2',4'-二羟基-3'-甲基-3-甲氧基查耳酮上调p21抑制人肝癌HepG2细胞的生长

目的 探讨2'',4''-二羟基-3''-甲基-3-甲氧基查耳酮(C20)对人肝癌HepG2细胞的体外抗肿瘤作用及其潜在的作用机制。方法 通过CCK-8法、集落形成实验、5-乙炔基-2''-脱氧尿苷(EdU)染色法检测C20对人肝癌HepG2细胞增殖的影响;通过彗星实验检测C20(10 μmol·L^-1)对HepG2细胞DNA损伤的影响;通过流式细胞术检测C20(5、10 μmol·L^-1)对HepG2细胞周期阻滞的影响;通过Hoechst染色和流式细胞术检测C20(5、10 μmol·L^-1)对HepG2细胞凋亡的影响。借助Western blotting法检测C20(5、10 μmol·L^-1)处理对HepG2细胞中与凋亡、DNA损伤、细胞周期阻滞相关蛋白表达水平的调控作用。结果 与对照组比较,C20显著抑制HepG2细胞的活力(P<0.001),给药48 h的半数抑制浓度(IC₅₀)为7.937 μmol·L^-1;5 μmol·L^-1 C20能够显著抑制HepG2细胞的集落形成能力(P<0.01);EdU染色结果显示5、10 μmol·L^-1的C20能够抑制人肝癌HepG2细胞的增殖能力;5、10 μmol·L^-1的C20显著诱导HepG2细胞G₂/M期阻滞(P<0.001);5、10 μmol·L^-1的C20显著促进HepG2细胞凋亡(P<0.001),并显著上调Caspas-3、Caspase-9以及PARP的剪切水平(P<0.01);10 μmol·L^-1的C20能够诱导HepG2细胞发生DNA损伤,并且5、10 μmol·L^-1的C20显著上调γH2AX、p21的蛋白水平(P<0.01)。结论 C20能够造成HepG2细胞发生DNA损伤,上调p21蛋白水平,导致细胞G₂/M期阻滞,并进一步诱发凋亡,发挥体外抗肝癌作用。     

头孢克洛分散片中聚合物测定

目的 建立2种头孢克洛聚合物有效的测定方法并对结果进行比较。方法 方法1：采用TSKgel G2000SWxl色谱柱（7.8 mm×300 mm,5 μm）,流动相为0.01 mol·L^-1磷酸盐缓冲液[0.01 mol·L^-1 NaH₂PO₄溶液-0.01 mol·L^-1 Na₂HPO₄溶液（50︰50）,调节pH值为7.0]-乙腈（95︰5）,流速为0.5 mL·min^-1柱温35℃,检测波长为254 nm,进样量20 μL;方法2：采用Sephadex G-10色谱柱（10 mm×300 mm,40~120 μm）,以0.05 mol·L^-1磷酸盐缓冲液[取0.05 mol·L^-1 Na₂HPO₄溶液-0.05 mol·L^-1 NaH₂PO₄溶液（50︰50）,调节pH至7.0]为流动相A,水为流动相B,流速为1 mL·min^-1,柱温35℃,检测波长为254 nm,进样量100 μL。结果 方法1：头孢克洛主峰与聚合物峰分离度>1.5,头孢克洛质量浓度在0.25~20 μg·mL^-1内线性关系良好（r=0.999 9）;定量限0.21 μg,检测限0.07 μg。重复性较好（RSD为1.8%,n=6）;在拟定的色谱条件下,通过考察破坏坏性实验（高温、强酸、强碱、氧化、光照）能够满足分离度要求,辅料无干扰;方法2：质量浓度在2.5~20 μg·mL^-1线性关系良好（r=0.999 7）;检测限0.13 μg,定量限0.40 μg。重复性良好（RSD为1.8%,n=6）。结论 新建立的2种方法对于头孢克洛分散片聚合物的分离度好,分离效率高,重复性好,均可以作为头孢克洛分散片的质量控制的依据。     

高效分子排阻色谱法测定抗毒素/抗血清类制品纯度

目的 建立高效分子排阻色谱法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）测定抗毒素/抗血清类制品纯度，并应用该方法对52批样品进行测定。方法 采用TOSOH TSKgelG3000SWxl色谱柱，以含1%异丙醇，0.2 mol·L^-1磷酸盐缓冲液（pH 7.0）为流动相，流速0.6 mL·min^-1，检测波长280 nm，进样体积20 μL，柱温室温，按面积归一化法计算各组分相对百分含量。结果 选取抗毒素类和抗血清类制品各1批，在蛋白质浓度为1.2~24 mg·mL^-1时，主峰F（ab''）₂、大分子杂质峰和小分子杂质峰峰面积均与相应蛋白质浓度呈良好线性关系（n=5，r>0.999 0），重复性RSD均在0.4%~0.9%（n=6），主成分F（ab''）₂定量限分别为0.1 μg和0.2 μg，检出限分别为0.02 μg和0.1 μg，制备的供试品溶液在室温条件下12 h内各组分稳定性良好。结论 建立的HPSEC可用于抗毒素/抗血清类制品纯度的测定。     

