制备性SDS—PAGE法纯化人重组IL—3

利用制备性SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行人重组白细胞介素—3(IL—3)的纯化,回收率可达84.3%,纯度90%以上,保持高度生物活性,并有方法简便,实验周期短的优点,已小批量供应国内实验室进行人IL—3的体外研究.     

人HER2胞外区基因重组及重组蛋白的纯化

为在体外纯化可溶性HER2胞外区蛋白并提高其原核表达产量，将多聚酶链式反应（PCR）方法获得的HER2基因胞外段编码区重组至pGEX-6P-1质粒，转化大肠杆菌BL21，采用不同的诱导条件分析融合蛋白的表达及其溶解性，不溶的包涵体经变性复性，与裂解液上清分别经Olutathione Sepharose4B亲合纯化融合蛋白。结果发现，重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在，但以不溶的包涵体形式为主。低温（30℃）、较高的细菌密度（A600—1．8）和适当的培养基添加剂能有利于可溶性融合蛋白的表达。Olutathione Sepharose4B亲合纯化细菌裂解液上清和复性后的融合蛋白，其产量为1．23mg／L菌液，最大限度地获得了可溶性的HER2蛋白胞外段，为HER2特异性抗体的制备及其功能研究打下了良好的基础。     

重组人Ⅲ型胶原蛋白的表达纯化及性能研究

目的:表达和纯化重组人Ⅲ型胶原蛋白（rhCol）,并评价其性能。方法:构建重组基因工程菌pET30a（+）-1880/pACYCDuet-hy726/BL21（DE3）,稳定共表达rhCol和脯氨酰羟化酶。通过大肠杆菌高密度发酵与盐析和柱层析蛋白纯化技术制备并纯化rhCol。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定rhC...     

重组人leptin的复性、纯化和免疫学及生物学活性鉴定

对重组人leptin(rh-leptin)蛋白进行复性及纯化,并鉴定其免疫学及生物学活性.将由大肠杆菌(E.coli)重组表达获得的rh-leptin,复性、纯化后进行SDS-PAGE电泳和Western印迹杂交鉴定其特异性,并通过Km小鼠减肥实验及胃肠推进率测定实验检验其生物学活性.结果表明通过对rh-leptin进行复性和纯化,获得了高纯度的具有免疫学和生物学活性的rh-leptin蛋白,可供进一步研究应用.     

重组人IL-11的原核表达、纯化和鉴定

以本实验室构建的pET24a-hrIL-11表达载体为模板,PCR扩增重组人白细胞介素11(hrIL-11)的基因,克隆入pET21a表达载体,转化BL-21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生hrIL-11/His融合蛋白,并经Western blot实验确认。原核表达的hrIL-11/His融合蛋白经变性后,利用亲和层析纯化,目的蛋白纯度达95%以上。纯化后蛋白经尿素梯度复性后,比活达到1×106 IU/mg。研究结果为进一步研究该蛋白在促进血小板增殖等方面的作用奠定了基础。     

兔抗人重组生长激素rhGH多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备抗人生长激素(growth hormone,GH)的多克隆抗体并鉴定其性能。方法真核细胞表达质粒pcDNA3.0-GHcDNA免疫家兔,制备rhGH多克隆抗体;ELISA法检测抗体效价。亲和层析法纯化后,进行Western blot、免疫组织化学和激光共聚焦显微镜检测,鉴定抗体的特异性与适用范围。结果得到兔抗人重组人生长激素rhGH多克隆抗体,效价达1:40000。纯化后的抗体可特异识别超表达的hGH和人内源性GH,可用于免疫组织化学实验、Western blot及激光共聚焦。结论用质粒免疫家兔制备的抗GH抗体具有较高的效价以及特异性,为hGH的功能性研究提供了有力的支持。     

DEAE—Sepharose阴离子交换柱一步纯化重组人IL—6

目的为了制备高纯度、高活性的重组人白细胞介素-6.方法化学诱导重组表达载体pT7.7hIL-6进行蛋白表达,菌体经超声破碎分离包涵体,并对包涵体进行洗涤、变性和复性处理,用DEAE-SepharoseCL-6B弱阴离子交换柱一步纯化复性的重组人IL-6.采用3H-TdR法测定rhIL-6的活性.结果表达产物经纯化后纯度达95%,比活性为3.0×108U/mg.结论本实验设计的纯化工艺简便易行,所得产品纯度高、产率高.     

