膀胱肿瘤基因瘤苗诱导肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞的实验研究

膀胱肿瘤基因瘤苗诱导肿瘤特异性细胞毒Ｔ淋巴细胞的实验研究６３００４２重庆第三军医大学大坪医院靳风烁，于茂生，惠宏襄，辛建国关键词膀胱肿瘤，基因，Ｔ淋巴细胞，细胞毒性，有丝分裂因子，淋巴细胞中国图书资料分类号Ｒ７３７．１４白细胞介素－２（ＩＬ－２）已用...     

乙肝患者HBV特异性细胞毒T淋巴细胞的分析

目的 分析急性乙肝患者外周血中HBV特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的表达特点及其在免疫应答机制中的作用.方法 采集2008年10月-2010年6月于解放军302医院就诊的40例急性乙肝患者血样进行人白细胞抗原-A2( HLA-A2)检测,对其中18例HLA-A2阳性患者取病程极期及恢复期外周血,分离单个核细胞,并以6...     

树突细胞与T淋巴细胞相互作用及其免疫调节效应

细胞免疫是机体免疫反应的重要组成部分,而树突状细胞（dendritic cell,DC）是功能最强的抗原提呈细胞（APC）,广泛存在于淋巴和非淋巴组织中。近年来研究发现,DC是免疫系统的重要调节细胞,具有广泛的生物学效应,包括激活天然免疫系统、启动更持久的适应性免疫、诱导胸腺清除自身反应性T细胞、分化调节性T细胞（regulatory T cell,Tr）,起到维持自身免疫耐受的作用。DC被认为是免疫反应的发动者,发生炎症时,最先与抗原接触激活CD4^＋ T细胞,进而引起细胞因子的分泌并诱发免疫应答反应。目前,DC与T淋巴细胞的相互作用及其免疫调节效应受到高度关注,本文拟就相关研究进展做一综述。     

活化T细胞抗原p140在肾移植患者T淋巴细胞的表达

用免疫荧光染色和流式细胞术观察P140的表达,并用移植肾穿刺活检证实排斥反应。结果表明,P140在肾移植患者淋巴细胞亚群及活化T细胞有弱表达,存在排斥反应时表达增强,提示P140为一种新的移植抗原诱导的T细胞活化分子;P140在肾移植患者排斥反应时表达增强,有可能成为特异的判别指标。     

靶向HER2的CAR T细胞构建与对膀胱癌细胞杀伤活性的探索研究

目的 制备特异性杀伤人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)表达阳性的膀胱癌细胞的嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T-Cell,CAR T）,初步探索HER2-CAR T细胞治疗膀胱癌的可行性。方法 首先免疫组化法检测膀胱癌患者石蜡组织切片中肿瘤细胞HER2表达情况,然后以赫赛汀单克隆抗体的单链抗体（single chain antibody fragment,scFv）序列作为CAR T的识别序列,构建包含铰链,共刺激分子（CD28和4-1BB胞内域）和CD3z的三代CAR T慢病毒质粒。使用293T细胞包装慢病毒,感染人源外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）细胞,制备HER2-CAR T细胞,并采用流式细胞术检测CAR的转导效率。将CAR T细胞分别与HER2表达阳性并且稳转构建表达荧光素酶的SK-BR3阳性对照细胞和MDAMB-468阴性对照细胞及T24膀胱癌细胞共培养,采用荧光素酶报告基因检测法检测杀伤...     

吞噬PUVA处理的同种异基因细胞的树突细胞对抗原特异性CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞的体外诱导作用

目的探讨吞噬体外光化学法(PUVA)处理的同种异基因淋巴细胞的树突细胞(DC)对抗原特异性CD4+ CD25 +Foxp3+调节性T细胞的体外诱导作用。方法分离LEW大鼠骨髓细胞,经大鼠重组IL-4和GM-CSF共同诱导培养制备骨髓来源的LEW大鼠DC。分离DA大鼠脾淋巴细胞(SP),制备经PUVA处理的DA大鼠脾淋巴细胞(PUVA-SP)并用流式细胞仪检测其凋亡率。在体外将DA大鼠的PUVA-SP或SP与LEW大鼠骨髓来源的DC共同培养,得到PUVA-SPDC和SPDC,以Luminex液相芯片法检测PUVA-SPDC和SPDC培养上清中IL-10、IL-12的含量。以CFSE标记PUVA-SP,流式细胞仪检测LEW大鼠DC对DA大鼠PUVA-SP的摄取情况。将LEW大鼠CD4+25-T细胞与PUVA-SPDC或SPDC混合培养5d,流式细胞仪检测诱导形成的CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞,同时分离培养体系中的CD4+ CD25+ T细胞,通过混合淋巴细胞反应(MLR)检测PUVA-SPDC诱生的CD4+ CD25+ T细胞对LEW大鼠CD4+ CD25- T细胞(效应性T细胞)体外增殖的抑制作用...     

