低氧刺激结缔组织生长因子表达与肾间质纤维化

目的：观察低氧对结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响，探讨低氧致肾间质纤维化的机制。方法： 单侧输尿管结扎（UUO）9 d大鼠动物模型，用RT-PCR方法检测肾组织中低氧标记分子-低氧诱导因子（HIF-1α）的mRNA水平，免疫组化方法观察假手术组及模型组肾组织中HIF-1α和CTGF的表达及部位，Western蛋白印迹技术检测肾组织CTGF的蛋白水平。体外实验，正常大鼠肾间质成纤维细胞（NRK-49F）分别置于低氧（1%O2）和正常氧条件下培养6 h，应用RT-PCR和Western蛋白印迹检测CTGF mRNA和蛋白表达水平。结果： 对照组肾组织未能检测到HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表达；模型组肾组织有高水平HIF-1α mRNA，并出现HIF-1α蛋白表达，主要分布在小管-间质细胞；CTGF蛋白与HIF-1α蛋白表达部位及程度一致；低氧（1% O2）培养刺激NRK-49F细胞表达CTGF mRNA和蛋白。结论： 低氧刺激的CTGF的表达增加与肾间质纤维化的发生有关。     

低氧诱导因子1在低氧致肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的: 探讨低氧对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和凋亡的影响,以及HIF-1α、P-ERK1/2、iNOS蛋白表达变化在其中的作用与意义。方法: 体外培养大鼠PASMC，设计常氧组、低氧组及ADM、L-NAME、PD98059干预组，用MTT比色法和PCNA的免疫组化法测定细胞增殖反应，用流式细胞仪检测细胞凋亡，用Western blotting法检测HIF-1α、P-ERK1/2、iNOS的蛋白表达。结果: （1）低氧24 h组的A值明显高于常氧组(P<0.01)，而PD98059及ADM干预组明显低于低氧组(P<0.01)， L-NAME干预组明显高于低氧组和常氧组(P<0.01)。（2）免疫组化表明，低氧24 h组呈阳性表达(P<0.01)。PD98059、ADM抑制了PCNA的表达(P<0.01)， L-NAME促进了PCNA的表达(P<0.01)。（3）各组在低氧培养24 h后，凋亡指数差异无显著(均P＞0.05)。（4）Western blotting表明常氧组少量HIF-1α、iNOS、 P-ERK1/2表达，低氧4 h后均表达增高(P<0.01),8 h仍维持在高峰(P<0.01)，而HIF-1α、P-ERK1/2在低氧24 h后表达下调。L-NAME促进了HIF-1α表达(P<0.01),PD98059部分抑制了HIF-1α、iNOS及P-ERK1/2表达(P<0.01)；ADM部分抑制了HIF-1α表达，促进iNOS表达(P<0.01)。结论: 低氧能促进肺动脉平滑肌细胞增殖，对细胞的凋亡无影响；HIF-1在低氧诱导肺动脉平滑肌细胞增殖中起重要作用。     

低氧诱导大鼠肺泡巨噬细胞产生TNF-α的机制

目的：研究低氧诱导肺泡巨噬细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达及HIF-1α对肺泡巨噬细胞产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。方法：应用HIF-1α诱骗法(HIF-1α decoy)抑制低氧(3％O2，5％CO2，92％N2)培养的肺泡巨噬细胞中HIF-1α的作用，并用免疫组织化学、Western blot、半定量RT-PCR、酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测HIF-1α蛋白、mRNA的表达和TNF-α的产生。结果：HIF-1α在常氧对照组肺泡巨噬细胞核中表达呈阴性，在低氧组和HIF-1α decoy组表达呈阳性；低氧组和HIF-1α decoy组中HIF-1α蛋白的含量显著高于常氧对照组(P<0.05)。HIF-1α mRNA的含量在低氧组和HIF-1α decoy组明显高于常氧对照组(P<0.05)；培养的巨噬细胞上清液中TNF-α的含量在低氧组(115±17 ng／L)明显高于常氧对照组(69±13 ng／L，P<0.05)和HIF-1α decoy组(81±15 ng／L，P<0.05)。结论： 低氧可明显诱导肺泡巨噬细胞HIF-1α的表达和活性增强，后者能促进TNF-α的产生，提示在可导致肺部低氧的炎症性疾病如COPD中HIF-1α可能发挥重要作用。     

