重组质粒hTSHR转染低分化甲状腺癌细胞株后对摄碘能力及特异性基因表达的影响

目的 探讨重组真核表达质粒pcDNA3.1/人TSH受体（hTSHR）体外转染TSHR表达下降的低分化滤泡状甲状腺癌细胞株后,细胞摄取放射性碘功能以及甲状腺癌相关基因mRNA表达 的变化.方法 pcDNA3.1/hTSHR转化DH5a感受态菌,进行扩增、酶切,再以核苷酸测序方法鉴定.体外转染pcDNA3.1/hTSHR,通过免疫荧光检测TSHR表达产物,井型γ计数仪检测摄碘率,相对定量实时荧光PCR验证其表达的TSHR蛋白功能和特性.采用SPSS 13.0软件,对计量资料行t检验.结果pcDNA3.1/hTSHR经PCR扩增hTSHR-cDNA片段约113 kb,Kpn Ⅰ和Xha Ⅰ双酶切：hTSHR-cDNA的片段约2.3 kb,pcDNA3.1（＋）的片段约5.5 kb,均同预期片段大小相符;核苷酸测序方法鉴定测序结果与GenBank中收录的hTSHR全长序列一致,表明真核表达质粒构建正确.在hTSH刺激下,转染pcDNA3.1/hTSHR细胞与转染pcDNA3.1（＋）细胞比较：（1）在甲状腺肿瘤细胞胞质、胞膜有增强的绿色荧光,（2）前者125 I摄取率是后者的2.9倍（t=28.63,P＜0.01）,（3）甲状腺碘摄取相关基因TSHR、钠碘转运体（NIS）、甲状腺过氧化物酶（TPO）、Tg的mRNA的表达分别升高1.74倍（t=5.959,P＜0.01）、7.2倍（t=3.807,P＜0.05）、2.88倍（t=4.769,P＜0.01）和2.67倍（t=6.388,P＜0.01）.结论 pcDNA3.1/hTSHR体外转染甲状腺癌肿瘤细胞后,可有效提高碘的摄取;这可为放射性碘治疗失分化甲状腺癌提供新的实验依据.     

甲状腺癌术后^131I治疗

甲状腺癌确诊后，经典的治疗方法是近全切除术后加^131I治疗，研究表明，NIS（钠/碘同血转运体）具有聚碘能力，而TPO（甲状腺过氧化物酶）能抑制碘从细胞中流出，NIS和TPC基因联合转染肿瘤细胞介导^131I治疗有可能成为一种新的治疗方法；维加酸可诱导失分化肿瘤细胞的摄碘能力恢复或提高，也有利于^131I治疗。     

全反式维甲酸联合丁酸甘油酯诱导滤泡状甲状腺癌的实验研究

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)联合丁酸甘油酯(TB)诱导滤泡状甲状腺癌细胞株FTC-133钠/碘同向转运体(NIS)和甲状腺球蛋白(Tg)表达及其碘的摄取.方法 单独使用1 μmol/LATRA或0.1,0.25,0.5,1 mmol/L TB和联合使用该2种药物诱导FTC-133 48 h后,用实时定量PCR反应检测NIS mRNA和Tg mRNA的表达,蛋白印迹法检测NIS蛋白表达,放射免疫法检测Tg蛋白含量以及检测FTC-133诱导后摄碘变化.结果 TB可诱导FTC-133 NIS、Tg蛋白及mRNA的表达增高,并呈剂量依赖性.联合1 μmol/L ATRA及各浓度TB后较单独使用1 μmol/L ATRA及TB明显提高了FTC-133 NIS、Tg蛋白及mRNA的表达,并且增加了FTC.133对125I的摄取.结论 ATRA联合TB有效增强了FFC-133的摄碘能力,为低分化甲状腺癌的放射性碘治疗提供了一条新的研究途径.     

主要组织相容性复合物Ⅱ对Graves病发病影响的研究

目的应用主要组织相容性复合物（MHC）Ⅱ与人TSH受体（TSHR）共表达细胞（hM12细胞）模拟Graves病（GD）时的甲状腺细胞,免疫C57BL／6小鼠,诱导GD动物模型,以研究异常表达于GD患者甲状腺滤泡上皮细胞上的MHC—Ⅱ分子是否是GD的致病因素。方法试验组C57BL／6小鼠8只,用hM12细胞进行腹腔免疫,每2周1次,共6次,对照组C57BL／6小鼠5只,用M12细胞免疫,方法同试验组。受试小鼠末次免疫5周后,检测以下指标：甲状腺激素水平;甲状腺刺激性抗体（TSAb）;甲状腺组织学检查。结果C57BL／6小鼠试验组2／8小鼠诱导为Graves甲亢。C57BL／6小鼠的T细胞（MHC—Ⅱ为H-2^b）不能识别由hM12细胞（H～2^d）提呈的抗原,C57BL／6小鼠出现GD样变化可能是hM12细胞表达的TSHR被小鼠体内职业性抗原递呈细胞（APCs）获取,经加工处理提呈给T细胞,诱发自身免疫反应的结果。结论异常表达于GD患者甲状腺滤泡上皮细胞上的MHC—Ⅱ分子可能与GD的发病无关,而是一种自身免疫反应的继发现象。     

