过表达Syndecan-4促进人脐静脉内皮细胞增殖

目的 内皮细胞增殖在血管新生中起着非常重要的作用.本研究拟观察过表达Syndecan-4对人脐静脉内皮细胞的促增殖作用并对其相关机制进行探讨.方法 分离和培养人脐静脉内皮细胞,分别将过表达Syndecan-4的腺病毒、空病毒转染至人脐静脉内皮细胞,用免疫染色法观察人脐静脉内皮细胞的Syndecan-4的表达水平和自聚现象,用Western blotting方法检测人脐静脉内皮细胞内Akt、内皮细胞氮氧化物合酶蛋白磷酸化的水平;用磷酸化组蛋白3、5-溴脱氧尿嘧啶核苷、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷法观察人脐静脉内皮细胞的增殖情况.结果 与对照组相比,转染Syndecan-4组的人脐静脉内皮细胞增殖明显活跃,Syndecan-4表达明显增加,且存在自聚现象;Western blotting检测发现,Akt、内皮细胞氮氧化物合酶磷酸化水平较对照组明显升高.结论 过表达人脐静脉内皮细胞Syndecan-4可诱导Syndecan-4自聚,并可能通过活化下游Akt、内皮细胞氮氧化物合酶,促进人脐静脉内皮细胞的增殖.     

银杏黄酮苷对人巨细胞病毒感染的人脐静脉内皮细胞周期和凋亡的影响

目的:探讨人巨细胞病毒(HCMV)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC304)细胞周期和凋亡的影响和机制及银杏黄酮苷对其感染HUVEC304的作用。方法:实验分为4组,分别为正常对照组、银杏黄酮苷组、HCMV感染组、HCMV感染加银杏黄酮苷组。采用流式细胞技术对HCMV感染的体外培养的HUVEC304及银杏黄酮苷对其作用后进行观察和分析。结果:HCMV感染HUVEC304后24h,正常对照组G0/G1期的细胞为74.4%,加入HCMV后为59.3%,较正常对照组降低20.3%(P<0·05)。正常对照组凋亡细胞为8.3%,当加入HCMV后为5.8%,较正常对照组降低30.1%(P<0·01)。银杏黄酮苷可以降低HCMV增加进入S和G2/M期的细胞,HCMV感染的细胞处在G0/G1期的为59.3%,用10-2mol/L银杏黄酮苷后被感染细胞处在G0/G1期的增加为67.5%,较感染组增加13.8%(P<0·05)。银杏黄酮苷可以增加HCMV感染的HUVEC304凋亡水平。HCMV感染后凋亡细胞为5.8%,加入10-2mol/L银杏黄酮苷后凋亡细胞为6.2%,较HCMV组升高6.9%(P<0·05)。结论:HCMV感染HUVEC304后,可以降低HUVEC304停留在G1期的细胞,使进入S和G2/M期的细胞明显增加,表明HCMV感染早期可通过增加G0/G1期细胞进入S和G2/M期,导致细胞最终表现为增殖。应用银杏黄酮苷可以促进细胞从G1期向S和G2/M期的转化和细胞的凋亡。HCMV感染HU-VEC304引起的炎性反应可能影响内皮细胞的功能,导致血栓形成、脂质代谢紊乱,最终参与动脉粥样硬化的形成。而银杏黄酮苷可促进HCMV感染HUVEC304的凋亡,抑制被感染细胞的过度增生,因而可能对防治动脉粥样硬化有一定的作用。     

VEGF对体外培养的脐静脉内皮细胞增殖和迁移能力的影响

目的探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）对体外培养的脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖和迁移能力的影响。方法以VEGF基因转染HUVECs和在培养液中加入VEGF蛋白后培养HUVEC,用RT-PCR法检测VEGF mRNA的表达鉴定转染的效果,用3H-TdR掺入法检测VEGF对HUVECs增殖的影响,用划痕实验观察VEGF对HUVECs迁移能力的影响。结果转染VEGF基因的HUVECs中VEGFmRNA的表达高于对照组,表明转染成功。3H-TdR掺入法和划痕实验显示,转染VEGF基因和在培养液中加入VEGF蛋白,都可促进体外培养的HUVECs增殖和迁移。结论VEGF能够促进体外培养的HUVECs增殖和迁移;将VEGF基因导入细胞与直接在培养基中加入VEGF蛋白具有相同的效果。     

