霍乱弧菌NhaA基因的扩增、克隆和初步鉴定

目的 体外扩增、克隆霍乱弧菌O1群和O139群1149bp的NhaA基因片段。方法 采用PCR方法扩增NhaA基因,经限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切的用低熔点琼脂糖法回收纯化,插入pcDNA3载体的多克隆位点,构建重组体,转化大肠杆菌,并对克隆基因进行酶切鉴定。结果 分别从霍乱弧菌O1群和O139群扩增出1149bp的NhaA基因片段,所构建的重组体经酶切分析和预期结果一致。结论 成功扩增并克隆我国散发霍乱O1群和O139群NhaA基因,为研究霍乱流行规律和基因疫苗提供了重要的实验依据。     

用脉冲场凝胶电泳方法对O139霍乱弧菌分型的研究

目的：利用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术探讨O139群霍乱弧菌的分子分型方法。方法：用SfiⅠ酶和NotⅠ酶切O139群霍乱弧菌染色体DNA，经脉冲场凝胶电泳进行片段分离。结果：14株O139群霍乱弧菌经SfiⅠ酶切后电泳分离可得一个PFGE型，用NotⅠ酶切电泳可分为2个PFGE型。结论：脉冲场凝胶电泳技术分析O139群霍乱弧菌，分型发现微小差别有助于分析追踪疫情和来源。     

MPCR检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的研究

目的建立一种快速、敏感的方法,用于检测食品中O1群(EVC)、O139群霍乱弧菌和副溶血性弧菌。方法针对霍乱弧菌O139特异基因(T139)、肠毒素A亚单位基因(ctxA)、毒力协调A亚单位基因(tcpA),副溶血性弧菌热稳定性直接溶血素基因(tdh)为靶序列,建立MPCR检测方法,相应扩增片段依次为417bp、564bp、471bp和202bp。结果用该方法对EVC、O139VC、副溶血性弧菌的标准菌株和野生株,扩增片段出现极好的特异性,而35株非O1非O139群霍乱弧菌、沙门氏菌等未见扩增带。人工污染的罗非鱼、牡蛎、鱼肠和鳃混合物的检出限EVC为22cfug、O139为50cfug、副溶血性弧菌为65cfug,整个实验过程8～10h完成。结论实验结果表明MPCR是敏感、省时、省力的检测方法。     

尿液分离大肠埃希菌Ⅰ类整合子分子特征及其与耐药性的关系

目的 了解尿液分离大肠埃希菌中Ⅰ类整合子及相关基因盒的分布,分析整合子与细菌耐药性的关系.方法 选取108株临床非重复分离自尿液标本中的大肠埃希菌,经全自动细菌分析系统鉴定并检测其对临床常用抗菌药物的耐药性,聚合酶链反应(PCR)检测Ⅰ类整合酶基因,对Ⅰ类整合酶阳性菌株用PCR扩增并测序分析可变区基因盒种类及可变区启动子类型.结果 108株临床非重复分离自尿液大肠埃希菌中有60株占56.0％检测到Ⅰ类整合酶基因;共检测出5种不同长度的可变区片段:8株750 bp片段不含基因盒,2株1500 bp片段为aadA2,34株2200 bp片段为dfrA 17-aadA5,4株2500 bp片段为dfrA 12-orfF-aa dA2,2株2800 bp片段为aacA4-cmlA1,其中1株大肠埃希菌同时扩增出2200、2500 bp的可变区片段,有11株Ⅰ类整合酶基因阳性大肠埃希菌未扩增出可变区;可变区启动子大多为相对较弱的启动子PcH1、PcW;Ⅰ类整合子阳性菌株对多种抗菌药物的耐药率高于Ⅰ类整合子阴性菌株.结论 Ⅰ类整合子及相关基因盒在尿液分离大肠埃希菌中分布广泛,与细菌耐药性关系密切,所携带的整合子具有较强的捕获外源性耐药基因盒的能力.     