低氧诱导因子1α诱导卵巢癌细胞周期阻滞的研究

目的：探讨低氧诱导因子1α（HIF-1α）对卵巢癌细胞周期的阻滞作用。方法: 采用化学性低氧诱导剂氯化钴（CoCl2）和物理性低氧培养箱两种方法对体外培养的卵巢癌SW626细胞诱导低氧，用诱骗法（decoy）阻断HIF-1α功能，Western blotting、RT-PCR和流式细胞术分别检测HIF-1α蛋白、mRNA的表达水平和细胞周期比率。结果： B1组(3.75±1.31)和C1组(3.48±1.01) HIF-1α蛋白表达水平明显高于A1组(0.97±0.31)（P<0.05), decoy法对HIF-1α蛋白表达没有明显影响(P>0.05)；A1组（0.65±0.32）和B1组（0.64±0.34）HIF-1α mRNA表达水平明显低于C1组（1.28±0.62）（P<0.05），decoy法对HIF-1α mRNA 表达没有明显影响（P>0.05）；流式细胞术检测发现B1组（81.78±24.33）和C1组（77.62±22.76）G0/G1期细胞比率显著高于A1组（49.49±18.54）（P<0.05）；B2组（61.54±20.84）明显低于B1组（P<0.05），C2组明显低于C1组（56.03±21.42），而A1组和A2组之间无明显差异（P>0.05）。结论：CoCl2或物理性低氧均能明显诱导卵巢癌细胞SW626 G0/G1期细胞周期阻滞和HIF-1α的表达，HIF-1α在低氧引起的卵巢癌细胞SW626的细胞周期阻滞中起重要作用。     

脂多糖活化的大鼠肺泡巨噬细胞TNF-α产生的新机制

目的：探讨脂多糖（LPS）活化的肺泡巨噬细胞中低氧诱导因子－1α（HIF-1α）的表达及其在肺泡巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α（TNF-α）中的作用。 方法： 应用HIF-1α 诱骗法（HIF-1α decoy）抑制其作用，并用Western blotting、半定量RT-PCR、酶联免疫吸附法（ELISA）分别检测HIF-1α蛋白、mRNA的表达和TNF-α的产生。 结果： HIF-1α蛋白含量在LPS组（1.95±0.57）和HIF-1α decoy组（1.89±0.59）均明显高于对照组（0.41±0.14，P＜0.05）；HIF-1α mRNA的表达在对照组（0.7838±0.3183）、LPS组（0.7622±0.3387）和HIF-1α decoy组（0.8155±0.3594）之间无显著差异（P>0.05）；LPS刺激24 h后，大鼠肺泡巨噬细胞TNF-α的产生明显高于对照组（61 ng/L vs 156 ng/L, P<0.05），抑制HIF-1α后TNF-α的产生明显低于LPS刺激组（90 ng/L vs 156 ng/L, P<0.05），但 HIF-1α decoy组TNF-α的产生仍然高于对照组（61 ng/L vs 94 ng/L, P<0.05）。 结论： 大鼠肺泡巨噬细胞在LPS的刺激下HIF-1α蛋白的稳定性增强使其表达明显上调，并且促进TNF-α的产生，提示HIF-1α在肺部慢性炎症性疾病如COPD的发病机制中可能有重要作用。     

