重组腺病毒Adeasy-HA117载体的构建及其在K562细胞的表达

目的:构建携带耐药相关基因HA117的高滴度重组腺病毒,转染K562细胞,检测其在K562细胞中的表达情况.方法:用基因工程技术将ATRA相关耐药新基因HA117的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,然后在细菌内与pAdeasy同源重组,后将重组腺病毒Adeasy-HA117经脂质体转染包装细胞HEK293,并收获原代的重组腺病毒Adeasy-HA117,经乒乓交互感染的方法扩增原代腺病毒,应用RT-PCR、荧光显微镜及流式细胞仪鉴定和检测重组腺病毒感染K562细胞后HA117的表达情况.结果:酶切罄定及PCR结果证明ATRA相关耐药新基因HA117重组腺病毒载体构建成功.携带新基因HA117重组腺病毒载体的效价达8.3×1011pfu/mL.RT-PCR检测到转染后K562细胞内HA117的表达.结论:成功获得携带新基因HA117的重组腺病毒,并能使其在K562细胞巾高表达.     

新基因HA117最佳siRNA的筛选及重组腺病毒构建

目的 验证pSOS-HUS筛选目的 基因最佳siRNA的效果,应用pSOS-HUS筛选新基因HA117最佳siRNA,构建携带HA117基因最佳siRNA转录模板DNA的重组腺病毒.方法 构建携带HA117基因及其siRNA模板DNA链的双克隆质粒.把双克隆质粒分别转染293细胞,通过镜下观察、流式细胞仪检测比较绿色荧光表达强度,RT-PCR检测HA117基因mRNA表达,筛选鉴定基因HA117最佳siRNA.构建HA117基因RNA干扰重组腺病毒.结果 从5对模板DNA链中筛选出最有效片段HAi5,构建携带HAi5的重组腺病毒.结论 载体pSOS-HUS可快捷有效地筛选目的 基因的最佳siRNA;在5对模板DNA中,HAi5转录的siRNA对新基因HA117干扰效果最强;成功构建携带HAi5的重组腺病毒.     

人多药耐药基因1(mdr1)的克隆及重组腺病毒制备

目的:构建表达多药耐药基因1(MDR1)的重组腺病毒表达系统.方法:用基因工程技术将多药耐药基因1的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,然后在细菌内与pAdEasy同源重组,经脂质体转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒.将重组腺病毒Ad5-mdr1感染小鼠单个核细胞,通过荧光显微镜及流式细胞仪进行检测.结果:酶切鉴定及PCR结果证明多药耐药基因重组腺病毒载体构建成功,构建的人多药耐药基因1(mdr1)重组腺病毒载体的效价达到8.3×1011 pfu/ml.对小鼠单个核细胞的感染效率可达10%～15%,转染小鼠单个核细胞细胞48h后,可检测到mdr1基因的表达.结论:成功构建了表达多药耐药基因1的重组腺病毒载体,为后续对mdr1的相关研究创造了条件.     

腺病毒介导的新基因HA117对Jurkat细胞多药耐药功能的影响

目的 研究新基因HA117对急性淋巴细胞白血病细胞Jurkat耐药性的影响,探讨新基因HA117多药耐药(muhidmg resistance,MDR)相关功能.方法 以携带HA117基因的重组腺病毒Ad5-HA117感染Jurkat细胞得到高表达HA117基因的细胞Jurkat/HA117,以荧光显微镜和流式细胞术检测细胞感染效率,RT-PCR检测感染前后实验细胞HA117基因表达,MTT检测比较高表达HA117基因前后Jurkat细胞药物敏感性变化.结果 新基因HA117可使Jurkat细胞对多种化疗药物耐药性增强,转染AdS-HA117重组腺病毒的Jurkat细胞对VCR、ADM、Vp-16、DNR、MMC、CTX药物的药物耐受性均比未转染的Jurkat细胞增高,增高3～7倍(P<0.05,P<0.01),转染空载体组耐药性跟未转染的Jurkat细胞相比无显著差异(P>0.05).结论 新基因HA117可使Jurkat细胞的耐药功能增加,证实新基因HA117具有多药耐药功能.     