ATP对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用及其可能机制

目的 观察胞外核苷酸ATP对人脐静脉内皮细胞增殖活性及其生物学功能的影响,并初步探讨其可能机制.方法 通过CCK-8细胞增殖试验检测不同浓度的ATP(0、 1、5、10、50和100 μmol/L)持续干预脐静脉内皮细胞 3天及ATP(50 μmol/L)不同时间段干预(1～6天)对脐静脉内皮细胞细胞增殖的影响;通过流式细胞术检测不同浓度的三磷酸腺苷诱导脐静脉内皮细胞凋亡情况及对其细胞生长周期的影响;通过RT-PCR对脐静脉内皮细胞表达的P2受体亚型进行检测,检测不同浓度的ATP(0、5、10、50和100 μmol/L)对脐静脉内皮细胞表达P2Y2、P2Y11,细胞周期素cyclinB1、cyclinD1及细胞间粘附分子1、血管细胞粘附分子1和内皮型一氧化氮合酶的影响.结果 与对照组比较,三磷酸腺苷在高浓度(50和100 μmol/L)持续作用于脐静脉内皮细胞 3天后显著抑制生长(P<0.01),终浓度50 μmol/L的ATP呈时间依赖性抑制脐静脉内皮细胞生长.不同浓度的ATP对脐静脉内皮细胞凋亡均无明显影响,但在高浓度时可显著增加S期的细胞比例和减少G2/M期的细胞比例从而将细胞周期阻滞在S期;静止状态下,脐静脉内皮细胞表达P2X-4,5和P2Y-2,4,11,13,14;三磷酸腺苷各浓度组均能明显上调脐静脉内皮细胞细胞间粘附分子1和血管细胞粘附分子1的表达,仅在高浓度时上调P2Y2,11、eNOS的表达和下调cyclinB1表达,而对表达cyclinD1的影响不明显.结论 胞外核苷酸三磷酸腺苷在高浓度(50和100 μmol/L)时可能通过受体P2Y2和P2Y11下调cyclinB1表达,使细胞周期从S期向G2/M期的转变受阻,从而抑制脐静脉内皮细胞生长,并且促进脐静脉内皮细胞表达动脉粥样硬化相关因子.     

同型半胱氨酸血症对人脐静脉内皮细胞增殖活性的影响

目的 观察不同浓度的同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作用不同时间后对细胞增殖和形态结构的影响.方法 在含有不同浓度的同型半胱氨酸培养环境及对照培养环境中,分别孵育内皮细胞24 h、48 h、72 h后,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测同型半胱氨酸对内皮细胞增殖活性的影响,并进行细胞形态学观察.结果 同型半胱氨酸低浓度时对细胞生长的抑制不明显,随着浓度的增高,细胞生长抑制越明显,且呈浓度、时间依赖性.结论 高同型半胱氨酸可损伤内皮细胞,抑制细胞生长,有助于糖尿病和胰岛素抵抗致动脉粥样硬化等血管病变的发生和发展.     

芎芍胶囊含药血清对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的研究芎芍胶囊含药血清对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖作用。方法采用血清药理学和体外培养HUVEC的方法,通过倒置显微镜观察、MTT法和流式细胞术(FCM)检测芎芍胶囊高、中、低3个浓度含药血清对HUVEC增殖的影响。结果MTT法检测结果显示高、中、低剂量的芎芍胶囊含药血清均有促进HUVEC增殖的作用,增殖率分别为54.14%、54.98%、33.77%;FCM法检测发现高、中、低剂量芎芍胶囊含药血清均可增加S期细胞比例,分别为52.14%、42.65%、37.08%;显微镜观察结果也显示各含药血清具有促进HUVEC增殖的作用。结论芎芍胶囊能促进HUVEC的增殖,其促进细胞增殖的作用与浓度有一定的关系;提示芎芍胶囊的促血管新生作用可能是通过促进血管内皮细胞的增殖。     

阿托伐他汀对人脐静脉内皮细胞增殖活性的影响

目的观察阿托伐他汀对人脐静脉内皮细胞增殖(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)及超微结构的影响。方法将HUVEC分为3组进行培养,包括正常对照组、重组人白细胞介素6(rhIL6)刺激组和阿托伐他汀组。通过MTT法测定各组细胞的增殖活力,并用透射电镜观察各组细胞超微结构的改变。结果①正常对照组、rhIL6组及阿托伐他汀组的吸光度(A)分别为0.172±0.014、0.257±0.058及0.184±0.021;②rhIL6作用下,HUVEC粗面内质网上核糖体较对照组明显增多,而阿托伐他汀可抑制rhIL6对HUVEC的这种超微结构改变。结论阿托伐他汀能有效抑制rhIL6,进而阻止HUVEC增殖。     