树突状细胞诱导抗胃癌作用体外实验研究

目的 :研究负载患者自体胃癌抗原后的树突状细胞 (DC)在体外诱导的特异性细胞毒性淋巴细胞 (CTL)对胃癌细胞的杀伤效应。方法 :以组合酶消化法从胃癌手术标本中获取胃癌细胞 ,冻融制备胃癌抗原。GM -CSF、IL - 4体外诱导外周血单个核细胞 (PBMC)获得DC并负载胃癌抗原 ,继而以其刺激自体T淋巴细胞制备胃癌抗原特异性CTL ;用CytoTox 96 TM检测CTL对患者自身胃癌细胞体外杀伤效应。结果 :负载胃癌抗原DC诱导的特异性CTL对患者自身胃癌细胞的杀伤率达 88 17% ,显著高于淋巴因子激活的杀伤细胞 (LAK)细胞的杀伤率 ,P <0 0 5。且其对同种不同分化类型的胃癌细胞株MGC80 3、MNK2 8也有较高的杀伤效应 ,而对LOVO及HepG2 肿瘤细胞无显著杀伤作用 ,P<0 0 1。结论 :负载胃癌抗原的DC体外可诱导出高效而特异的抗胃癌效应 ,揭示以DC为中心的肿瘤生物治疗可望提高胃癌综合治疗水平     

自体树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞治疗转移性肾癌的疗效分析及随访观察

目的 评价自体树突细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)治疗转移性肾癌的临床疗效、免疫功能变化及随访结果.方法 采集27例转移性肾癌患者的外周血单个核细胞(PBMC),经实验室体外培养诱导产生DC和CIK细胞,经无菌检测、流式细胞术表型鉴定及细胞计数后回输给患者.于第7、9、11、13天皮下注射DC,第11、13天静脉回输CIK,每疗程间隔3个月,直至疾病进展,观察临床疗效及免疫功能的变化.结果 27例转移性肾癌患者经DC-CIK治疗后的客观反应率为37％,疾病控制率为85％,2年总生存率为81.5％.与治疗前比较,治疗后患者外周血CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+、CD3+CD19-、CD3-CD19+、CD3-CD16+CD56+、CD3+CD 16+CD56+、CD3+HLA-DR、CD3+HLA-DR+、CD3+CD28+CD8+细胞亚群及Th2细胞无显著变化(P＞0.05),Th1细胞有升高趋势(P＜0.05),多次治疗后CD3+CD4+CD25+T细胞(即调节性T细胞,Treg细胞)有降低的趋势(P＜0.05).治疗过程中27例患者均未出现明显不良反应.结论 DC-CIK细胞免疫治疗为转移性肾癌患者提供了一种新的安全有效的治疗方法,可改善转移性肾癌患者的免疫抑制状态,提高患者的抗肿瘤免疫反应,无明显不良反应.     

树突状细胞:诱导移植免疫耐受的工具细胞和靶细胞

目前,树突状细胞（dendritic cells,DC）生物学研究的热点已由诱导免疫应答转向诱导免疫耐受。经典的髓细胞样DC（mDC）及最近新发现的类浆细胞样DC（pDC）亚群的致耐受作用已经明确;DC诱导耐受的特性可能与调节性T细胞（Treg）的作用密切相关;DC细胞具有独特的获取并交叉呈递外来抗原的能力。因此,在非炎性环境中DC可以诱导抗原特异性免疫耐受。本文综述了这三方面的研究现状,并探讨了DC诱导器官移植免疫耐受的应用前景。     