结缔组织生长因子的克隆及其重组腺病毒的构建

目的:克隆结缔组织生长因子(CTGF)及制备表达CTGF基因的重组腺病毒.方法:体外克隆出CTGF并将该基因采用定向克隆的方法克隆进入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,进一步采用同源重组方法将该质粒和腺病毒质粒Adeasy-1连接,然后用脂质体介导的方法导入包装细胞HEK293中产生表达目的基因的重组腺病毒,收集病毒液感染HCT116 wt骨软骨肉瘤细胞,通过荧光显微镜观察GFP和Western Blot检测CTGF蛋白的表达.结果:经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带该基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒,重组腺病毒转染后可使HCT116 wt细胞CT-GF蛋白表达明显增加.结论:成功构建了携带CTGF基因的重组腺病毒载体Ad5-CTGF,为探讨CTGF的作用机制、功能及与相关疾病的发生、发展上的进一步研究打下基础.     

连环蛋白P120基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建携带HA—tag的连环蛋白P120（P120ctn）基因重组腺病毒载体,并观察腺病毒感染后P120ctn在HepG-2细胞中的表达情况。方法把HA-tag和P120ctn基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack—CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得腺病毒重组质粒。再将获取的腺病毒重组质粒转染入293细胞进行包装,获取P120ctn重组腺病毒并进一步感染HepG-2细胞株。结果P120ctn基因成功克隆到腺病毒载体中,该腺病毒可高效介导P120ctn在HepG-2细胞中表达。结论成功地构建了含P120ctn基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其功能奠定了基础。     

蛋氨酸酶基因重组腺病毒载体构建

目的构建蛋氨酸酶基因重组腺病毒载体.方法运用Cre-LoxP重组酶系统,通过DNA重组技术,将L-蛋氨酸-γ裂解酶基因(L-Methioneγ-Lyase Gene)与供体载体pDNR-CMV重组,获得含有Metase重组基因的供体载体pDNR-Metase-CMV.将pDNR-Metase-CMV片段与真核腺病毒载体PLP-Ade-X-CMV进行重组,获得pLP-Ade-Metase-CMV重组分子.结果获得了重组腺病毒载体pLP-Ade-Metase-CMV,并证实该重组腺病毒载体中有Metase Gene.结论采用LoxP/Cre体外重组法成功地构建了含蛋氨酸酶基因的真核表达重组腺病毒载体.     

携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒载体的构建

目的　构建携带反义多药耐药相关蛋白 (MRP)的重组腺病毒载体以用于肝癌耐药的基因治疗研究。方法　将 MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183胞内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带反义 MRP的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- ASmrp。结果　成功地构建了携带反义 MRP的重组腺病毒载体系统 ,经测定病毒滴度可达 2 .5× 10 9。结论　构建的重组腺病毒 Ad Easy- GFP-ASm rp可望有效地将反义 MRP导入人肝癌耐药细胞株 ,为进一步研究肝癌耐药机制及其逆转方式提供实验基础     

hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

β-catenin腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人β-catenin基因的重组腺病毒载体,为进一步研究Wnt/Wingless信号通路在肿瘤发生发展中的作用机制奠定重要基础.方法:以含有β-catenin的pcmv-βNS-FC质粒为模板PCR获得目的基因,将目的基因定向克隆至腺病毒穿梭质粒构建阳性重组pAd track-β-catenin,并经PmeI线性化后在BJ5183细菌中与腺病毒骨架质粒pAd Easy-1同源重组获得β-catenin重组腺病毒载体,再将PacI线性化的腺病毒质粒转染HEK293细胞包装重组腺病毒.结果:PCR及酶切鉴定证实目的基因正确克隆至腺病毒质粒中,目的基因序列与GENEBANK报道一致,荧光显微镜可观察到GFP的表达.结论:成功构建pAd-β-catenin腺病毒质粒载体,并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒.     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。