人MAdCAM-1胞外区基因在原核系统的表达及重组蛋白纯化

目的：制备高纯度的重组人MAdCAM-1蛋白。方法 采用PCR技术从pUC21/hMadCAM-1质粒上,选择性扩增编码成熟MAdCAM-1胞外区两个Ig域的基因片段。将其克隆至pQE30载中,转化大肠杆菌后,以IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA亲和层析纯化。结果：诱导表达出相对分子质量（Mt)约29000的融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的50％左右。经亲和层析纯化得到高纯度的蛋白产品。结论 获得了重组人MAdCAM-1胞外区蛋白,为后续功能研究及其单抗研制奠定了基础。     

抗人胰岛素单克隆抗体的制备及其应用

抗人胰岛素单克隆抗体的制备及其应用刘彩云孙素莲（北京市肿瘤防治研究所免疫室，北京１０００３４）人血中胰岛素的测定主要用于评估糖尿病患者胰岛细胞的分泌功能，对于选用药物和判定某些药物的疗效，以及对胰岛瘤的诊断也具有一定的意义。目前，一般应用ＲＩＡ测定人...     

重组人颗粒溶素的纯化及其单克隆抗体的制备

目的:纯化原核系统表达的颗粒溶素(GNLY),并制备其单克隆抗体(mAb)。方法:用Ni亲和层析纯化重组人GNLY,用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。mAb纯化后,用间接ELISA法测mAb的效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸盐洗脱法测定mAb的相对亲和力指数,并进行Ig亚类、特异性及杂交瘤细胞分泌mAb的稳定性检测。结果:经Ni亲和层析纯化的可溶性GN-LY融合蛋白,其纯度和含量分别为95%和0.8g/L。共筛选出能稳定分泌抗人GNLYmAb的杂交瘤细胞4株,分别为6C8、9C6、5G7和5E5。4株杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价分别为1∶100～1∶3200和(0.1～8)×10-4,5E5mAb的Ig亚类为IgM,其余3株mAb均为IgG1。结论:成功地纯化人GNLY融合蛋白。以其为免疫原制备的鼠抗人GN-LYmAb,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

人肿瘤抑素相关T21RGD肽的表达与纯化

目的 构建引入RGD序列人肿瘤抑素相关21肽（T21RGD）―内含肽―几丁质结合蛋白融合表达载体，实现目的肽的几丁质珠亲和层析一步纯化。方法 人工设计合成T21RGD肽基因， 经重组定向克隆插入到原核表达载体pTYB2，酶切和测序鉴定正确后转化入大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导其融合表达，对表达蛋白进行几丁质珠亲和层析，DTT诱导柱上裂解以获得T21RGD肽。经Trcine-SDS-PAGE和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对纯化产物进行鉴定。结果 质粒酶切和测序结果显示，含T21RGD肽基因按正确方向和序列插入质粒,融合蛋白表达量达菌体蛋白总量的50％以上，Trcine-SDS-PAGE显示了T21RGD肽目的条带与预期相符，反相高效液相色谱测定峰纯度达97％。结论 成功构建T21RGD肽融合表达载体，实现了融合蛋白在大肠杆菌中高效表达和T21RGD肽几丁质珠亲和层析一步纯化，为进一步研究T21RGD肽抗肿瘤活性和作用机理奠定基础。     

人白细胞介素4的原核表达、复性、纯化及生物学活性鉴定

用PCR方法从pORF-hIL4质粒中扩增重组人白细胞介素4(hIL-4)的基因,构建PQE60原核表达载体并诱导其目的蛋白的表达。对表达的目的蛋白的可溶性进行鉴定,发现hIL-4基因表达产物在大肠杆菌中主要以不溶性包涵体形式存在,经过超声波破细菌、包涵体提取、洗涤处理后,用5mol/L盐酸胍变性溶解包涵体沉淀,上清稀释复性后透析,再经镍亲和层析进行纯化。纯化后的hIL-4进行TF-1细胞体外增生实验检测其生物学活性后,可用于人外周血树突状细胞的体外诱导培养。     

重组人IL-2在E.coli中的高效表达诱导因素及其纯化的研究

表达人IL-2的E.coli pETI-2/MM294在色氨酸饥饿的培养基中发酵,加入一定量的3—吲哚乙酸诱导其trp启动子,可以使rlL-2的表达量高达总菌体蛋白量的19％。高水平表达的rlL-2以不溶性的包含体形式存在于E.coli的胞浆中。通过破碎细菌、变性抽提和使rlL-2复性后,再经CM-SephadexC-50、DEAE-SephadexA-50、SephadexG-75等一系列层析步骤纯化,最终得到的rlL-2纯度达90％以上,比活性为7.21×10~5μ/mg,总回收率为10.5％。     

