小鼠抗KLH多克隆抗体的制备及TDAR实验间接ELISA定量检测方法的建立北大核心CSCD

目的:通过制备小鼠抗KLH多克隆抗体,优化反应条件建立KLH特异性抗体ELISA定量分析方法,以期提供一种特异性好、灵敏度高及误差低的TDAR实验检测方法。方法:利用盐析沉淀和亲和层析纯化技术分离和纯化小鼠抗KLH特异性多克隆IgG抗体;以纯化后的抗体作为标准品,建立TDAR实验间接ELISA定量检测方法,并对该方法进行线性范围、特异性、变异系数(CV)及检测限验证。结果:以KLH包被浓度为80μg/ml,山羊抗小鼠IgG/HRP酶标二抗的稀释倍率为1∶20000条件进行间接ELISA定量分析的方法学验证,检测线性范围为390.63~25000 ng/ml,R^(2)=0.9848,线性良好;批内和批间CV均<10%;检测限为194.83 ng/ml。结论:通过制备抗KLH多克隆抗体,并优化实验反应条件来建立间接ELISA定量分析方法,其线性范围、特异性及批内、批间CV均满足实验要求,是一种高灵敏度的TDAR实验检测方法。     

hK6单克隆抗体制备及在胃和乳房肿瘤组织中的初步应用

目的:原核表达人组织激肽释放酶6(human kallikrein 6,hK6),采用杂交瘤技术制备其单克隆抗体,建立免疫组织化学方法,检测hK6在胃癌、乳腺癌组织中的表达情况.方法:通过原核表达hK6融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备特异性单克隆抗体,并用间接ELISA、SDS-PAGE及Western-blot鉴定抗体,protein A agarose亲和层析柱纯化抗体,并以此抗体建立免疫组织化学方法检测人胃癌、乳腺癌组织中hK6表达情况.结果:成功筛选出4株高分泌型特异性杂交瘤细胞株,其制备抗体可与hK6融合蛋白发生特异性结合;免疫组织学显示,hK6主要分布在胃癌细胞胞浆中,成阳性表达,而在癌旁胃黏膜中成阴性表达;在乳腺癌组织中定位于胞浆,成弱阳性表达,癌旁组织成阴性表达.结论:成功制备了高纯度、特异性的抗hK6单克隆抗体;该抗体为深入研究hK6功能和建立高特异性、高敏感性检测组织和体液中hK6的方法奠定基础.     

巢式PCR检测日本血吸虫感染的研究

本研究通过设计2对巢式引物扩增日本血吸虫高拷贝的Sjα1基因片段,建立检测日本血吸虫感染的巢式PCR技术,并对感染小鼠血清、全血样本以及实验和现场钉螺样本进行检测.建立的巢式PCR方法特异性扩增日本血吸虫420 bp的Sjα1片段,和曼氏血吸虫没有交叉,基因组DNA作为模板时最低检测量为0.1fg.小鼠感染日本血吸虫后2周的血清样本中即能检测出特异性DNA,建立的方法能同时检测血清和全血标本.钉螺实验感染4 h后能检测到日本血吸虫DNA,现场采集钉螺的检测结果显示比传统的镜检方法敏感性高.建立的巢式PCR检测日本血吸虫感染具有较高的敏感性和特异性,为疾病诊断和媒介调查提供了新的分子生物学检测技术. PCR技术,并对感染小鼠血清、全血样本以及实验和现场钉螺样本进行检测.建立的巢式PCR方法特异性扩增日本血吸虫420 bp的sja1片段,和曼氏血吸虫没有交叉,基因组DNA作为模板时最低检测量为0.1fg.小鼠感染日本血吸虫后2周的血清样本中即能检测出特异性DNA,建立的方法能同时检测血清和全血标本.钉螺实验感染4 h后能检测到日本血吸虫DNA,现场采集钉螺的检测结果显示比传统的镜检方法敏感性高.建立的巢式PCR检 日本血吸虫感染具有较高的敏感性和特异性,为疾病诊断和媒介调查提供了新的分子     

新型冠状病毒抗原检测双抗体夹心ELISA方法的建立

目的:探索即时、快速、准确的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原检测方法,提高新型冠状病毒感染者检出率,并建立2019-nCoV的S蛋白特异性检测方法。方法:本研究利用ELISA方法对前期研发的2019-nCoV基因工程单克隆抗体(mAb)进行配对检测,从中挑选出最优检测抗体组合,建立了新型冠状病毒抗原检测双抗体夹心...     