HAART治疗HIV-1慢性感染儿童外周血特异性CTL的反应特点

目的 观察高效抗逆转录病毒治疗(HAART)前后人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)慢性感染儿童外周血HIV-1特异性CTL的反应特点,并分析其影响因素.方法 采集24例HIV-1 慢性感染儿童外周血并分离PBMCs,常规进行CD4 T细胞绝对数和血浆病毒载量测定.应用tetramer染色技术和ELISPOT技术分别测定HIV-1表位特异性CTL频率和IFN-γ产生细胞的数量.结果 在80%的HIV-1慢性感染儿童外周血可检测到HIV-1特异性的tetramer CTL细胞和HIV-1表位肽刺激的IFN-γ产生细胞.未经HAART治疗和HAART治疗失败的儿童,其体内CTL反应明显强于HAART治疗成功的儿童,并且这种CTL反应与HAART治疗时间呈明显的负相关.结论 HAART治疗后外围血HIV-1特异性CTL反应明显降低,持续的HIV-1抗原刺激是维持外周血HIV-1特异性CTL反应的主要因素.     

高迁移率族蛋白B1对大鼠脾脏树突状细胞表面共刺激分子表达的影响

目的观察高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对树突状细胞(dendritic cells,DC)表面共刺激分子表达的影响,并对其机制进行初步探讨。方法分离正常Wistar大鼠脾脏DC后置于96孔培养板(1×10~5/孔),采用HMGB1刺激,观察HMGB1刺激与DC表面共刺激分子CD80、CD86和主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ表达的时间-效应关系及剂量-效应关系。结果HMGB1刺激后,DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表达分别于24～72 h明显上调(P＜0．05,0．01),其中以作用48 h后DC表面共刺激分子表达上调尤为显著(P＜0．01)；0．1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的HMGB1刺激均可诱导DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表达增强(P＜0．05,0．01),其中HMGB1的浓度在1μg/ml时,大鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ的表达增强最明显(P＜0．01)。结论HMGB1能诱导DC表面共刺激分子表达增强,HMGB1可能是诱导DC成熟的免疫刺激信号。     

γ射线诱导癌细胞凋亡致敏树突状细胞后的免疫应答

目的 观察树突状细胞（DCs）从γ射线诱导的凋亡胆管癌细胞获取抗原后，抗肿瘤免疫应答及对胆管癌细胞的特异性免疫杀伤效果。方法 用粒－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）加白介素－4（IL－4）从人外周血分化、诱导DCs,γ射线在体外诱导培养的人胆管癌细胞凋亡，将DCs、T淋巴细胞和凋亡胆管癌细胞共培养，同时设计不同类型肿瘤细胞（坏死胆管癌细胞及培养胆管癌细胞）作对照，7d后，分离、富集DCs、T淋巴细胞进行免疫应答及肿瘤细胞杀伤试验。结果 与凋亡胆管癌细胞共培养之DCs可以有效提呈胆管癌细胞抗原，有强烈的免疫应答，刺激的细胞毒T淋巴细胞（CTLs)特异性地杀伤胆管癌细胞。结论 γ射线诱导癌细胞凋亡可以致敏rhGM-CSF加rhIL-4从人外周血单核细胞诱导、扩增出的DCs并产生显著的杀伤胆管癌细胞的免疫反应，可望成为特异性免疫治疗肿瘤的一条新途径。     

18F-FDG符合线路显像在食管癌术前分期中的价值

目的 探讨^18F-FDG符合线路显像在食管癌术前分期中的价值。方法 35例食管癌患者术前行^18F—FDG符合线路显像及CT检查，其中30例行手术治疗，以术后病理检查结果作为“金标准”，比较^18F—FDG符合线路显像及CT检查对原发肿瘤、淋巴结及远处转移（TNM）分期的价值；另5例发现远处转移，放弃手术治疗。结果 ^18F-FDG符合线路显像T分期与病理T分期比较符合率为63％（19／30）；^18F-FDG与CT探测淋巴结病变的灵敏度为60．00％和54．28％，特异性为94．44％和77．77％，准确性为84．80％和71．20％，阴性预测值为85．86％和81．39％，阳性预测值为80．77％和48．72％，其中特异性、准确性及阳性预测值差异有统计学意义。^18F—FDG符合线路显像发现5例远处转移，改变了其治疗方案。结论 ^18F-FDG符合线路显像对食管癌的术前分期、治疗方案的制定有临床应用价值。     