O139群霍乱弧菌耐药谱和相关耐药基因研究

目的:通过检测分析2004年-2007年31株O139群霍乱弧菌临床分离株对13种抗菌药物耐药情况和相关耐药基因携带情况,为O139群霍乱弧菌预防和治疗提供理论依据。方法:K-B纸片扩散法药物敏感实验检测细菌13种抗菌药物耐药情况,用常规PCR方法扩增TEM、aadA2、strA、strB、tetA、floR和sul1等7种耐药基因和1型耐药整合子。结果:药物敏感实验表明31株O139群霍乱弧菌临床分离株只存在一种耐药谱型,对头孢噻肟、头孢吡肟、环丙沙星和氟哌酸敏感,对氨苄西林、羧苄西林、氯霉素、复方新诺明、四环素、强力霉素、庆大霉素、卡那霉素和链霉素耐药,均扩增出TEM、aadA2、strA、strB、floR和sul1耐药基因和1型耐药整合子结构。结论:O139群霍乱弧菌已对多种抗生素耐药并存在相关耐药基因,应引起临床重视。     

实时聚合酶链反应检测O1群和O139群霍乱弧菌方法的建立及应用

目的建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应（RT—PCR）方法并进行水体标本的检测评价。方法根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列设计引物，利用SYBRGreen染料，建立同时检测霍乱弧菌O1群和O139群的RT—PCR方法，对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度、特异性及重复性评价。采集河口水标本增菌后进行RT—PCR检测，与分离培养方法比较评价实际应用价值。结果建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重RT—PCR方法，根据扩增产物的溶解温度能有效区分O1群和O139群霍乱弧菌两种目标片段的扩增；对其他10种弧菌染色体DNA没有扩增；RT—PCR检测524份河口水体标本的增菌液，与常规分离方法相比显示了明显的灵敏性，并且所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性。结论以O1群和O139群rfb基因为目标检测片段建立的霍乱弧菌RT—PCR方法可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查。     

霍乱弧菌O1群与O139群产毒株多酶恒温快速扩增检测方法的建立

目的 建立一种霍乱弧菌O1群与O139群产毒株快速准确的检测方法。方法 基于多酶恒温快速扩增技术,根据霍乱弧菌溶血素编码基因、霍乱毒素编码基因、O1群与O139群O抗原编码基因设计引物与探针,初步建立检测方法。以不同血清型霍乱弧菌及其它细菌DNA为模板,验证检测方法的特异性与灵敏度。结果 配制反应体系时,按试剂盒说明书推荐加入量0.6μL加入探针时可成功扩增溶血素编码基因、霍乱毒素编码基因及O1群与O139群O抗原编码基因4个目的基因,针对上述4个基因分别优化探针加入量为1.0μL、1.0μL、1.0μL、0.8μL时扩增效率更高。对优化探针加入量的检测方法进行方法特异性验证时,各引物探针组合不与非目标菌DNA产生交叉反应。进行检测方法的灵敏度分析时,不同目的基因的基因组检测灵敏度为70 fg或290 fg。上述实验结果证明检测方法的灵敏度及特异性满足设计要求。结论 建立了一种霍乱弧菌O1群与O139群产毒株检测的新方法,该方法特异性强、灵敏度高、检测时间短,可适用于霍乱弧菌的常规检测及快检,对霍乱的预防具有一定的积极作用。     

武汉市霍乱弧菌中毒力相关基因及分类鉴定

目的为了解武汉地区历年收集的霍乱弧菌毒力相关基因分布情况,并对这些菌株进行分类鉴定。方法分别对霍乱弧菌中的ctxA、zot、ace、ompU、tcpA、toxR、tcpI与hlyA等基因进行PCR检测,并对所有霍乱弧菌进行PCR分类鉴定。结果分离的大部分霍乱弧菌菌株携带有所有的毒力基因,有3株细菌仅有个别非核心毒力基因扩增阳性;该PCR方法分类对O1型所有菌株都能很好地进行分类鉴别,对O139型则与血清型鉴定存在不一致情况。结论PCR方法对产毒型和非产毒型O1/O139霍乱弧菌以及O1/O139和非O1/O139霍乱弧菌鉴定效率非常好。     