细胞色素P450介导的氯沙坦钾对瑞格列奈在大鼠肝微粒体中代谢的影响

目的 研究瑞格列奈在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学，并考察氯沙坦钾对其在大鼠肝微粒体中代谢的影响。方法 建立大鼠肝微粒体体外孵育体系对瑞格列奈的代谢进行研究；以洛伐他汀为内标，应用UPLC测定大鼠肝微粒体中瑞格列奈的浓度。采用底物减少法，通过GraphPad Prism 5.0软件计算瑞格列奈的酶促反应动力学常数V_max和K_m；分别以系列浓度氯沙坦钾（2.5~50μmol·L^-1）与瑞格列奈（44 μmol·L^-1）于37℃水浴中共同孵育，并测定肝微粒体中瑞格列奈的减少量，考察氯沙坦钾对瑞格列奈的抑制作用。结果 瑞格列奈在大鼠肝微粒体的最佳孵育时间为40 min，最佳蛋白质量浓度为1 mg·mL^-1；瑞格列奈酶促反应动力学参数V_max=47.29μmol·min^-1·（mg·protein）^-1，K_m=51.41 μmol·L^-1；氯沙坦钾对瑞格列奈在体外肝微粒体抑制作用的IC₅₀值为17.89 μmol·L^-1。结论 氯沙坦钾对瑞格列奈在大鼠肝微粒体中的代谢具有较强的抑制作用，两药联合应用可能发生相互作用，具有诱发低血糖的风险。     

吉马酮通过HBXIP/p53信号通路诱导A549、CNE-1、HepG2细胞凋亡

目的 研究吉马酮诱导肺癌 A549、 鼻咽癌 CNE-1、 肝癌 HepG2 细胞凋亡的机制 。 方法 50、 150、 200、250、300 μmol·L^-1的吉马酮处理肝癌 HepG2、肺癌 A549、鼻咽癌 CNE-1、结肠癌 Caco-2 细胞 24、48、72 h 后,MTT 实验检测细胞的存活率的变化。100、150、200 μmol·L^-1的吉马酮分别处理 A549、HepG2、CNE-1细胞 48 h后采用流式细胞术检测细胞凋亡的变化;Western blotting 实验检测细胞凋亡标志蛋白 cleaved-Caspase-3、Caspase-3 的变化,检测乙型肝炎 X相互作用蛋白（HBXIP）、p53蛋白的表达量变化。分别在 A549、HepG2、CNE-1细胞中应用 siRNA 敲低 HBXIP,Westernblotting实验检测 HBXIP的敲低效果及 p53蛋白表达变化;MTT实验检测敲低 HBXIP对吉马酮诱导的细胞增殖抑制作用的影响。结果 吉马酮对鼻咽癌CNE-1、肝癌HepG2细胞增殖抑制作用较强,与溶剂对照组比较,200、250、300 μmol·L^-1组细胞存活率显著下降（P＜0.05）;在高浓度时对肺癌A549细胞增殖抑制效果较强,与溶剂对照组比较,250、300 μmol·L^-1组细胞存活率显著下降（P＜0.05）;对结肠癌Caco-2细胞作用相对较弱。与对照组比较,100、150、200 μmol·L^-1吉马酮处理A549、HepG2、CNE-1细胞 48 h后,凋亡率显著升高（P＜0.05）,cleaved-Caspase-3、p53蛋白表达显著上升（P＜0.05）;以 150、200 μmol·L^-1吉马酮处理A549、HepG2、CNE-1细胞48 h后,HBXIP的蛋白表达显著降低（P＜0.05）。siRNA-HBXIP处理48 h后,与对照组比较,HBXIP的蛋白表达量显著下降（P＜0.05）,p53蛋白表达量显著上升（P＜0.05）。与单独使用的相同浓度的吉马酮相比,沉默HBXIP后A549、HepG2、CNE-1细胞对吉马酮的敏感度明显提高,150、200、250 μmol·L^-1组均差异显著（P＜0.05）。结论 吉马酮可以抑制A549、HepG2、CNE-1细胞增殖、诱导细胞凋亡,作用机制可能与调控HBXIP/p53信号通路相关。     