SKP2表达对受照食管癌细胞诱导辐射旁效应的影响

目的：探究SKP2表达水平对受照食管癌细胞所诱导辐射旁效应的影响。方法：Western blot法筛选出SKP2高表达和低表达的食管癌细胞系,微核检测法探讨SKP2对受照食管癌细胞所诱导辐射旁效应的影响。建立SKP2高表达和低表达的转染细胞系,Western blot法验证转染效率,微核检测法进一步验证SKP2对受照食管癌细胞所诱导辐射旁效应的影响。通过γ-H2AX聚集点检测法探究SKP2影响受照食管癌细胞所诱导辐射旁效应的作用机制。结果：微核检测结果表明,SKP2高表达的受照细胞诱导的辐射旁效应显著低于SKP2低表达的受照细胞诱导的辐射旁效应（t=8.06,P<0.01）。SKP2转染细胞系的微核检测结果进一步验证了SKP2的表达对受照食管癌细胞诱导的辐射旁效应的抑制作用,SKP2表达升高,辐射旁效应减弱（t=11.12、10.16,P<0.01）;SKP2表达降低,辐射旁效应增强（t=8.39、8.83,P<0.01）。γ-H2AX聚集点检测结果表明,受照细胞SKP2表达升高可提高旁效应细胞的DNA损伤修复能力（t=6.85、7.10,P<0.01）。反之,会抑制旁效应细胞的DNA损伤修复能力（t=7.66、8.47,P<0.01）。结论：SKP2的表达抑制受照食管癌细胞诱导的辐射旁效应,并且这一机制至少部分是通过SKP2对DNA损伤修复能力的调节来实现的。     

重组腺相关病毒介导癌胚抗原基因转染树突细胞的抗肿瘤作用研究

目的 探讨重组腺相关病毒(rAAV)介导癌胚抗原(CEA)基因转染DC对结直肠癌的治疗作用.方法 构建rAAV/CEA质粒,制备病毒.采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)来源的DC前体细胞,经rAAV/CEA转染DC后,采用PCR、Southern blot、流式细胞仪测定DC中CEA的表达,并检测rAAV/CEA的染色体整合情况及转染效率.加入GM-CSF、IL-4和TNF-α诱导DC前体细胞至成熟DC.将成熟DC和T淋巴细胞混合,加入IL-2和IL-7培养,获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL).采用体外51铬(51Cr)释放实验测定CTL对恶性肿瘤细胞的杀伤作用,3H掺入法检测rAAV/CEA转染DC对被激活T淋巴细胞增殖能力的影响.结果 rAAV成功介导了CEA基因转染DC,且在DC内高表达,超过90%的DC前体细胞表达CEA蛋白,且rAAV/CEA病毒基因成功地整合入DC基因组内.rAAV/CEA转染的DC可以诱导特异性CTL,有效地识别并杀伤CEA阳性的结直肠癌细胞株LoVo,并且具有MHC Ⅰ类限制性,而对CEA阴性的肿瘤细胞无杀伤作用.结论 以rAAV/CEA转染DC疫苗能够诱导抗肿瘤活性,为以人CEA作为靶抗原的结直肠癌的基因治疗奠定了基础.     

HBsAg致敏的树突状细胞体外抗乙型肝炎病毒的效应

目的 探讨用HBsAg致敏的树突状细胞(DCs)体外诱导自体T淋巴细胞特异性抗乙型肝炎病毒的免疫效应.方法 从乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导DCs,在DCs成熟前加入纯的HBsAg刺激,将成熟后的DCs与自身T淋巴细胞体外共培养,5天后收集T细胞,分组加入2.2.15细胞培养液中,分别收集第1、3、5和7天的培养上清液,检测其HBeAg和HBsAg的分泌情况以及其与T淋巴细胞共培养产生的IFN-γ和IL-12的含量.结果 经抗原刺激后的DCs刺激自身T淋巴细胞增殖可明显加强其细胞毒作用,同时其产生的IFN-γ和IL-12的浓度明显高于未经抗原刺激的DCs组(P＜0.05)和对照组PBMC(P＜0.01).经抗原激活的T细胞可有效地抑制HBeAg的表达,但未发现对HBsAg有明显的抑制作用.结论 体外经HBsAg刺激后的DCs激活的自身T细胞可明显地增强细胞毒作用并可提高产生IFN-γ和IL-12的含量,从而显著地抑制2.2.15细胞上清中HBeAg的表达,致敏后的DCs疫苗体外可有效地起到抗乙型肝炎病毒的效应.     