O139群霍乱弧菌毒力岛区域分子特征分析

目的 比较O139群霍乱弧菌国际标准株M045和O1群E1 Tor型霍乱弧菌国际标准株N16961基因组中毒力岛区域分子特征.方法 从MO45基因组中筛选含有毒力岛上游的VC0815基因及其上游基因片段并克隆到pNEB193中命名为pNEBVC081545,绘制pNEBVC081545的限制性酶切图谱并与N16961同段序列限制性酶切图谱进行比较.在pNEBVC081545中选择VC0815基因上游的一段侧序列进行亚克隆,测序后与N16961同段序列比较.结果 pNEBVC081545限制性酶切图谱中VC0815基因上游序列图谱中第1个碱基位置是限制性内切酶位点为KpnⅠ,第732位为Sal Ⅰ,第819位为Hpa Ⅰ,第1578位为Bgl Ⅱ,第1600位为Hind Ⅱ,第1943位为Xba Ⅰ,第3247位为EcoR Ⅰ,此段序列限制性内切酶图谱与N16961同段序列限制性酶切图谱完全相同.对Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ之间的序列进行亚克隆,并对该段序列测序,测序结果表明该段核酸序列与N16961中同段序列完全相同.结论 O139霍乱弧菌可能是E1 Tor霍乱弧菌O抗原突变而产生的菌群.     

尿液分离肠杆菌科细菌整合子分子特征及其与耐药性的关系

目的 了解尿液分离肠杆菌科细菌中整合子及相关基因盒的分布,分析整合子与细菌耐药性的关系.方法 选取111株临床上非重复分离自尿液样本中的肠杆菌科细菌菌株,经全自动细菌分析系统鉴定并检测其对临床常用抗生素的耐药性,PCR检测第1,2,3类整合酶基因(int11、int12、int13),对于第1类整合酶阳性菌株用PCR扩增可变区基因盒.结果 111株临床非重复分离自尿液样本的肠杆菌中有69株(62％)检测到第1类整合酶基因,12株(11％)检测到第2类整合酶基因,未检出第3类整合酶基因.共检测出6种不同长度的可变区片段:800 bp片段不含基因盒,1500 bp片段为aadB,1800 bp片段为aadA2,2200 bp片段为aac(6')-Ib-cmlA1,3500 bp片段为aadB-catB3 - aadA1,3000 bp为dfrA32.dfrA32是首次在1株奇异变形杆菌中检测出的一种新的甲氧苄啶耐药基因.第1类整合子阳性菌株对多种抗菌药物的耐药率均高于第1类整合子阴性菌株.结论 第1类整合子及相关基因盒在肠杆菌科细菌中分布广泛,与细菌耐药性关系密切.     

多重荧光定量PCR甄别霍乱弧菌方法的建立

目的 利用多重荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异甄别霍乱弧菌的定量方法.方法 分别根据霍乱弧菌霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)和糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan-MGB探针,探针的5'端分别用FAM和VIC进行荧光标记,3'端标记MGB.优化PCR扩增体系,对多重实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性评价,同时进行一定数量临床样本考核鉴定,与常规方法进行比较.结果 该方法可准确、特异地鉴定霍乱弧菌,同时能够甄别O139群霍乱弧菌.全部的霍乱弧菌用ctxA基因对应引物和探针检测均为阳性,其中只有O139群霍乱弧菌出现LPSgt基因阳性,其他菌株均无阳性结果.检测的灵敏度为2×102 cfu/ml.同时对收集的45例临床样本进行鉴定,结果显示10例为霍乱弧菌,其中O139群有4例,其余均为阴性结果,与常规鉴定方法一致.结论 研究建立的多重荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,可有效鉴定产毒霍乱弧菌及甄别O139群霍乱弧菌,可用于霍乱监测和防制工作中的实验室诊断.     

Drug susceptibility and its genetic basis in epidemic Vibrio cholerae O1 in Vietnam

The drug susceptibility and genes responsible for the drug resistance of Vibrio cholerae O1 isolated in Vietnam in 1995, 2000 and 2002 were studied. The strains isolated in 1995 were resistant to streptomycin and harboured the class I integron which contained the aadA1 gene responsible for streptomycin resistance. The strains isolated in 2000 were devoid of a class I integron but were multiple-drug resistant and harboured SXT constin, with several drug-resistant genes. The genes responsible for streptomycin resistance were strA and strB. The strains isolated in 2002 were sensitive to all drugs examined, and the organisms were devoid of both class I integron and SXT constin. Cholera outbreaks in the three periods examined (1995, 2000 and 2002) were apparently due to different categories of V. cholerae O1.     