卡托普利对高压力培养的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 观察大气压、中压力、高压力培养对离体人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡的影响,及血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利(Captopril,Cap)对HUVECs凋亡的作用。方法 采用改良的Jaffe’s法,取4-6代HUVECs制成单细胞悬液。采用大气压(OmmHg)、中压力(120mmHg)、高压力(180mmHg)三种条件培养,分别用形态学、DNA凝胶电泳、流式细胞仪等观察各组培养16b、24h、48h HUVECs凋亡情况。结果 与大气压培养比较,中压力培养未见HUVECs凋亡,高压力培养凋亡百分率增加,48h达到最高(P<0.001)。两种浓度Cap均能抑制高压力培养对HUVECs的促凋亡作用。结论 高压力培养能诱导HUVECs凋亡,并呈时间依赖性。而Cap能减轻高压力培养对HUVECs的促凋亡作用。     

乔松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的探讨蜂胶乔松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响。方法用消化灌注法收集人脐静脉内皮细胞进行体外原代培养,于培养液中给予10 mg/L脂多糖处理以建立细胞凋亡模型,乔松素处理组于模型条件培养液中分别加入不同浓度的乔松素(50、100和200 mg/L)干预,共同孵育24 h。光镜下观察细胞形态,MTT法测定细胞存活率以观察细胞增殖变化,缺口末端标记技术TUNEL法检测细胞凋亡率,免疫细胞化学法检测信号转导系统核因子κB亚基p65核易位变化。结果模型组内皮细胞凋亡率明显高于阴性对照组,不同浓度乔松素组细胞凋亡率均低于模型组,同时细胞存活率增高(P0.01)。加入不同浓度乔松素能显著降低脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞核因子κB p65核易位活性(P0.01)。结论乔松素可通过抑制脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡而保护内皮细胞功能,其机制可能与抑制核因子κB p65活化有关。     

ACE2基因表达增加对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡的影响

目的探索在AngII干预下ACE2基因表达增加对人血管内皮细胞增殖、凋亡的影响。方法原代培养人脐静脉血管内皮细胞。用构建、包装好的慢病毒重组ACE2基因表达载体（Lentiviral—ACE2）以感染复数为10（MOI=10）感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。感染72h后,以AnglI（终浓度为10。mol／L）干预细胞,倒置相差显微镜观察各组HUVEC的形态学变化,AlamarBlue试剂检测各组HUVEC增殖功能,TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测各组HUVEC的凋亡。结果AngⅡ组与AngII＋Lentiviral—GFP组细胞生长状态差,生长缓慢,形态不规则并且有不同程度脱壁悬浮的细胞;而正常细胞对照组与AngII＋Lentiviral—ACE2组细胞生长状态良好,圆形、卵圆形,饱满,形态正常呈“铺路石”样生长,紧密贴壁,悬浮细胞少。AngII组较正常细胞对照组、Ang1I＋Lentiviral—ACE2组AlamarBlue被还原率明显降低（P〈O．05）。Ang11组的凋亡指数为（0．1165±0．0181）,与正常细胞对照组凋亡指数（0．0373±0．0113）和AngⅡ＋Lentiviral—ACE2组凋亡指数（0．0540±0．0061）相比差异有统计学意义（P〈0．05）。AngII组与AngⅡ＋Lentiviral—GFP相比、正常细胞对照组与AngII＋Lentiviral—ACE2组相比,AlamarBlue被还原率和凋亡指数差异无统计学意义。结论AngⅡ具有促进人脐静脉内皮细胞增殖能力下降和凋亡增加的作用。ACE2表达增~IIII抑制AngⅡ诱导的人脐静脉内皮细朐增殖活件降低和凋亡增加．对人脐静脉内皮细胞具有保护作用。     