18F-氟脱氧葡萄糖PET、超声内镜及CT在食管癌术前分期中的应用

食管癌术前准确分期对治疗方案的选择及预后判断有重要意义。目前，食管癌分期方法主要有^18F-氟脱氧葡萄糖（^18F-FDG）PET、超声内镜及CT。超声内镜对食管癌T分期价值较高，三种方法对食管癌局部淋巴结的分期（N分期）各有优缺点，^18F-FDGPET对远处转移灶（M分期）的发现有明显的优势。综合运用^18F-FDGPET、超声内镜及CT可明显提高食管癌术前分期的准确性。     

FDG PET／CT代谢体积对食管癌术后预后的预测价值

目的研究食管癌患者^18F-FDG PET／CTMTV与预后的关系。方法回顾性分析2004年3月至2008年3月行^18F—FDG PET／CT检查的49例Ⅰ—Ⅳa期的食管癌患者,均经病理检查证实,随访资料完整。患者均行食管癌切除术,随访截止至2009年11月,中位随访时间为29（8～57）个月。应用Kaplan—Meier法及Cox比例风险模型分析年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤组织分化程度、PET／CT示肿瘤长径、美国肿瘤联合会（AJCC）分期、转移淋巴结个数、原发灶SUVmax及MTV与预后的关系。结果在单因素分析中,仅AJCC分期[χ^2=16．206,危险比（HR）=1．177,P〈0．001）,淋巴结分期（N）（χ^2=9．536,HR=10．833,P=0．002）,浸润深度（T）（χ^2=5．810,FIR=2．397,P=0．016）,淋巴结转移个数（χ^2=11．423,HR=1．567,P=0．001）、MTV（χ^2=3．872,HR=2．433,P=0．049）对预后存在预测作用。对以上变量行多因素分析,仅AJCC分期及MTV是独立的预后因子（r=4．525,HR=1．170,P=0．033;χ^2=4．875,HR=3．071,P=0．027）。Kaplan-Meier生存分析显示术前低MTV组比高MTV组的生存率高（Log—rank检验,χ^2=4．186,P=0．041）。结论MTV与食管癌术后患者的预后密切相关。对于高MTV患者,术后可能需要接受更加积极的治疗。     

^153Sm标记环九肽对人前列腺癌PC-3细胞的直接抑制作用

目的探讨^153Sm标记环九肽对人前列腺癌PC-3细胞生长的直接抑制作用。方法用间接法合成^153Sm-DTPA-半胱氨酰．甘氨酰-精氨酰-精氨酰-丙氨酰-甘氨酰-甘氨酰-丝氨酰一半胱氨酸[c（CGRRAGGSC）]。细胞生长抑制实验分为4组：对照（A）组100μlPBS,B组c（CGRRAGGSC）100μl（1．5mgCL）,C组153SmCl3 370kBq（100μl）,D组153Sm-DTPA-c（CGRRAGGSC）370kBq（100-）。采用四甲基偶氮唑蓝（Mrl3r）法检测不同组对人前列腺癌PC-3细胞24,48,72h的生长抑制作用;用流式细胞仪分析48h细胞凋亡及细胞周期变化;Western blot检测药物处理前及处理后48hPC-3细胞中自细胞介素11（IL11）及IL11受体（IL11R）表达。抑制率组间差异采用单因素方差分析,IL11R表达情况比较用配对t检验。结果153Sm—DTPA-c（CGRRAGGSC）标记率〉85％,放化纯〉95．8％,比活度为1．32×10^5MBq／μmol。A、B组未见细胞抑制,C、D组对细胞的抑制杀伤呈时间效应;各组药物作用48h后,通过亚G,峰检测的PC-3细胞凋亡率分别为（0．98±0．18）％,（0．35±0．10）％,（4．05±0．28）％,（13．38±0．89）％,差异有统计学意义（F=953．60,P〈0．05）。Western blot检测,B—D组IL11未见变化,IL11R表达D组比B、C组降低,干预后吸光度（A）值分别为0．339±0.014,0．338±0．019,0．226±0．015,与干预前比,B,C组差异均无统计学意义（t=0．405,1．163,P〉0．05）,D组差异有统计学意义（t=135．989,P〈0．05）。结论153Sm-DTPA—c（CGRRAGGSC）能够直接抑制PC-3细胞的生长,并促进IL11R表达下调。