防己诺林碱阻断自噬抑制 H1N1病毒感染的研究

目的 探索防己诺林碱在细胞水平抗H1N1病毒的作用,阐明防己诺林碱调控细胞自噬抑制H1N1病毒复制的分子机制。方法 CCK-8法检测0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0、20.000 0、40.000 0、60.000 0 μmol·L^-1的防己诺林碱对MDCK细胞活力的影响;MDCK细胞设置对照组、模型组和防己诺林碱（2.5、5.0、10.0 μmol·L^-1）组,除对照组外,以感染复数（MOI）为0.1的H1N1病毒感染MDCK细胞,加入防己诺林碱共同孵育12 h,同时设置防己诺林碱（10.0 μmol·L^-1）与病毒共同孵育4、8 h组,通过实时荧光定量PCR （qRT-PCR,检测HIN1 mRNA表达）和Western blotting ［H1N1病毒核蛋白（NP）］检测防己诺林碱对病毒复制的抑制作用;PI/Hoechst 33342染色检测防己诺林碱（10.0 μmol·L^-1）对MDCK细胞死亡的影响;qRT-PCR法检测防己诺林碱检测防己诺林碱预处理、病毒感染早期药物处理、病毒感染晚期药物处理以及吸附和进入阶段给药对病毒复制的影响;MDCK细胞转染EGFP-LC3或EGFP-mCherry-LC3双荧光质粒,观察防己诺林碱对EGFP-LC3的荧光强度、EGFP-mCherry-LC3共定位的影响,设置自噬诱导剂雷帕霉素（0.5 μmol·L^-1）、自噬晚期抑制剂氯喹（10 μmol·L^-1）、巴佛洛霉素A1 （100 nmol·L^-1）对照。转染过EGFP-LC3质粒的MDCK细胞感染H1N1病毒,免疫荧光检测防己诺林碱对LC3与胞内的病毒NP蛋白共定位的影响;体外培养A549细胞,以MOI为0.1的H1N1病毒感染,Western blotting检测防己诺林碱对LC3II/LC3I蛋白表达的影响。结果 防己诺林碱对MDCK细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）为40.19 μmol·L^-1 ;与模型组比较,防己诺林碱以浓度相关性的方式抑制HIN1 mRNA表达,以浓度和时间相关性的方式抑制NP蛋白表达（P＜0.01、0.001）;显著减少H1N1诱导的细胞死亡（P＜0.001）;抑制H1N1病毒进入过程。与对照组比较,防己诺林碱处理诱导LC3荧光聚集,诱导EGFP-LC3和mCherry-LC3双荧光共定位显著增加（P＜0.001）。与模型组比较,防己诺林碱处理明显减少NP的荧光数量（P＜0.001）,同时造成LC3荧光积累并与胞内的病毒NP蛋白共定位;引起LC3II积累（P＜0.01、0.001）。结论 防己诺林碱同氯喹和巴佛洛霉素A1一致,阻断自噬途径,使病毒粒子在自噬体内滞留,破坏病毒生命周期。     

乌骨藤中C21甾体苷诱导SACC-83和SACC-LM细胞凋亡的作用及其机制研究

目的 研究乌骨藤提取物C₂₁甾体苷对唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinomacv,SACC）低侵袭细胞株（salivary adenoid cystic carcinoma-83,SACC-83）和肺高转移细胞株（SACC-LM）增殖抑制和诱导凋亡的作用及其机制。方法 用不同浓度（5,10,20,40,60,80,100 μmol·L^-1） C₂₁甾体苷处理SACC-83和SACC-LM细胞48 h后,MTT法检测细胞活力,并计算药物的IC₂₀和IC₅₀;细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测SACC-83及SACC-LM细胞凋亡情况;实时荧光定量PCR和Western blot检测SACC-83和SACC-LM细胞Bcl-2、Bax、caspase 3的mRNA和蛋白的表达。结果 不同浓度的C₂₁甾体苷降低SACC-83和SACC-LM细胞活力,抑制细胞增殖,并且作用于SACC-83细胞C₂₁甾体苷的IC₂₀浓度为7.49 μmol·L^-1,IC₅₀浓度为38.34 μmol·L^-1;作用于SACC-LM细胞的C₂₁甾体苷IC₂₀浓度为9.30 μmol·L^-1,IC₅₀浓度为46.04 μmol·L^-1;细胞克隆集落形成明显减少。C₂₁甾体苷IC₂₀浓度分别促进SACC-83及SACC-LM细胞凋亡,且随着给药时间延长,凋亡率增加,具有显著性差异（P<0.05,P<0.01）。经7.49,9.30 μmol·L^-1 C₂₁甾体苷分别处理SACC-83及SACC-LM细胞后,Bcl-2的mRNA及蛋白水平显著降低（P<0.01）,而Bax、Caspase 3的mRNA和蛋白水平显著升高（P<0.05）。结论 乌骨藤C₂₁甾体苷抑制SACC-83及SACC-LM细胞增殖、促进凋亡,其作用机制可能与调控Bcl-2、Bax和Caspase 3表达有关。     

