枝杆菌的标准盘由中国药品生物制品检定所提供.首先采用梯度稀释的野生型标准株H37Rv DNA考察探针熔解曲线分析法的分析灵敏度,然后用标准盘验证其检测特异性,最后以测序法为对照方法,采用613份结核分枝杆菌的标本评价该方法的临床应用价值.结果 探针熔解分析法可检测到3拷贝/反应,且能特异检测结核分枝杆菌.613份结核分枝杆菌的检测结果显示,符合要求的583份标本的试剂盒检测结果与测序结果完全一致,其中embB306突变菌株数为34株,embB 378-380突变菌株数为23株,embB 406突变菌株数为3株,embB 497突变菌株数为3株.结论 探针熔解分析法检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变特异性好,灵敏度高,能有效地检测临床标本常见乙胺丁醇耐药突变位点,是值得推广的快速检测方法.

Abstract：

Objective To evaluate the potential use of a probe melting analysis (PMA) assay in detecting the embB mutations which confer resistance against ethambutol in Mycobacterium tuberculosis. Methods The analysis sensitivity and specificity of PMA were investigated by detecting a serially diluted H37 Rv DNA and a reference panel from National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Product. Six hundred and thirteen sputum samples were collected from the Xiamen Center for Disease Control and Prevention, Xiamen First Hospital and Center for Zhangzhou Disease Control and Prevention from September 2009 to April 2010. The PMA assay was then evaluated by detecting 613 clinical isolates and the results were compared with the sequencing results. Results The PMA assay could specifically detect Mycobacterium tuberculosis and had a limit of detection of 3 copies per reaction. The assay results with 613 clinical isolates showed that PMA gave a 100% concordance with sequencing in the 583 qualified samples, among which 34 were mutations at embB 306,23 at embB 378-380, 3 at embB 406 and 3 at embB 497. Conclusions PMA assay is a sensitive and specific method enabling efficient detection of common embB mutations causing ethambutol-resistance. The rapidness of this method together with its reliability would facilitate its use in routine testing.     

聚合酶链反应-测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因突变的研究

目的应用PCR-DNA测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌分离株KatG基因突变,评价其在检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性方面的应用价值。方法47株耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株及30株结核分枝杆菌敏感分离株用PCR-DNA测序技术检测KatG基因突变。结果47株耐异烟肼结核分枝杆菌分离株中,有31株KatG基因检出有突变,突变检出率为66.0%(31/47);30株结核分枝杆菌敏感株检出1株KatG基因突变。结论PCR-DNA测序技术方法敏感、准确、特异,可快速检测结核分枝杆菌KatG耐药基因突变,有利于耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性的快速检测。     

血液病患者鲍曼不动杆菌的耐药性分析及其耐药基因检测

目的了解血液病患者临床分离鲍曼不动杆菌的耐药表型和多种耐药基因的携带情况。方法收集2011年临床分离的非重复鲍曼不动杆菌120株,采用纸片扩散法进行药敏试验,试验结果按照CLSI 2011年版标准判读,采用WHONET 5.6软件进行数据分析;应用聚合酶链反应及测序方法检测10种耐药相关基因（blaOXA-51-like、blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-58-like、blaTEM、blaampC、armA、ISAba1、intI 1和intI 2）。结果鲍曼不动杆菌对13种抗菌药物的耐药率范围为48.3%~94.2%,对碳青霉烯类抗菌药物亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为51.7%和48.3%;耐药相关基因blaOXA-51-like、blaOXA-23-like、blaTEM、blaampC、armA、ISAba1和intI 1的阳性率分别为100%、60.0%、46.7%、85.8%、75.8%、86.7%和85.0%,而未检出blaOXA-24-like、blaOXA-58-like和intI 2。结论碳青霉烯类抗菌药物对鲍曼不动杆菌仍具有较好的体外抗菌活性,鲍曼不动杆菌多重耐药相关基因的携带率较高,多重耐药现象非常严重,应加强其耐药性监测,合理使用抗菌药物。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性

目的：探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌利福平（RFP）药物敏感性的可行性。方法：应用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术分别检测了40株RFP药物敏感及耐药的结核分枝杆菌临床分离株。先用PCR扩增rpoB基因，随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变，并与药敏试验结果作对照分析。结果：所有临床分离株均观察到rpoB基因PCR扩增产物。40株RFP敏感的临床分离株SSCP带谱与结核分枝杆菌H37RV标准株相同，40株RFP耐药株中37株检测到突变图谱。与Bactec结果对照，用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌RFP耐药性的敏感性为93％，特异性为100％。结论：结核分枝杆菌耐RFP是其rpoB基因突变所致。PCR-SSCP技术可用于结核分枝杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测。