长周期应用恩度治疗老年晚期前列腺癌的疗效分析

目的 评估长周期应用重组人血管内皮抑制素（恩度）联合激素及放疗治疗晚期前列腺癌的临床疗效及不良反应.方法 分析了28例经组织学确诊符合人组条件的晚期前列腺癌患者,分成实验组和对照组,实验组18例,对照组10例,实验组采用恩度联合同步激素治疗及放疗,对照组采用激素治疗及放疗,观察两组的疗效及不良反应.结果 ①在不同治疗、不同时间中,实验组及对照组治疗前后FPSA、TPSA均降低,P＜0.01,提示两种治疗对前列腺癌均有效;②实验组及对照组FPSA及rPSA均在前两月降低幅度较大,并同其后各月份比较均有统计学意义,P均＜0.01;实验组在不同时间FPSA、TPSA水平均低于对照组,P均＜0.01,提示联合恩度优于只用激素治疗及放疗;③骨髓抑制程度实验组明显高于对照组,以白细胞降低为著,差异有统计学意义（Z=3.099,P=0.002）.结论 联合恩度治疗前列腺癌优于只用激素治疗及放疗,表现为FPSA、TPSA下降幅度迅速,维持水平较低、持续时间较长.     

重组人促红细胞生成素治疗胃肠道恶性肿瘤化疗相关性贫血的疗效观察

目的 观察使用重组人促红细胞生成素治疗胃肠道恶性肿瘤化疗相关性贫血的临床效果。方法 选择我院2017年8月~2018年8月收治的80例胃肠道恶性肿瘤化疗相关性贫血患者作为研究对象,随机分为对照组和观察组,各40例。对照组患者进行常规治疗,观察组在此基础上采用重组人促红细胞生成素治疗,比较两组的临床疗效、并发症发生率,记录两组治疗前后血红蛋白、血细胞比容等指标和患者生活质量评分情况。结果 观察组治疗总有效率高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;观察组血红蛋白、血细胞比容、血细胞计数和血小板计数水平均高于对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;观察组患者生活质量评分高于对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;两组患者的不良反应发生率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 重组人促红细胞生成素治疗胃肠道恶性肿瘤化疗相关性贫血的效果较好,可显著提高患者的临床疗效,改善患者贫血状况,提高其生活质量。     

重组人干细胞因子治疗骨髓增生异常综合征的临床可能性

为明确骨髓增生异常综合征(MDS)患者造血祖细胞对重组人干细胞因于(rhSCF)的反应性,使用无血清培养体系体外培养,比较MDS与正常人红、粒系克隆性生长能力.结果表明,两例难治性贫血(RA)在rhSCF 重组人白介素3(rhlL-3) 重组人促红素(rhEPO)三因于联合刺激作用下,早期红系祖细胞(BFU-E)克隆生长接近正常水平.促粒系造血方面,rhSCF rhIL-3或重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)联合作用下,粒/巨噬祖细胞(CFU-GM)克隆生长虽未达正常水平,却较单一rhIL-3或rhGM-CSF高7～29倍或5.6～12倍.结论:至少部分MDS患者的红系祖细胞数量并未减少.rhSCF与其它造血生长因子联合治疗MDS有重要临床意义.     

新型重组人肿瘤坏死因子治疗恶性腹水的临床研究

新型重组人肿瘤坏死因子（ｒｈ－ＴＮＦ）系经基因重组、结构改建的肿瘤坏死因子。本研究旨在探讨ｒｈ－ＴＮＦ和化疗药５－氟尿嘧啶（５－ＦＵ）和丝裂霉素（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ，ＭＭＣ）对恶性腹水的治疗效果，６４例恶性腹水分三组进行：Ｔ组（ＴＮＦ）２１例，ＦＭ组（５－ＦＵ，ＭＭＣ）１８例，ＴＦＭ组（ＴＮＦ，５－ＦＵ，ＭＭＣ）２５例。结果显示治疗恶性腹水的有效率分别为ＴＦＭ组９２．３％、Ｔ组８５．７％、ＦＭ组５０．０％。ＴＦＭ和Ｔ组较ＦＭ组疗效相差显著（Ｐ＜０．０１），ＴＦＭ和Ｔ组相差不显著（Ｐ＞０．０５），Ｔ组和ＴＦＭ组未见明显副作用。三组产生疗效的平均时间分别为ＴＦＭ组７．２ｄ、Ｔ组１１．５ｄ、ＦＭ组１８．２ｄ。表明ｒｈ－ＴＮＦ治疗恶性腹水具有疗效高，副作用小等优点。ｒｈ－ＴＮＦ和化疗药ＦＭ合用，可减少ＴＮＦ用量，缩短疗程，是治疗恶性腹水的理想方法。     