一种快速检测人腺病毒的免疫层析分析方法的建立

目的:建立一种基于免疫层析法(Immunochromatographic assay, ICA)的快速简便的人腺病毒(Human adenoviruses,HAdVs)检测方法。方法:利用抗原结合和病毒斑点实验检测发现单克隆抗体3C11和7E6能特异性结合所有测试的人腺病毒,以这两个抗体建立ICA方法。使用培养病毒及1...     

哮喘特异性免疫治疗诱导的卵蛋白致敏小鼠模型T细胞无能机制的探讨

目的:建立哮喘特异性免疫治疗小鼠模型,探讨特异性免疫治疗诱导T细胞无能的机制。方法:通过卵蛋白(OVA)皮下注射致敏,雾化吸入激发的方法,建立哮喘特异性免疫治疗的小鼠模型,并通过对肺组织病理切片及支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞计数及分类,用ELISA法检测血清OVA特异性IgE(sIgE)及脾脏T细胞IL2和IL4的分泌等证实。分离培养脾脏T细胞,用3HTdR掺入法检测其增殖反应;用流式细胞仪(FACS)检测其表面CTLA4分子的表达。结果:与对照组小鼠相比较,哮喘特异性免疫治疗后,小鼠肺组织的炎症病理变化减轻;BALF中嗜酸性粒细胞(EOS)数、血清sIgE的水平、T细胞分泌IL2和IL4的水平以及小鼠对OVA刺激的反应性均显著降低(P<0.01);但T细胞表面CTLA4分子的表达明显上调。结论:建立了哮喘特异性免疫治疗的小鼠模型。T细胞表面CTLA4分子表达的上调可能是哮喘特异性免疫治疗诱导T细胞无能的机制之一。     

杜克雷嗜血杆菌血红蛋白受体和其部分蛋白片段的表达纯化及其多克隆抗体建立ELISA检测杜克雷嗜血杆菌的初步研究

目的:制备纯化杜克雷嗜血杆菌血红蛋白受体(HgbA)及其部分蛋白片段(HgbAF),免疫家兔获得rHgbA和rHgbAF特异性多克隆抗体,用于临床软下疳病原学诊断.方法:采用分子生物学技术克隆HgbA和HgbAF基因,诱导表达并纯化rHgbA和rHgbAF;用rHgbA和rHgbAF免疫家兔制备多克隆抗体,采用Western blot和ELISA方法测定抗体免疫活性;建立杜克雷嗜血杆菌HgbA双抗体夹心ELISA检测系统,对其敏感性、特异性进行初步评价.结果:成功克隆了目的基因,经诱导表达获得纯化杜克雷嗜血杆菌rHgbA及其部分重组蛋白片段;免疫家兔获得rHgbA和rHgbAF特异性抗血清,经饱和硫酸氨盐析后,Western blot实验结果显示其能与rHgbA和rHgbAF特异性结合;建立的杜克雷嗜血杆菌HgbA双抗体夹心ELISA,对杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌及其他7种生殖器溃疡相关的细菌进行检测,发现除杜克雷嗜血杆菌呈现强阳性反应外,其余8种菌均为阴性结果,无交叉反应发生;上述ELISA检测纯化rHgbA灵敏度为1.56 ng/ml,杜克雷嗜血杆菌检测灵敏度为2×105 cfu/ml,脓汁模拟样本中杜克雷嗜血杆菌检测的灵敏度为1×106 cfu/ml.结论:成功制备了杜克雷嗜血杆菌血红蛋白受体及其部分蛋白片段,免疫家兔所获得的多克隆抗体能与杜克雷嗜血杆菌特异性结合,而与流感嗜血杆菌及其他7种生殖器溃疡相关的细菌无交叉反应,表明建立的ELISA具有较好的特异性.上述ELISA检测方法的敏感性水平不能满足临床所有标本中杜克雷嗜血杆菌的检测,有待于进一步提高,但该方法的建立具有潜在临床应用价值.     