低氧及一氧化氮对SW480细胞缺氧诱导因子-1α、VEGF及iNOS 表达的初步研究

目的：观察一氧化氮(NO)对低氧培养的人结肠腺癌细胞株SW480中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。方法： 运用免疫细胞化学检测HIF-1α、VEGF、iNOS蛋白表达，Western blot检测HIF-1α蛋白表达。原位杂交法检测HIF-1α mRNA表达。结果： 免疫细胞化学染色图像分析结果显示：低氧组细胞HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白表达水平显著高于常氧组(P<0.01，P<0.01，P<0.05)和低氧＋genistein（三羟基异黄酮）组（P<0.01，P<0.05，P<0.05）。低氧条件下，SNP（硝普钠）显著抑制HIF-1α、VEGF蛋白的表达,但对iNOS表达无明显影响；NOC5（NO发生剂）诱导HIF-1α、VEGF、iNOS蛋白的表达；NO抑制剂L-NAME(N-硝基精氨酸甲酯)则抑制3者的表达。 Western blot结果显示：低氧培养条件下，HIF-1α呈强表达，给予genistein能显著抑制其表达；而给予SNP和L-NAME后，蛋白表达量减少，给予NOC5，则蛋白表达增强。原位杂交结果显示：常氧组、低氧组及低氧＋genistein组、低氧＋SNP组、低氧＋NOC5组、低氧＋L-NAME组HIF-1α mRNA表达A值组间均无显著差异。结论： 低氧诱导SW480细胞HIF-1α蛋白表达量增高，从而上调VEGF和iNOS表达。低氧条件下，NO供体SNP抑制SW480细胞HIF-1α蛋白及VEGF表达，而另一种供体NOC5则促进HIF-1α表达，两种供体对HIF-1表达的影响可能存在不同的机制。     

组胺和低氧对猪肺动脉和主动脉内皮细胞eNOS基因表达的影响

目的：观察组胺和低氧对培养的猪肺动脉和主动脉内皮细胞eNOS mRNA和蛋白质表达的影响。方法： 采用半定量RT-PCR和免疫细胞化学的方法。结果： （1）组胺可使肺动脉内皮细胞eNOS mRNA表达增加，在10-5mol/L作用24 h达高峰，为对照组的178.2%±7.7%(P<0.01)，eNOS蛋白质表达也上调，为对照组的173%±47%（P<0.01），主动脉内皮细胞与肺动脉内皮细胞相似，可在组胺10-6mol/L作用24h达高峰，为对照组的177.4%±14.2%（P<0.01），eNOS蛋白质表达也上调，为对照组的165%±54%（P<0.01）；（2）急性低氧12 h肺动脉内皮细胞eNOS mRNA表达增加，24 h达高峰，为对照组的151.0%±9.1%（P<0.01）；蛋白质表达水平也增高到常氧对照组的216%±44%（P<0.01），而主动脉内皮细胞eNOS mRNA与蛋白质均未受低氧影响。结论： 组胺可使肺动脉和主动脉内皮细胞eNOS表达增加，但两者反应无明显差异；低氧使肺动脉内皮细胞eNOS表达上调，而对主动脉内皮细胞无明显影响。     

前列腺素E2抑制转化生长因子-β1诱导的人胚肺成纤维细胞转分化及胶原合成

目的：研究前列腺素E₂（PGE₂）对转化生长因子-β₁（TGF-β₁） 诱导人胚肺成纤维细胞（HLF）转分化及促胶原(COL)合成作用的干预。方法： HLF 细胞生长至融合后分为 ①对照组、②TGF-β₁组、③TGF-β₁+PGE₂组、④TGF-β₁+吲哚美辛组，给予干预24 h后用细胞免疫荧光及Western blotting法观察发生转分化为肌成纤维细胞的标志蛋白 α-平滑肌动蛋白（α-SMA）的表达，用RT-PCR法检测结缔组织生长因子（CTGF）mRNA和Ⅰ型胶原（COLⅠ）mRNA的水平，用免疫细胞化学法检测CTGF蛋白表达，比色法检测培养上清中羟脯氨酸含量。结果: TGF-β₁ 可将HLF转分化为 α-SMA 阳性表达的肌成纤维细胞，PGE₂则能抑制这种转分化作用；PGE₂ 可显著减低TGF-β₁ 致肌成纤维细胞、CTGFmRNA与蛋白水平（P<0.05）和COLⅠmRNA 水平升高（P<0.05）； 吲哚美辛升高TGF-β₁ 致HLF肌成纤维细胞CTGF与COLⅠ的表达； 放线菌酮预处理肌成纤维细胞3 h后再加入TGF-β₁＋PGE₂，其COLⅠmRNA 水平明显低于TGF-β₁ 处理组水平（P<0.05）。结论: PGE₂可抑制TGF-β₁ 对成纤维细胞的转分化及促胶原合成作用, 且可通过依赖CTGF和非依赖2种方式下调COLⅠ的转录。     