2005年-2010年武汉市霍乱弧菌监测分析

目的:对2005年-2010年霍乱弧菌监测中分离的25株疑似菌株进行系统鉴定。方法:分离培养、血清学试验、系统生化鉴定(VITEK32)、PCR检测其分型及毒素基因、药敏试验。结果:25株菌鉴定为霍乱弧菌的有21株,与霍乱弧菌发生交叉凝集4株;病例监测主要为O139霍乱弧菌、外环境监测主要为O1群霍乱弧菌;病例监测菌株携带霍乱弧菌毒素基因(ctxAB)、其他菌株均不携带霍乱弧菌毒素基因(ctxAB)。药敏实验结果对诺氟沙星和环丙沙星敏感,对其他抗生素有不同程度的耐药。结论:武汉市霍乱弧菌在病例监测中主要为O139群霍乱弧菌产毒株、外环境监测中主要为O1群霍乱弧菌非产毒株,不同型别菌株存在不同程度耐药性。     

运用UP-PCR技术进行食源性感染常见致病菌Hsp60基因的扩增与酶切鉴定

目的 扩增、鉴定食源性感染常见致病菌Hsp60基因。方法 选取13种食源性感染常见致病菌，采用UP-PCR法扩增其Hsp60基因，并对PCR产物进行酶切鉴定分析。结果 13种食源性感染常见致病菌均可以扩增出约1．1KB的基因片段，蜡样芽孢杆菌PCR产物经HindⅢ酶切后形成约684bp和470bp片段，小肠结肠炎耶尔森菌PCR产物经BglⅡ酶切后形成861bp和296bp片段。结论 UP-PCR技术能同时扩增出食源性感染常见致病菌Hsp60基因，为进一步进行致病菌的种属鉴定和分型研究奠定基础。     

Class I integrons and SXT elements in El Tor strains isolated before and after 1992 Vibrio cholerae O139 outbreak,Calcutta, India

We examined the distribution of class I integrons and SXT elements in Vibrio cholerae O1 El Tor strains, isolated in Calcutta, India, before and after the V. cholerae O139 outbreak in 1992. Class I integrons, with aadA1 gene cassette, were detected primarily in the pre-O139 strains; the SXT element was found mainly in the post-O139 strains.     

霍乱弧菌几肿肠毒素基因的检测研究

目的：了解我省分离的霍乱弧菌中几种主要肠毒素基因的携带情况。方法；以地高辛标记基因探针，对我省历年分离的91株霍乱弧菌（包括EVC和VC O139）作霍乱肠毒素基因探针杂交检测。结果：EVC流行株和VC O139菌株中，普遍ctxAB,Zot,Ace等毒素基因，该3种基因的携带率分别达到100％，98．86％，96．59％，而EVC非流行菌株则均不携带上述3种毒素基因。结论：提示EVC流行株和VC O139菌株具备较强的产毒能力，流行性强，应重点加强监测与研究。从ctxAB原RFLP杂交图谱分析，EVC以流行株和VC O1390在遗传特征上具相近的特点，结果均显示2条阳性杂交带。     

Comparison of amplified fragment length polymorphism and pulsed-field gel electrophoresis for subtyping of Vibrio cholerae serogroups O1 and O139