6种药物对有机阴离子转运多肽OATP1B1及其基因多态性A388G、T521C转运作用的影响

目的 研究6种药物对有机阴离子转运多肽OATP1B1及其基因多态性A388G、T521C转运作用的影响。方法 体外培养稳定高表达OATP1B1和OATP1B1基因多态性A388G、T521C的人胚肾细胞（HEK293）株,高表达空白载体（Mock）的HEK293细胞为空白对照,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测各转运体细胞中mRNA表达;放射性标记化合物³Hestrone sulfate作为转运底物、利福平作为阳性抑制剂验证各高表达细胞的转运活性;测定30 μmol·L^-1的达比加群、辛伐他汀、替格瑞洛、卡培他滨、多西他赛、依那普利对各细胞³H-estrone sulfate摄入活性的抑制作用,并依据抑制试验结果,进一步测定辛伐他汀、替格瑞洛、多西他赛对转运体细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）。结果 HEK293细胞内导入的各种转运体基因都呈现良好的复制表达;OATP1B1、OATP1B1/A388G、OATP1B1/T521C对底物³H-estrone sulfate（5 μmol·L^-1）的转运活性分别为Mock细胞的39、49和48倍,30 μmol·L^-1利福平添加后,可将细胞的转运活性抑制到50%以下;辛伐他汀、替格瑞洛、多西他赛对OATP1B1的抑制作用较强,30 μmol·L^-1给药的转运活性分别为对照组的（40.09±1.95）%、（33.82±0.61）%、（45.08±0.22）%;辛伐他汀对OATP1B1、OATP1B1/A388G、OATP1B1/T521C的IC₅₀分别为14.2、＞100、＞100 μmol·L^-1,替格瑞洛的IC₅₀分别为19.1、68.4、＞100 μmol·L^-1,多西他赛的IC₅₀分别为17.6、22.9、19.3 μmol·L^-1。结论 OATP1B1基因多态性在一定程度上改变了抑制剂对转运体活性的影响程度。     

山胡椒内生真菌Trichoderma sp. SHJN1和Perenniporia sp. SHJG1的抗肿瘤活性成分研究

目的 从民族药山胡椒内生真菌Trichoderma sp.SHJN1和Perenniporia sp.SHJG1的代谢物中寻找活性先导化合物。方法 采用正相硅胶、反相硅胶、Sephadex LH-20凝胶及制备型HPLC等对Trichoderma sp.SHJN1和Perenniporia sp.SHJG1发酵物进行分离纯化，再通过NMR、ESI-MS等鉴定化合物结构，同时采用人乳腺癌细胞（MCF-7）和人肺癌细胞（A549）对这些化合物的抗肿瘤活性进行初步评价。结果 从2株内生真菌次级代谢产物中共分离鉴定了12个化合物：alantrypinone （1）、oryzalactam （2）、phomoindene A （3）、cis-gregatin B （4）、huaspenone B （5）、stigmasta-7，22-dien-3β，5α，6α-triol （6）、ergosterol （7）、1-deoxy-2-demethylviridiol （8）、viridiol （9）、trichodermamides A （10）、chromone （11）、对-羟基苯乙酸（12）。抗肿瘤活性评价结果显示，化合物3 抑制MCF-7细胞增殖活性IC₅₀为（62.9±1.02）μmol·L^-1[顺铂（cisplatin，DDP） IC₅₀为（30.1±1.67）μmol·L^-1]；化合物8 和9 抑制A549细胞增殖活性的IC₅₀分别为（34.6±1.57）μmol·L^-1和（44.9±1.74）μmol·L^-1[DDP IC₅₀为（20.6±1.42）μmol·L^-1]。结论 化合物3 ，8 和9 具有潜在抗肿瘤活性。     