低氧微环境对胎鼠成纤维细胞HIF-1α和PTEN表达及细胞周期的影响

目的探讨低氧条件下HIF-1α和PTEN在胎鼠成纤维(MEFs)细胞增殖、分化中可能的调控作用,以及低氧对细胞周期的影响。方法低氧条件(5%O_295%N_2)下培养MEFs不同时间(0、2、4、6、8h)后,应用免疫细胞化学、RT-PCR检测方法,观察MEFs中HIF-1α和PTEN的表达并检测其细胞周期。结果免疫组化结果表明,HIF-1α及PTEN蛋白的表达均随低氧时间增长而逐渐增强。RT-PCR结果显示,HIF-1αmRNA吸光度值常氧组为(0.93±0.06),低氧2～4h组达高峰分别为(1.46±0.05)和(2.30±0.05),随后开始下降;PTENmRNA吸光度值常氧组为(0.78±0.08),低氧2～6h组逐渐达到高峰分别(1.10±0.11)和(1.61±0.23),8h开始呈现下降趋势(<0.05)。流式细胞仪分析显示,随着低氧时间延长,G0/G1期细胞从(86.72±0.41)%上升至(92.41±1.10)%,低氧使MEFs细胞周期阻滞于G1/G0期。结论低氧微环境阻滞MEFs细胞周期于G0/G1期可能与PTEN和HIF-1α过表达相关。     

低氧对食管癌Eca109细胞体外迁移及侵袭的影响

 目的 探讨低氧对食管癌迁移及侵袭能力的影响及其作用机制。方法 采用CoCl2化学低氧法模拟肿瘤低氧微环境,半定量RT-PCR和免疫细胞化学分别检测不同低氧时相时食管癌Eca109细胞中低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、E-钙粘蛋白及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）mRNA及蛋白的表达。Western印迹法检测雷帕霉素联合低氧处理Eca109细胞后,HIF-1α、E-钙粘蛋白及MMP-2的变化。细胞划痕试验和Transwell实验检测雷帕霉素联合低氧对Eca109细胞迁移及侵袭能力的影响。结果 Eca109细胞在低氧状态下,HIF-1αmRNA无明显变化（P>0.05）,仅蛋白表达增多;E-钙粘蛋白的mRNA表达明显降低（P<0.05）,蛋白表达减少;MMP-2 mRNA表达明显升高（P<0.05）,蛋白表达增多。雷帕霉素在低氧状态下可显著抑制HIF-1α及MMP-2表达,促进E-钙粘蛋白高表达。经雷帕霉素处理后,Eca109细胞在低氧状态下,迁移速度减慢,侵袭穿膜细胞数减少（P<0.05）。结论 低氧使Eca109细胞中HIF-1α蛋白表达增多,后者可能通过下调E-钙粘蛋白、上调MMP-2表达促进食管癌在低氧状态下的迁移及侵袭。     