Molecular typing of Vibrio cholerae strains is a powerful tool for the surveillance of cholera. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) is considered to be a powerful subtyping technique to distinguish bacterial strains at the genetic level. Optimization and standardization of AFLP protocol is required to allow data comparisons across different laboratories in a surveillance network. Here, we performed AFLP using different restriction enzymes and primer pairs for subtyping of V. cholerae serogroups O1 and O139 and compared the optimized AFLP protocol with pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) to evaluate the applicability of AFLP for conducting epidemiological surveillance of cholera. The discriminatory index (D-value) of PFGE for serogroup O1 strains was similar when digested with NotI and SfiI, whereas that for O139 strains was higher for NotI digestion than for SfiI. EcoRI-G/MseI-T was the restriction enzyme and primer combination with highest discriminatory index used in the AFLP analysis. Capillary electrophoresis-based AFLP showed higher discriminatory power than that of polyacrylamide gel electrophoresis-based AFLP. When the two methods were compared using 72 epidemiologically unrelated serogroup O1 El Tor isolates, AFLP had a lower D-value than PFGE with NotI and SfiI digestions, respectively. For 54 epidemiologically unrelated serogroup O139 isolates, NotI PFGE had the highest discriminatory power, and SfiI PFGE and AFLP yielded almost the same but lower discriminatory power. We conclude that NotI and SfiI are both suitable for the PFGE of V. cholerae serogroup O1, whereas NotI should be defined as the primary enzyme for serogroup O139. The applicability of AFLP in V. cholerae subtyping and outbreak investigations is limited.     

8株霍乱弧菌耐药状况及RAPD同源性分析

目的分析蚌埠市2010年霍乱弧菌对抗生素的敏感性和同源性,为霍乱防控提高依据。方法选取2010年安徽省蚌埠市O1/O139群霍乱病例分离株8株,采用WHO推荐的改良Kirby—Bauer纸片法,分析霍乱弧菌对15种抗生素在体外的药物敏感性;应用随机引物扩增多态性(RAPD)技术对其作分子流行病学分型和同源性分析。结果所有O1/O139群霍乱弧菌对氨苄西林、头孢唑啉、丁胺卡那、庆大霉素、舒普生、氧哌嗪青霉素、头孢曲松、亚胺培南均100%敏感,对复方新诺明、四环素、强力霉素均100%耐药。O139群霍乱弧菌在氯霉素、诺氟沙星、环丙沙星等的敏感度上与O1群霍乱弧菌有一定的差异。根据随机扩增多态DNA聚类分析可以将检出的O1/O139群霍乱弧菌分为2个型别。结论 O139群霍乱弧菌耐药率较O1群霍乱弧菌高,应根据不同菌型选择相应的抗生素药物进行治疗。分离的O1群霍乱弧菌有同源性。     

O139群霍乱弧菌16S rRNA基因分型分析

[目的]研究北京市O139群霍乱弧菌的分子生物学特征。[方法]对北京市1998～2000年的30株O139群霍乱弧菌进行PCR霍乱肠毒素（CT）基因检测,以16SrRNA为探针对菌株DNA进行Southern杂交后对图谱进行核糖体基因（RT）分型分析。[结果]对30株霍乱弧菌RT图谱进行分析,共存在5种16SrRNA核糖体基因型,其中CT阳性的O139群霍乱弧菌为RT1型,CT阴性的O139群霍乱弧菌为RT2-RT5型。[结论]北京市不同年份的O139群霍乱弧菌CT阳性菌株核糖体基因型较为单一,CT阴性菌株基因型具有明显的多样性。提示北京市O139群霍乱弧菌CT阳性菌株和CT阴性菌株遗传发生上相距较远。     

Biotype traits and antibiotic susceptibility of Vibrio cholerae serogroup O1 before, during and after the emergence of the O139 serogroup.

Sixty-nine strains of Vibrio cholerae O1 isolated at different times were analysed to investigate if there were any differences among the O1 strains isolated before, during and after the advent of the O139 serogroup. Of the 69 O1 strains examined, 68 belonged to the Ogawa serotype while one belonged to the Inaba serotype. With the exception of one strain all other strains of V. cholerae O1 belonged to the eltor biotype. A single O1 strain isolated before the emergence of the O139 serogroup could not be classified as either eltor or classical biotype because it was resistant to both classical and eltor specific bacteriophages. Marked variations in the susceptibility to antibiotics of V. cholerae O1 isolated during the different periods were observed. In addition, strains of V. cholerae isolated after the epidemic of serogroup O139 in Calcutta showed an expanding R-type with resistance to a variety of drugs as compared to the O1 strains isolated before the advent of the O139 serogroup. From this study, it is clear that there is a substantial mobility in genetic elements of V. cholerae O1 which necessitates a continuous monitoring to keep abreast of the changing traits of the etiologic agent of cholera.