高灵敏度HPLC测定大鼠血浆中益母草碱浓度及其药动学研究

目的 建立一种高灵敏度HPLC测定大鼠血浆中益母草碱浓度,并研究益母草碱在大鼠体内的药动学特征。方法 大鼠口服益母草碱混悬溶液（50 mg·kg^-1）后,不同时间点尾静脉采血,以苯甲酰精氨酸乙酯为内标,血浆样品经酸化后乙酸乙酯萃取,采用HPLC进行测定。色谱条件：采用Diamonsil C₁₈（250 mm×4.6 mm,5 μm）为色谱柱,以乙腈-0.02 mol·L^-1磷酸二氢钾缓冲溶液（pH 3.0）（22：78）为流动相,流速1.0 mL·min^-1,柱温35℃,检测波长277 nm。并利用PKS 1.0软件计算药动学参数。结果 益母草碱血浆浓度在0.05~1.5 μg·mL^-1内线性关系良好（r=0.999 1）。方法的定量下限（LLOQ）为0.05 μg·mL^-1（RSD=12.8%,n=5）;提取回收率为76.5%~82.5%;批内、批间准确度为96.9%~104.9%;日内、日间精密度均<10%;质控样品经反复冻融3次及-20℃放置1个月后均较稳定。大鼠口服益母草碱后,药-时曲线符合二室开放模型,主要药动学参数为t_max=0.95 h,C_max=0.51 μg·mL^-1,t_1/2=3.64 h,AUC_0-t=1.56 μg·mL^-1·h^-1,AUC_0-∞=1.78 μg·mL^-1·h^-1。结论 该方法准确度、灵敏度高,重复性好,可用于生物样品中益母草碱浓度的测定。     

血清hs-CRP、IL-6、PCT对新型冠状病毒肺炎患者的诊断及预后评估的临床意义

目的探讨检测超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素6(IL-6)、降钙素原(PCT)对新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者预后评估的临床价值。方法选择150例COVID-19患者按诊断标准分为4组:轻型组(48例)、普通型组(45例)、重型组(35例)、危重型组(22例),测定各组患者血清hs-CRP、IL-6、PCT水平,并分析血清hs-CRP、IL-6、PCT水平对COVID-19患者预后评估以及对死亡风险的预测。结果对于血清hs-CRP、IL-6、PCT水平,危重型组>重型组>普通型组>轻型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着患者病情的加重,APACHEII评分也逐渐升高,但差异无统计学意义。血清hs-CRP、IL-6、PCT三者联合检测对患者预后的判断强于单一项目。与存活组比较,死亡组的hs-CRP、IL-6、PCT明显升高,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。血清hs-CRP、IL-6、PCT水平联合检测在预测COVID-19死亡风险的准确率大于单一项目(P<0.05),与APACHE II评分相差不大。结论血清hs-CRP、IL-6、PCT联合检测有助于判断COVID-19患者的预后,并且可以用来评估COVID-19患者的死亡风险。     

HPLC-MS/MS测定人血浆中氟比洛芬的浓度及其生物等效性研究

目的 建立并验证一种简单、快速、灵敏的测定人血浆中氟比洛芬的液相色谱-串联质谱分析方法,研究氟比洛芬凝胶贴膏在中国健康受试者体内的药动学特征并评价生物等效性。方法 液相条件:使用InertSustain C₁₈色谱柱(3.0 mm×100 mm,3 μm);柱温设定为40℃;流动相A为甲醇-乙腈(40:60),B为0.1%甲酸水溶液;流速为0.6 mL·min^-1;梯度洗脱,血浆样品采用蛋白沉淀的前处理方法。质谱条件:离子源为电喷雾离子化源(ESI);负离子模式;氟比洛芬和氟比洛芬-d5的检测离子对分别为m/z 243.1→199.2和m/z 248.0→204.3。结果 本分析方法总运行时间为4.5 min,氟比洛芬和氟比洛芬-d5的保留时间分别为2.43,2.44 min。该方法在0.5~100 ng·mL^-1内线性关系良好。批内精密度在1.3%~12.5%,准确度在97.2%~115.2%。批间精密度在1.9%~11.6%,准确度在99.5%~107.8%。提取回收率范围为103.5%~104.9%,基质效应不显著。在不同的测试条件下,氟比洛芬在溶液和血浆中都是稳定的。验证方法成功应用于一项在中国健康志愿者开展的随机、开放、两周期、四序列、交叉给药的生物等效性研究。结果表明,2种每40 mg氟比洛芬凝胶贴膏在外用给药下,生物等效性符合接受标准,安全和耐受性良好。参比制剂和受试制剂的药动学参数为C_max(19.695±13.159)和(18.135±11.772)ng·mL^-1、T_max(19.375±3.807)和(19.575±4.138)h、AUC_0-∞(534.402±272.792)和(506.529±256.746)h·ng·mL^-1。结论 该方法可应用于氟比洛芬凝胶贴膏的生物等效性研究。     