HIF-1α对食管癌Eca109细胞体内外侵袭转移的影响及其分子机制

目的:采用RNA干扰技术(RNAi)观察低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对食管癌Eca109细胞及其裸鼠移植瘤侵袭转移的影响及其作用机制。方法:CoCl2模拟肿瘤低氧微环境,分别用RT-PCR和免疫细胞化学法检测体外低氧条件下Eca109细胞中HIF-1α、E-钙黏蛋白及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)mRNA及蛋白的表达。RT-PCR检测RNAi沉默HIF-1α对E-钙黏蛋白及MMP-2 mRNA表达的影响。通过细胞划痕试验和Transwell试验检测RNAi对Eca109细胞侵袭和转移能力的影响。建立Eca109细胞裸鼠移植瘤模型,观察HIF-1α对肿瘤生长及淋巴结转移的影响;采用Western blot检测各组移植瘤中HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2的表达,分析HIF-1α在离体和在体对肿瘤生长、侵袭及转移的影响。结果:低氧诱导Eca109细胞的HIF-1α蛋白表达升高,E-钙黏蛋白的mRNA及蛋白表达降低和MMP-2 mRNA及蛋白表达升高,但对HIF-1αmRNA无明显影响。用RNAi能有效沉默HIF-1α,并可逆转低氧导致的E-钙黏蛋白及MMP-2的降低及升高,使Eca109细胞迁移速度减慢,侵袭穿膜细胞数减少(P<0.05);在体内使移植瘤生长减缓,淋巴结转移率降低(P<0.05)。结论:HIF-1α在体内外通过影响E-钙黏蛋白和MMP-2表达,来影响食管癌Eca109细胞的生长、侵袭和转移。     

不同缺氧状态对人肝癌HepG2细胞侵袭和转移能力的影响

目的: 探讨不同缺氧状态对人肝癌HepG2细胞黏附、侵袭和转移能力的影响及其可能机制。方法: 不同浓度的低氧处理对数生长期的人肝癌HepG2细胞,采用MTT法、Transwell膜侵袭系统、免疫细胞化学方法、明胶酶谱分析和反转录PCR检测变异型白细胞分化抗原CD44v6、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、低氧诱导因子(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达差异。结果: HepG2细胞经低氧处理后,细胞的基质黏附率、穿透基底膜与游走迁移的细胞数均增高,以3%氧浓度最为显著(P<0.05);3%和5%氧处理还可显著促进CD44v6的表达,增加MMP-2和MMP-9的表达,并可上调HIF-1α和VEGF。结论: 适度缺氧能增强人肝癌细胞的黏附、侵袭和转移能力,其机制可能与CD44v6、基质金属蛋白酶、HIF-1α和VEGF的表达改变有关。     