基于HSV-1型特异性表位的血清抗体ELISA检测方法建立与初步应用评价

目的建立并评价HSV-1型特异性抗体鉴别诊断的ELISA方法。方法以HSV-1-gG112-127型特异性表位的串联重组表达蛋白作为包被抗原,建立检测血清HSV．1特异性IgG的间接ELISA方法。同时以免疫印迹检测作为“金标准”,评价检测方法的真实性和可靠性。结果采用棋盘法确定了包被抗原、抗体的最佳浓度,建立ELISA检测方法。血清特异性IgG检测的灵敏度为91％,特异度为97．6％,阳性预测值为97％,阴性预测值为93％,符合率为94．5％,试验的一致率为98％。结论用串联重组蛋白作为包被抗原对HSV-1感染的血清进行ELISA分型检测,其特异性好。     

抗铜绿假单胞菌外膜蛋白F单克隆抗体制备及夹心ELISA检测方法的建立

目的:制备抗铜绿假单胞菌外膜蛋白F(OprF)的单克隆抗体(mAb),并建立双mAb夹心ELISA检测方法。方法:利用分子生物学方法克隆OprF基因,诱导表达并纯化OprF。用OprF免疫BALB/c小鼠后通过杂交瘤技术制备特异性的mAb,并用ELISA法测定mAb的免疫活性;建立检测铜绿假单胞菌的双mAb夹心ELISA方法,并对其敏感性、特异性进行初步评价。结果:成功地克隆OprF基因,经诱导表达获得铜绿假单胞菌的OprF。通过杂交瘤技术筛选出4株mAb:6D8F7、2H2B6、3C2F5和7B5D9,经鉴定mAb 6D8F7可作为捕获抗体,mAb 7B5D9被HRP标记后可作为检测抗体,以这2株mAb建立的双mAb夹心ELISA方法重复性好、特异性强,敏感性高达到1×103集落形成单位(CFU/mL)。检测的线性范围为1×103～108CFU/mL。与传统的细菌分离方法比较,检测临床标本的符合率高达94.7%。结论:通过杂交瘤技术制备抗铜绿假单胞菌OprF的mAb,并建立了高特异性、高敏感性检测铜绿假单胞菌抗原的双mAb夹心ELISA方法,可用于临床检测铜绿假单胞菌的感染。     

基于量子点及免疫磁珠技术快速检测弓形虫抗体的实验研究

目的 应用量子点及免疫磁珠技术,建立一种简便、快速的弓形虫IgG抗体检测方法.方法 采用碳二亚胺交联法,将弓形虫抗原包被住磁性微球表面作为固相载体,量子点标记二抗作为检测抗体.检测待检血清中的弓形虫特异性抗体,并对检测条件进行优化.结果 量子点与二抗的最佳偶联条件:pH6.0、反应时间为2 h、二抗浓度为20 μg/mL.确立检测的最佳反应条件:抗原包被浓度50μg/mL,量子点标记二抗工作浓度为1:200.用本方法检测弓形虫抗体阳件血清的最大稀释度为1:1 000,而EHSA为1:500.结论 成功建立了弓形虫IgG抗体快速检测方法,该方法具有较好的特异性和灵敏度,且操作简便快速.     

一种新型冠状病毒荧光定量PCR快速检测方法的应用评价

目的:建立并评价一种基于COYOTE ? Flash20实时荧光定量PCR仪用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸快速检测的方法。 方法:通过使用靶向SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的特异性引物探针组构建快速反应体系,并验证体系的灵敏度和特异性。同时,使用108例新型冠状病毒肺炎(...     