基于网络药理学和实验验证的黄芪六一汤药效组分促肾小管上皮细胞自噬抗糖尿病肾病的机制研究

目的 通过网络药理学分析及相关的动物实验探讨黄芪六一汤药效组分（HQD）调控肾小管上皮细胞自噬水平抗糖尿病肾病（DN）的机制。方法 采用 DN 大鼠模型考察 HQD 抗 DN 的作用。利用 SwissTargetPrediction 数据库获得 HQD 主要入血成分的相关靶点,并与 GeneCard、DisGeNET 和 OMIM 数据库中筛选的疾病靶点取交集;利用 STRING 数据库和Cytoscape 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络获得核心靶点;采用 Metascape 数据库对交集靶点进行基因本体（GO）注释及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。利用 DN 大鼠模型对预测结果进行验证。结果 与对照组比较,HQD 能显著降低 DN 模型大鼠血糖（FBG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、24 h 尿白蛋白（24 h-U-Alb）值（P＜0.05）,抑制肾组织细胞凋亡（P＜0.05）。网络药理学研究显示 HQD 主要通过 STAT3、EGFR、VEGFA、JUN、TNF、AKT1、CASP3、mTOR、IL2 等关键靶点,作用于癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 等信号通路;动物验证实验显示 HQD 能下调 PI3K/Akt/mTOR 信号通路相关蛋白的表达,上调肾脏组织自噬相关蛋白 Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达（P＜0.05）,增加肾小管上皮细胞自噬体及自噬溶酶体数量。结论 HQD 抗 DN 的分子机制可能与抑制 PI3K/Akt/mTOR 信号通路激活,促进肾小管上皮细胞自噬水平,抑制细胞凋亡,减轻肾小管上皮细胞损伤有关。     

香贝散通过激活AMPK/mTOR信号通路抑制人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231生长

目的 探讨香贝散体外抗乳腺癌作用及其分子机制。方法 体外培养人乳腺癌细胞 MCF-7、MDA-MB-231,给予香贝散 1、2、3、4、5 mg·mL^-1加药处理,对照组不加药。利用 MTT 法和克隆形成实验检测细胞增殖,利用流式细胞术检测细胞凋亡,细胞划痕和细胞侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力,借助吖啶橙染色法观察细胞自噬,借助转录组测序技术探索香贝散诱导乳腺癌细胞死亡的作用机制,并采用 Western blotting 法检测 AMP 依赖的蛋白激酶（AMPK）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、LC-3、Beclin-1 蛋白表达水平。结果 与对照组比较,香贝散显著抑制人乳腺癌 MCF-7、MDA-MB-231 细胞活力（P＜0.05、0.001）,48 h 半数抑制浓度（IC₅₀）分别为 2.344、1.961 mg·mL^-1,且具有时间、浓度相关性;显著抑制 MCF-7、MDA-MB-231 细胞的集落形成能力;显著诱导 MCF-7、MDA-MB-231 细胞凋亡（P＜0.001）;明显抑制人乳腺癌 MCF-7、MDA-MB-231 细胞的体外迁移能力和侵袭能力;吖啶橙染色实验结果提示香贝散能够诱导 MCF-7、MDA-MB-231 细胞发生自噬,Western blotting 实验结果显示香贝散能够显著上调 MCF-7、MDA-MB-231 细 胞 中 自 噬 关 键 蛋 白 Beclin-1 和 LC3-Ⅱ的表达（P＜0.01、0.001）;转录组测序技术发现差异基因变化最明显的通路包括 mTOR 信号通路、自噬信号通路等 ,Western blotting 实验结果显示香贝散显著下调 mTOR 的磷酸化水平（P＜0.001）,显著上调 AMPK 的磷酸化水平（P＜0.001）。结论 香贝散能够显著抑制人乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,能够诱导凋亡和自噬的发生,激活 AMPK/mTOR 信号通路可能是其重要机制。     

他克莫司对白癜风小鼠Th17/Treg细胞平衡及黑素细胞丢失的影响

目的 探究他克莫司对白癜风小鼠辅助性T17（Th17）/调节性T （Treg）细胞平衡和黑素细胞丢失的影响。方法 将小鼠随机分为对照组、模型组和他克莫司低、中、高剂量组（涂抹10、50、100 mg 0.03%他克莫司软膏）,使用松香/蜡混合物对小鼠背部相同位置进行去毛,大小为2 cm×2 cm,将其分为两部分：用药区域与非用药区域,面积1：1。除对照组外,于小鼠背部用药区均匀涂抹50 mg 40%莫诺苯宗软膏,每天1次,连续90 d,制备白癜风模型。莫诺苯宗涂抹30 d后开始于相同位置涂抹他克莫司软膏,2种药膏涂抹时间间隔7 h,他克莫司软膏每天早晚各涂抹1次,连续用药60 d。肉眼观察小鼠皮毛脱色情况并进行脱色评分,通过反射式共聚焦显微镜（RCM）观察小鼠皮肤黑素细胞和黑色素的分布,取小鼠皮损进行苏木精-伊红染色（HE）和马松染色（MF）对基底层黑素细胞和含黑色素的毛囊进行计数,通过流式细胞术测定小鼠外周血中Th17和Treg淋巴细胞的比例,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测外周血白细胞介素-17（IL-17）、IL-22和叉头型基因p3（Foxp3）的含量。结果 与对照组比较,白癜风模型组小鼠用药区皮毛明显脱色,脱色评分显著升高（P<0.05）,皮损处色素明显缺失;含黑色素的毛囊和黑素细胞显著减少（P<0.05）;Th17/Treg淋巴细胞比例显著升高（P<0.05）;血清IL-17、IL-22水平显著上升,Foxp3水平显著降低（P<0.05）。与模型组比较,他克莫司各组小鼠皮毛脱色情况明显改善,脱色评分显著降低（P<0.05）,皮损处可见色素分布及黑素细胞;含黑色素的毛囊和黑素细胞显著增多（P<0.05）;Th17/Treg淋巴细胞比例显著降低（P<0.05）;IL-17、IL-22水平显著降低,Foxp3水平显著升高（均P<0.05）。结论 他克莫司可调控白癜风小鼠Th17/Treg淋巴细胞平衡,抑制其黑素细胞丢失。     