重组人血管内皮抑制素对荷瘤裸小鼠的治疗作用

观察了重组人血管内皮抑制素 (YH - 16 )对人肝癌Be174 0 2 细胞系、人宫颈癌Hela细胞系和人胃癌SGC790 1细胞系在裸小鼠体内的抑制作用。试验采用每日尾静脉注射给药 ,YH - 16的剂量分别为 1.5、0 .75、0 .4mg/kg ,共给药 14次。结果表明YH - 16对上述三种人癌细胞系有明显抑制作用 ,其抑制率Be174 0 2 为 45 .6 7、43.0 8和 40 .0 0 % ;Hela为 40 .70、30 .15和2 4.12 % ;SGC790 1为 5 1.89、44 .34和 35 .85 %。YH— 16各给药组动物健康状况良好 ,无明显毒副反应     

重组人血管内皮抑制素对小鼠胃癌c-Myc,bFGF表达的影响

目的 通过构建荷胃癌小鼠模型研究重组人血管内皮抑制素对癌基因c-Myc和成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响及可能机制.方法 20只小鼠皮下注射MFC小鼠前胃癌细胞从而构建小鼠胃癌移植瘤模型,后随机分成两组,每组10只,观察组腹腔注射0.8mg/kg重组人血管内皮抑素,对照组腹腔注射等量生理盐水.每天观察小鼠的一般情况,每3天测量肿瘤体积,绘制肿瘤体积生长曲线并对两实验组肿瘤体积进行比较;应用RT-PCR、Western bolt及免疫组织化学法检测两组小鼠肿瘤组织中c-Myc和bFGF的表达,免疫组织化学染色法检测肿瘤组织微血管密度(MVD)的表达,并通过Spearman分析c-Myc和bFGF两者的相关性.结果 在用药的过程中,对照组小鼠随着移植瘤结节的增大而发生行为明显改变,但观察组小鼠精神、反应、活动及进食饮水均如初,未见明显不良反应.治疗后第9d开始,观察组小鼠移植瘤体积明显小于对照组(P＜0.05),在第21 d最明显(P＜0.01).RT-PCR检测显示e-Myc,bFGF mRNA相对表达量明显低于对照组(P＜0.05);Western blot检测显也显示观察组c-Myc,bFGF蛋白的表达量明显低于对照组(P＜0.05);免疫组织化学检测显示c-Myc,bFGF阳性细胞数均明显低于对照组(P＜0.05),c-Myc,bFGF平均灰度值明显高于对照组(P＜0.05);对照组平均MVD为9.2±1.3,观察组为2.9±1.0,两组之间差异亦具有统计学差异(P＜0.05).且Spearman分析得出小鼠胃移植瘤中e-Myc和bFGF mRNA存在正相关(r=0.853,P=0.000).结论 重组人血管内皮抑制素通过抑制胃癌组织c-Myc,bFGF基因表达和血管生成.     

离子交换色谱法去除rhOP-1蛋白溶液中内毒素的方法

目的建立一种去除重组人成骨蛋白(recombination human osteogenic protein-1,rhOP-1)溶液中内毒素的方法。方法提取包涵体蛋白,经纯化、复性得rhOP-1溶液。此溶液经DEAE离子交换色谱柱,通过线性增加盐浓度方式先将蛋白洗脱,内毒素则由较强盐浓度和NaOH洗脱。收集洗脱峰,用鲎试剂检测其内毒素含量。结果凝胶法检测rhOP-1溶液在DEAE-琼脂糖色谱柱上样前内毒素含量在限值以上,DEAE-琼脂糖色谱柱洗脱峰的蛋白内毒素含量降到限值以下,而经0.22μm滤膜除菌的蛋白溶液中内毒素含量在限值以上。结论rhOP-1蛋白溶液经DEAE-琼脂糖色谱柱洗脱,可得低于内毒素限值的蛋白溶液,因此这种方法可作为一种去除rhOP-1缓冲液中内毒素的方法。