磷酸肌醇3－激酶调控缺氧诱导因子1α对大鼠缺氧性肺动脉高压的作用

目的:观察缺氧性肺动脉高压（HPH）大鼠肺组织中蛋白激酶B（AKT））和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达，探讨磷酸肌醇3-激酶（PI3K）通路与HIF-1α和VEGF的关系及其在HPH发病中的可能机制。 方法:40只成年雄性Wistar大鼠随机分成对照组、低氧3、7、14和21 d组，每组8只，测各组大鼠平均肺动脉压（mPAP）、右室肥大指数（RVHI）、血管形态学指标Western印迹检测磷酸化AKT(P-AKT)；原位杂交和免疫组化检测HIF-1α的表达。免疫组化检测P-AKT和VEGF水平。 结果:① 低氧7 d起大鼠mPAP、管壁厚度与血管外径比值及管壁面积与血管面积比值分别为(23.53 ±1.78)mmHg, (45.5±3.1)%和(54.7±3.2)%,与对照组［(16.15±1.97)mmHg、(36.8±2.5)%、(63.2±2.5)%］比较差异显著(P＜0.05),低氧14 d起稳定于高水平;低氧14 d RVHI为(26.5±2.9)%,与对照组［(22.9±2.2)%］比较差异也显著(P＜0.05)。②p-AKT蛋白在对照组表达不明显，缺氧3 d后表达上升，与对照组比较差异显著(P＜0.05)，且在缺氧3 d、7 d、14 d、21 d组肺小动脉内膜、中膜表达均为阳性。③HIF-1α蛋白对照组表达不明显，缺氧3 d、7 d、14 d、21 d组肺血管内膜均为阳性，肺血管中膜，缺氧3 d组表达开始升高（0.209±0.009），与对照组比较差异显著(P＜0.05),缺氧7 d达高峰（0.232±0.008,P＜0.05），14 d和21 d下降；HIF-1α mRNA在对照组肺动脉血管壁内表达弱阳性，缺氧3 d和7 d肺血管中表达无明显变化，与对照组比较差异无显著(P＞0.05)。缺氧14 d后表达增高(0.305±0.104, P＜0.05),并持续维持于高水平。VEGF蛋白水平在低氧7 d显著高于对照组(0.188±0.018, P<0.05),14 d达高峰(0.238±0.017, P<0.05)。相关分析表明mPAP与肺血管重塑呈正相关(r=0.983, P<0.01)。在肺小血管内膜:P-AKT与 HIF-1α蛋白呈正相关(r=0.883, P<0.01)， HIF-1α与VEGF蛋白呈正相关(r=0.897, P<0.01)。 结论:磷酸化AKT与HIF-1α和VEGF均在大鼠HPH的发病机制中发挥作用。磷酸化AKT可能通过使HIF-1α蛋白表达增加的方式上调HIF-1α，进而上调下游目标基因VEGF，导致HPH的发生和发展。     

HIF-1α和MMP-2在大鼠脑出血灶周脑组织中的表达

目的：通过动态观察脑出血灶周脑组织中缺氧诱导因子(HIF)-1α和基质金属蛋白酶(MMP)-2的表达,探讨HIF-1α和MMP-2表达之间的联系。方法：50只SD大鼠随机分成假手术组和脑出血模型组,分别于术后6 h,24 h,72 h,7 d,21 d处死大鼠。RT-PCR方法检测脑出血灶周组织HIF-1α和MMP-2 mRNA的表达及免疫组织化学方法检测HIF-1α和MMP-2蛋白的表达,并对HIF-1α和MMP-2的表达进行相关分析。结果：模型组术后灶周组织出现HIF-1α, MMP-2 mRNA表达上调和大量黄色的HIF-1α,MMP-2蛋白阳性细胞,于24~72 h达高峰。HIF-1α mRNA及其蛋白表达分别与MMP-2 mRNA及其蛋白表达呈正相关(分别r=0.588, P=0.002; r=0.765, P＜0.001)。结论：脑出血灶周脑组织中HIF-1α和MMP-2的表达上调,且HIF-1α可能调控MMP-2的表达。     

前列腺间质细胞中雌二醇对MMP-2，MMP-9及其组织抑制因子表达的影响

目的： 研究雌二醇(E2)对前列腺间质细胞中基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9）及其组织抑制因子1(TIMP-1)、TIMP-2和雌激素受体α、β（ERα、ERβ）的影响。方法： 实时定量PCR法检测E2在前列腺间质细胞中对MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA水平的影响；半定量RT-PCR法检测E2对ERα、ERβ mRNA水平的影响。酶谱电泳法检测MMP-2、MMP-9的活性。Western blotting检测E2在前列腺间质细胞中对ERα蛋白水平的影响。结果： 前列腺间质细胞中有MMP-2和ERα mRNA的表达，未检测到MMP-9 mRNA；培养液中检测到MMP-2前体（pro-MMP-2），未检测到其活性形式，也未检测到MMP-9前体及其活性形式。用E2处理间质细胞后MMP-2 mRNA水平降低，pro-MMP-2蛋白量减少，雌激素受体抑制剂ICI 182.780可抑制此作用。E2对TIMP-1,2 mRNA表达无显著影响。E2能够增加前列腺间质细胞中ERα mRNA及其蛋白表达的水平。结论： E2能够通过ERα下调前列腺间质细胞中MMP-2的表达。