基于荧光微球的病毒性出血热IgM抗体检测方法的建立

目的 建立并初步评价多元检测引起病毒性出血热病原体特异性IgM抗体的方法.方法 在原核细胞中重组表达纯化马尔堡病毒、拉沙热病毒、裂谷热病毒、肺综合征出血热汉坦病毒、汉滩病毒、Seoul病毒及普马拉病毒核蛋白(NP),共价偶联到7种不同的xMAP荧光微球上.优化评价偶联效果,通过参比血清中相应病毒NP特异性抗体检测,评估检测方法,并与常规使用的MacELISA方法进行比较.结果 在Luminex平台的基础上建立了多元检测引起病毒性出血热的病毒核蛋白特异性抗体的方法,特异性与敏感性与常规应用的特异性抗体检测MacELISA试剂盒相当,但可以同时排查多个病毒感染情况.结论 利用Luminex xMAP技术建立基于病毒核蛋白多元检测方法快速敏感,操作简单,可以用于病毒性出血热的检测和血清流行病学调查.     

结核分枝杆菌三种特异性抗体ELISA检测方法的建立

目的 建立以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法。方法 利用本室构建并纯化的结核分枝杆菌特异性抗原蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68,建立结核分枝杆菌特异性抗体检测的间接ELISA检测方法：ESAT6-ELISA、CFP10-ESAT6-ELISA、ESAT6-PPE68-ELISA。并与PPD-ELISA同时检测220例结核病人血清、30例非结核呼吸疾病病人血清和50例健康人群血清,分别对三种方法的敏感性与特异性进行统计学分析。结果 ESAT6-ELISA的敏感性为25%,特异性为95%;CFP10-ESAT6-ELISA的敏感性为45%,特异性为93%;ESAT6-PPE68-ELISA的敏感性为48%,特异性为85%。结论 三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的敏感性均低于PPD-ELISA,但三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的特异性均高于PPD-ELISA,其中CFP10-ESAT6-ELISA检测的效果最佳,PPE68可作为结核特异性诊断的候选抗原。     

一种新型通用引物多重PCR技术可特异性检测Y染色体序列标签位点

目的:建立通用引物多重PCR(UP-M-PCR)技术,检测Y染色体微缺失。方法:选取50例健康男性,针对Y染色体AZFa,AZFb,AZFc和AZFd区15个标签位点(STS),选择15对特异性引物和1对UP,将UP加在特异性引物对的5’端,按扩增片段大小组建4组稳定可靠的UP-M-PCR体系,分析其扩增效率和特异性。结果:UP引入M-PCR对检测体系无影响。UP-M-PCR可特异性扩增AZF区15个STS,且较M-PCR特异性更好,条带更清晰。结论:UP-M-PCR体系较M-PCR操作方便,扩增效率均衡,特异性高,是男性不育患者Y染色体微缺失筛查的新方法。     

云南省蚊媒病毒分离物的初步鉴定

本研究对前期从云南蚊虫获得的病毒分离物作进一步鉴定,以明确其分类地位。采用甲病毒通用引物进行RT－PCR检测,在5株病毒分离物扩增出目的基因片段。新分离株4株来自三带喙库蚊,1株来自中华按蚊。它们可使白蚊伊蚊细胞（C6／36）、猴肾细胞（Vero）及金黄地鼠肾细胞（BHK－21）发生规律性细胞病变。核苷酸序列分析显示5株病毒与盖塔病毒（ Getah virus, GETV）同源性最高,与GETV中国云南YN0540株、河北株 HB0234、海南株 M1及南韩株、 LEIV MPR 株、鹭山病毒的同源性为96．4％～99．2％,5株病毒之间的同源性为98．4％～100％。系统进化分析结果显示,新分离株与上述GETV处于同一进化分支。以上结果证实5株病毒分离物为盖塔病毒。     