去甲斑蝥素通过下调c-met基因逆转肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药的研究

目的 本研究通过去甲斑蝥素（NCTD）作用于肺癌顺铂（DDP）耐药细胞A549/DDP,探讨其对DDP耐药的逆转作用及其相关机制。方法 应用CCK-8法检测NCTD对A549和A549/DDP细胞活力的影响、DDP对A549细胞和A549/DDP的半数抑制浓度（IC₅₀）、NCTD联合不同浓度DDP对A549/DDP细胞DDP耐药性的影响;细胞克隆形成实验检测NCTD、DDP单给药及NCTD与DDP联合用药对A549/DDP细胞克隆形成率的影响;Western blotting法检测A549/DDP和A549细胞中c-met表达,以及NCTD、DDP单给药及NCTD与DDP联合用药对A549/DDP细胞内c-met蛋白表达的影响。结果 NCTD剂量相关性地抑制A549和A549/DDP细胞的活力,选择抑制率小于10%的最大NCTD浓度即10 μmol/L作为逆转浓度;DDP作用于A549/DDP和A549细胞的IC₅₀分别为15.11和5.04 μmol/L,差异有统计学意义（P<0.01）;A549/DDP细胞中c-met表达明显高于A549细胞;用NCTD（10 μmol/L）处理后,DDP对A549/DDP细胞的IC₅₀从15.11 μmol/L减少到8.06 μmol/L,差异显著（P<0.01）;与DDP单给药组比较,NCTD联合DDP作用明显降低A549/DDP细胞克隆形成率（P<0.01）;Westernblotting结果显示,NCTD联合DDP作用明显抑制顺铂耐药细胞A549/DDP细胞中c-met蛋白的表达,单用DDP或NCTD与对照组比较差异不明显。结论 NCTD与DDP联用可逆转A549/DDP细胞对DDP耐药,其机制可能与抑制c-met蛋白表达有关。     

基于2D-LC-HR-MS/MS法的头孢丙烯原料药杂质谱分析

目的 基于二维液相色谱-高分辨串联质谱（2D-LC-HR- MS/MS）法分析头孢丙烯原料药杂质谱。方法 一维色谱条件进行样品色谱图采集,确认各杂质的出峰位置,采用 YMC Hydrosphere 色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）,以 11.5 g·L^-1磷酸二氢铵（用磷酸调节 pH 为 4.4）为流动相 A,乙腈-流动相 A（50∶50）为流动项 B,梯度洗脱;柱温 40 ℃;体积流量1.0 mL·min-1;检测波长 230 nm;进样量 4 μL。二维液相脱盐后切进高分辨串联质谱进行分析,根据结果推断杂质结构及生成机制,采用 Waters BEH C₁₈色谱柱（50 mm×2.1 mm,1.7 μm）,以 0.01% 甲酸水溶液为流动相 A,乙腈为流动相 B,切峰后开始 A 相由 98% 到 1%,柱温 40 ℃,体积流量 0.3 mL·min-1,质谱采用 Xevo G2-XS QTof MS 系统,离子源为 ESI 源,毛细管电压 3.0 kV,雾化器温度 450 ℃,扫描范围 m/z 100～2 000。结果 头孢丙烯样品中存在 9 个杂质色谱峰,其中 5 个杂质为已知杂质,峰 3 为杂质 B（头孢羟氨苄）、峰 5 为杂质 D、峰 6 为杂质 F、峰 7 为杂质 G、峰 9 为杂质 I;对其中 3 个未知杂质可能的结构式进行了初步推测以及探讨了可能的生成途径,峰 2 分子式为 C₁₈H₁₉N₃O₆S,该化合物比头孢丙烯多一个氧,分析其为头孢丙烯的氧化杂质;峰 4 分子式为 C₁₆H₁₅N₃O₆S,与杂质 B 相比增加了 1 个氧原子,减少了 2 个氢原子,判断其为 7-ACA 内酯与对羟基苯甲甘氨酸甲酯（HPGM）反应产物中的硫原子继续发生了氧化生成的;峰 8 分子式为 C₈H₉NO₂S,该组分为头孢丙烯分子结构的一部分。峰 1 有待进一步研究。结论 该方法有效解决了头孢丙烯流动相中含不挥发性磷酸盐的色谱体系与色谱-质谱快速鉴定杂质不兼容的难题,可以简单、快速地对头孢丙烯有关物质进行定性分析及杂质谱研究。     