Parthenolide对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的作用研究

目的观察Parthenolide对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖和凋亡的影响。方法胶原酶消化法培养HUVEC,在HUVEC培养基中加入不同浓度的Parthenolide作用不同的时间,以MTT法检测细胞的增殖活性,TUNEL法检测细胞凋亡。结果与对照组相比,1、5μmol/L Parthenolide组对脐静脉内皮细胞增殖活性的抑制作用无明显影响(P>0.05);10、15、20μmol/L Parthenolide组显著抑制HUVEC的增殖活性(均P<0.01),并且呈时间依赖性和剂量依赖性增加。5μmol/L Parthenolide组在6h、12h、24h时,细胞凋亡指数与对照组相比均无统计学差异(均P>0.05),101、5μmol/L Parthenolide组在6h、12h、24h各个时间段的凋亡指数均高于对照组(均P<0.01);且Parthenolide10μmol/L和15μmol/L组在12和24h的凋亡指数均高于6h(P<0.01),但12和24h上述两组相比无统计学差异(P>0.05)。结论一定浓度范围内的Parthenolide对内皮细胞的增殖和凋亡无明显影响,而高浓度时可同时抑制细胞增殖和诱导HUVEC凋亡。     

The Effects and Mechanism of GSA on Expression of MCP-1 in Cultured Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Objectives To investigate the effects and mechanism of glycated serum albumin(GSA) on expression of Monocyte chemoattratant protein-1(MCP-1) in Endothelial Cells. Methods Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)are cultured with GSA of different concentrations and interfered by glycosylation products inhibitor Aminoguanidine (AG) and anti-oxidant N-acetylcy-steine (NAC), The expression of MCP-1 are evaluated by Immunocytochemistry and Sandwich ELISA. MDA content and SOD activity are determined by the technique of TBA and XOD respectively. Results GSA can stimulate MCP-1 production and secretion. Immunocytochemistry showed that after HUVECs were cultured with 50 mg/L GSA, expression of MCP-1 in group 4hrs, 8hrs and 12hrs was 1.3, 1.9 and 2.8 fold as much as that in control group (P < 0.01), and there was significant difference among the experiment groups(P < 0.01). Sandwich ELISA showed that expression of MCP-1 in three different groups was 1.6, 2.4 and 3.0 fold as much as that in control group(P < 0.01), and there was significant difference among the experiment groups(P < 0.01); GSA can cause the decrease of SOD activity(P < 0.05) and increase of MDA content(P < 0.01); AG and NAC can restrain obviously the expression of MCP-1 of HUVECs stimulated by GSA(P < 0.01); NAC can restrain the effect of GSA on SOD activity and MDA content in HUVECs (P < 0.05). Conclusions GSA can stimulate the expression of MCP-1 of endothelial cells by inducing endothelial cells oxidative stress.     

波动性高糖对人脐静脉血管内皮细胞的损伤及其机制的研究

目的 观察波动性高糖在体外诱导人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的损伤作用,并探讨其机制.方法 以HUVEC为研究对象,体外培养至第三代,实验分为:A组为正常组(正常培养的细胞),B组给予恒定加入5.5mmol/L 葡萄糖(Glu),C组给予恒定加入7.8mmol/L Glu,D组给予每24h轮换加入5.5mmol/L/7.8mmol/L Glu,E组给予恒定加入14.5mmol/L Glu,F组给予每24h轮换加入5.5mmol/L/14.5mmol/L Glu,G组给予恒定加入20mmol/L Glu,H组给予每24h轮换加入5.5mmol/L/20mmol/L Glu各组分别与HUVEC孵育5d,测定各组细胞液中的细胞活力(MTT)指标.测定正常对照组、恒定性高糖组(E组和G组)及波动性高糖组(F组和H组)细胞上清液中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶活力(SOD)、一氧化氮(NO)的含量、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)含量及细胞凋亡率,并在显微镜下观察细胞形态变化.结果 培养液中SOD、NO的含量在波动性高糖组与恒定性高糖组均与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);培养液中MDA及ICAM-1的含量在波动性高糖组与恒定性高糖组均与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).波动性高糖与恒定性高糖均可导致HUVECs出现凋亡的形态学变化,波动性高糖组的凋亡率与恒定性高糖组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 (1)波动性高糖和恒定性高糖对人脐静脉血管内皮细胞均有损伤,且波动性高糖对其损伤更大.(2)波动性高糖体外诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤的机制可能与其氧化应激水平更高,炎症反应加重及细胞凋亡率增加有关.     