6种虫媒病毒蛋白芯片检测方法的建立

目的 建立针对6种虫媒病毒的蛋白芯片检测方法,用以检测流行性乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、登革病毒(1～4型)、西尼罗病毒、西部马脑炎病毒和东部马脑炎病毒的特异性抗体.方法 将病毒特异性抗原作为捕获抗原点样制备蛋白芯片,利用双抗夹心ELISA原理检测血清中的病毒特异性抗体.首先利用免疫兔血清进行特异性诊断抗原的筛选,并对抗体芯片检测条件进行优化,然后采用56份临床疑似的阳性血清标本及阴性对照标本对该方法进行验证,并与常规ELISA方法进行比对.结果 共筛选出11个特异性较好的重组诊断抗原.抗原点样浓度在0.125 ～0.900mg/ml时可获得良好的检测效果,血清检测范围为1:100～1:1000.对26份临床疑似的蜱传脑炎病毒血清标本,22份登革病毒血清标本及8份流行性乙型脑炎病毒临床血清标本的检测结果为:共检测出蜱传脑炎病毒IgG阳性血清标本20份,阳性检出率为76.9％,IgM阳性血清标本17份,阳性检出率65.3％,与ELISA检测符合率分别为96.1％和84.6％.乙型脑炎病毒IgG阳性血清4份,阳性检出率50.0％,IgM阳性血清5份,阳性检测率62.0％,与ELISA检测符合率分别为87.5％和100％.登革病毒IgG阳性血清标本13份,阳性检出率63.6％,IgM阳性血清标本14份,阳性检测率68.1％,与ELISA检测符合率分别为86.3％和90.1％,结果经一致性Kappa检验后,与ELISA检测结果一致性良好.阴性对照血清结果显示检测特异性为100％.结论 本研究建立的虫媒病毒抗体芯片检测方法具有较高的特异性和可靠性,可用于6种虫媒病毒抗体的临床检测.     

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、普通变形杆菌和副溶血弧菌多重PCR检测体系的构建

目的:建立一个多重PCR体系,能够快速、准确地检测出食品中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、普通变形杆菌、副溶血弧菌4种食源性致病菌。方法:针对4种致病菌的特异基因设计特异性引物,建立多重PCR反应体系,并对反应体系进行了优化。结果:利用所建立的反应体系对人工染菌的海产品进行目标菌检测,该体系能同时扩增出4种目标基因片段,具有良好的特异性,对4种目标菌的检测灵敏度可达到103CFU/ml。结论:本研究建立的多重PCR体系能够快速、准确地检测食品中的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、普通变形杆菌和副溶血性弧菌,具有较好的实用性。     

抗ssDNA单克隆抗体的研制和在检测凋亡细胞中的应用

为了制备抗单链DNA单克隆抗体和建立检测细胞凋亡的新方法 ,采用杂交瘤细胞融合技术用于筛选分泌抗单链DNA抗体的单克隆杂交瘤细胞株 ,并用斑点印迹和竞争ELISA法鉴定单抗的特异性 ,进而结合免疫组织化学和免疫荧光方法用于检测凋亡细胞。通过筛选得到单克隆杂交瘤细胞株B17,其分泌的抗体与单链DNA结合而与双链DNA无交叉反应 ,用此单抗建立的凋亡细胞检测方法能够检测出凋亡细胞 ,区分非凋亡细胞和坏死细胞。实验结果表明 ,成功地获得一株分泌特异性抗单链DNA抗体的单克隆杂交瘤细胞株 ,以此建立的凋亡细胞检测方法特异性高、敏感性强     

建立基于核蛋白双抗体夹心ELISA的发热伴血小板减少综合征病毒滴定方法

目的 建立基于核蛋白双抗体夹心ELISA滴定发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的方法.方法 首先利用SFTSV核蛋白特异性多克隆和单克隆抗体建立双抗体夹心ELISA方法,用于SFTSV病毒滴度的检测,优化检测程序,评价检测方法的特异性与灵敏性,并与免疫荧光法和空斑试验法检测SFTSV滴度的方法进行比较.结果 所建立的基于双抗体夹心ELISA法滴定病毒与免疫荧光法和空斑试验法的滴定结果一致,相关系数分别为0.999和0.949.结论 基于SFTSV核蛋白双抗体夹心ELISA的滴定方法具有较高敏感性和特异性,操作简单,避免直接免疫荧光和空斑法滴定结果判定的主观性,并可适用于高通量检测.