注射用丹参多酚酸对急性脑梗死患者NIHSS评分、ADL评分和血清NSE、GST的影响

目的 观察注射用丹参多酚酸对急性脑梗死患者美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）、日常生活活动能力（ADL）评分和血清神经元特异性烯醇化酶（NSE）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的影响。方法 选取2016年1月1日—2017年7月1日南阳医专第一附属医院神经内科住院的急性脑梗死患者100例为研究对象,按照随机数字表法将患者随机分为对照组和观察组,每组50例。对照组患者在入院后常规治疗,观察组患者在对照组治疗的基础上静脉滴注射用丹参多酚酸,100 mg加入0.9%氯化钠液250 mL静脉滴注,1次/d,连续14 d。分别两组患者NIHSS、ADL评分及GST、NSE水平进行测定。结果 两组患者在治疗后14 d NIHSS评分ADL评分均较治疗前明显改善,差别具有统计学意义（P<0.05）;治疗后14 d,与对照组相比,观察组患者NIHSS评分明显下降,ADL评分明显升高,差别具有统计学意义（P<0.05）。两组患者在治疗后14 d,GST、NSE水平均较治疗前明显改善,差别具有统计学意义（P<0.05）;治疗后14 d,与对照组患者相比,观察组GST及NSE水平改善情况更明显,差别具有统计学意义（P<0.05）。结论 注射用丹参多酚酸能明显提高急性脑梗死患者血清GST水平,降低NSE水平,改善患者ADL、NIHSS评分。     

注射用丹参多酚酸治疗以头晕/眩晕为首发症状的急性脑梗死的疗效观察

目的 观察注射用丹参多酚酸治疗以头晕/眩晕为首发症状急性脑梗死临床疗效。方法 选取齐齐哈尔医学院附属第二医院神经内科2018年6月—2019年6月住院的以头晕/眩晕为首发症状的急性脑梗死病例80例,随机分为观察组和对照组,每组40例。对照组给予抗血小板聚集、他汀稳定血管斑块等常规治疗,观察组在对照组的基础上给予注射用丹参多酚酸,0.13 g加入250 mL 0.9%氯化钠中静滴,1次/d。两组均治疗14 d。观察和比较两组治疗前后的眩晕障碍量表（DHI）评分、日常生活能力评定指数量表（BI）评分。结果 治疗后,两组患者DHI评分显著降低,BI评分显著升高,同组治疗前后比较差异均具有统计学意义（P<0.05）;治疗后,与对照组比较,观察组患者BI评分显著升高,DHI评分显著降低,两组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 注射用丹参多酚酸在治疗以头晕/眩晕为首发症状的急性脑梗死能够有效提高患者生活能力,改善头晕/眩晕效果更加显著,值得临床推广和应用。     

LC-MS/MS测定酒石酸溴莫尼定中苯胺类基因毒性杂质

目的 建立LC-MS/MS方法测定酒石酸溴莫尼定中苯胺类基因毒性杂质（6-氨基喹喔啉、4-硝基邻苯二胺、6-氨基-5-溴喹喔啉）的含量。方法 采用色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C₁₈（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流动相为0.1%乙酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，流速0.35 mL·min^-1，柱温为35℃；采用Shimadzu LC30 UPLC-AB Science 4000+三重四极杆液质联用仪和多反应离子监测模式二级质谱MS/MS（ESI）源检测，正离子模式采集数据。结果 6-氨基喹喔啉、4-硝基邻苯二胺、6-氨基-5-溴喹喔啉分别在9.98~199.50，9.94~198.74，10.03~200.55 ng·mL^-1内线性关系良好；低、中、高浓度（50，100，150 ng·mL^-1）回收率为94.8%~110.8%，RSD均<4.2%；溶液在12 h内稳定性良好。结论 本方法操作简便，结果可靠，可以用于酒石酸溴莫尼定中苯胺类基因毒性杂质（6-氨基喹喔啉、4-硝基邻苯二胺、6-氨基-5-溴喹喔啉）的控制。