重组C反应蛋白促进脐静脉内皮细胞表达基质金属蛋白酶2

目的观察重组C反应蛋白(CRP)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响。方法采用逆转录聚合酶链反应及蛋白质免疫印迹分析检测MMP-2mRNA转录和蛋白水平表达,观察不同浓度CRP及不同孵育时间对HUVEC MMP-2表达的影响。结果CRP呈浓度和时间依赖性增加培养HUVEC的MMP-2mRNA转录和蛋白水平的表达。结论CRP可上调HUVEC MMP-2表达。     

白细胞介素6在登革热病毒感染人脐静脉内皮细胞中的作用

以人脐静脉内皮细胞（EC）为靶细胞研究白细胞介素6（IL—6）对登革Ⅱ型病毒（D2V）增殖的影响，以及感染细胞产生IL—6水平的动态变化。结果显示：（1）IL—6对人脐静脉EC中的D2V增殖有增强作用；（2）D2V感染能诱导人脐静脉EC产生IL—6、IL—6的分泌水平与D2V感染量呈正相关。     

差异显示法研究氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞基因差异表达

目的：研究血管内皮细胞在致动脉粥样硬化因子作用下，差异表达基因的结构与功能。 方法：氧化低密度脂蛋白（ＯＸ－ＬＤＬ）诱导培养的人脐静脉内皮细胞，用差异显示－多聚酶链式反应（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）技术，克隆表达水平有明显差异的基因片段，并用Ｎｏｒｔｈｅｎ印迹法证实阳性结果。 结果：发现ＯＸ－ＬＤＬ诱导培养的人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）出现一些上、下调节的基因片段。已知的上调基因包括人的胸腺素（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ）β４、细胞间粘附因子（ＩＣＡＭ）－１、ＦＫ５０６结合蛋白、ＥＲｐ７２；下调的基因有细胞色素Ｂ５６１、Ｒｅｓｔｉｎ。用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹证实了ＤＤＲＴ－ＰＣＲ的结果，不同的上、下调节基因表达水平变化在３０％～２００％之间不等。 结论：本研究首次用ＤＤＲＴ－ＰＣＲ的方法证实在体外ＯＸ－ＬＤＬ可诱导ＨＵＶＥＣ许多基因表达水平的变化。细胞中细胞间粘附因子的高表达，进一步说明细胞间粘附因子是参与动脉粥样硬化过程重要的粘附分子。胸腺素β４基因的上调表达与ＯＸ－ＬＤＬ诱导细胞肌动蛋白张力纤维的生成增加有关，可能影响内皮细胞的增殖。     

阿托伐他汀对内皮细胞增殖和内皮脂酶mRNA表达的影响

目的探讨阿托伐他汀对人脐静脉内皮细胞增殖和内皮脂酶mRNA表达的影响。方法不同浓度阿托伐他汀(2、4、6、8及10μmol/L)与人脐静脉内皮细胞分别孵育2、4、8、12及24 h后,用半定量逆转录聚合酶链反应法检测人脐静脉内皮细胞内皮脂酶mRNA的表达,用嗜银蛋白分析法观察人脐静脉内皮细胞的增殖情况。结果阿托伐他汀抑制人脐静脉内皮细胞内皮脂酶mRNA表达,该作用呈剂量依赖性和时间依赖性。阿托伐他汀作用下,人脐静脉内皮细胞内嗜银蛋白颗粒随浓度的增加和作用时间的延长减少趋势越明显。两因素直线相关分析显示,内皮脂酶mRNA表达与嗜银蛋白颗粒数呈正相关关系(r=0.963,P<0.01)。结论阿托伐他汀抑制人脐静脉内皮细胞的增殖,抑制人脐静脉内皮细胞内皮脂酶mRNA的表达,且呈时间—剂量依赖性。人脐静脉内皮细胞的增殖与人脐静脉内皮细胞内皮脂酶mRNA的表达呈正相关。     

高表达整合素连接激酶促进脐静脉内皮细胞增殖

目的探讨高表达整合素连接激酶对体外培养人脐静脉内皮细胞增殖的影响。方法利用高表达整合素连接激酶的腺病毒转染脐静脉内皮细胞,诱导其在脐静脉内皮细胞中高表达。采用噻唑蓝法、流式细胞术、EDU法检测脐静脉内皮细胞增殖能力;Western blot检测脐静脉内皮细胞蛋白激酶B(Akt)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达及其蛋白磷酸化水平。结果整合素连接激酶在脐静脉内皮细胞高表达后,噻唑蓝法、流式细胞术、EDU法检测结果均表明:整合素连接激酶病毒转染组细胞增殖能力明显高于空病毒转染对照组(P<0.05或P<0.01)。Western blot检测发现整合素连接激酶病毒转染组蛋白激酶B、内皮型一氧化氮合酶磷酸化水平较对照组明显升高(P<0.05),而蛋白激酶B、内皮型一氧化氮合酶的表达水平两组间无差异。结论整合素连接激酶能促进脐静脉内皮细胞增殖,其机制可能通过激活下游Akt/eNOS通路。