甲状腺癌术后131I治疗

甲状腺癌确诊后，经典的治疗方法是近全切除术后加131I治疗。研究表明，NIS(钠／碘同向转运体)具有聚碘能力，而TPO(甲状腺过氧化物酶)能抑制碘从细胞中流出，NIS和TPC基因联合转染肿瘤细胞介导~(131)I治疗有可能成为一种新的治疗方法；维加酸可诱导失分化肿瘤细胞的摄碘能力恢复或提高，也有利于~(131)I治疗。     

小鼠成纤维细胞诱导为诱导性多能干细胞的研究

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)由于具有无限增殖和多向分化的特性[1],因此在再生医学和药物发现与评价等领域极具应用价值[2].但是ESCs细胞在细胞来源、免疫排斥和法律等方面存在诸多限制.诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)技术的出现使人们从上述争论中解脱出来[3,4],由于iPSC在干细胞标志物表达、表观遗传学以及分化潜能方面与ESCs细胞极其相似,所以iPSC成为细胞治疗以及组织器官再生最有前景的种子细胞.笔者采用慢病毒介导的Oct4、Sox2、c - Myc和Klf4基因诱导小鼠尾部成纤维细胞(TIF)为iPSC,成功诱导并鉴定1株iPSC,为组织工程和再生医学提供了种子细胞.     

肝细胞生长因子诱导小鼠胚胎干细胞分化的实验研究

目的探讨肝细胞生长因子（HGF）诱导小鼠胚胎干细胞（ESC）体外定向分化为肝细胞的能力。方法对ESC体外悬浮培养5～7天形成的拟胚体,观察ESC自主分化、HGF诱导分化的情况。观察和检测经诱导4周的细胞的HE染色,糖原染色,尿素氮及甘油三酯合成,心肌MHC、白蛋白、AFP、CK18的表达,以及吲哚氰绿（ICG）染色情况。结果ESC自主分化难以控制。HGF可促进ESC向内胚层进一步分化,但更可能诱导其向心肌分化。表达白蛋白、AFP、CK18、ICG和FDA染色阳性。结论HGF可诱导ESC分化出肝细胞,但HGF的单一作用能力有限,提示肝细胞的诱导分化可能需要多种因素共同作用。     

5-氮胞苷联合碱性成纤维生长因子诱导人胚胎干细胞定向心肌样细胞分化的实验研究

目的探讨5-氮胞苷（5-azacytidine,5-aza）联合碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）体外诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）定向分化为心肌样细胞的可行性。方法采用小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEF）作为饲养层细胞体外培养hESCs,经悬浮培养形成拟胚体（embryoid bodies,EB）,贴壁后分为无诱导剂组（对照组）、5-aza诱导组、bFGF诱导组、5-aza+bFGF联合诱导组4组诱导培养。诱导时间为2周。倒置相差显微镜下连续动态观察细胞形态学变化,并计算各组出现自发搏动的EB,以定量聚合酶链反应检测心肌细胞特异性基因NKX2.5、GATA4、α-actin,免疫荧光法检测心肌特异性肌钙蛋白T（cardiac troponin T,cTnT）。结果EB克隆贴壁诱导3～4 d后部分细胞出现自发性节律性搏动,以5-aza+bFGF联合诱导组为著。14 d后定量聚合酶链反应检测示5-aza+bFGF联合诱导组NKX2.5、GATA4、α-actin表达显著高于其他3组（P＜0.05）。免疫荧光法示5-aza+bFGF联合诱导组cTnT的表达最为明显（P＜0.05）。结论hESCs在体外经5-aza+bFGF联合诱导后可定向心肌细胞分化,该诱导方案为心肌再生与组织工程领域的研究奠定了基础。     

去舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

目的 探讨HA-1077（fasuclil，法舒地尔）对人骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为表皮细胞的影响。方法 采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞，免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测。设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2，采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测，观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响。结果 采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs，分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞，随着时间延长，阳性率逐渐提高。7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5／8、CKl0／13、CK19阳性率均远高于诱导组（P〈0．01）。结论 HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升，Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用。     

维甲酸诱导甲状腺癌细胞摄碘的实验研究

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导甲状腺癌细胞系的钠碘同向转运体(NIS)表达及其碘摄取。方法通过ATRA诱导甲状腺癌细胞系滤泡状甲状腺癌细胞株(FIE-133)、乳头状甲状腺癌细胞株(W3)及未分化甲状腺癌细胞株(8505C)后，经逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测甲状腺癌细胞系的NIS mRNA及其蛋白质表达，并测定甲状腺癌细胞系诱导后的摄碘变化。结果ATRA诱导甲状腺癌细胞系48h后，FTG-133和W3的NIS mRNA及蛋白质表达增高，8505C未见变化；ATRA诱导甲状腺癌细胞系2周后．FTC-133和W3的摄碘增高。结论ATRA能诱导分化型甲状腺癌细胞摄碘增高，为ATRA诱导分化治疗甲状腺癌提供了依据。     

Cell death pathways in directly irradiated cells and cells exposed to medium from irradiated cells

Abstract

Purpose: The aim of this study was to compare levels of apoptosis, necrosis, mitotic cell death and senescence after treatment with both direct radiation and irradiated cell conditioned medium.

Materials and methods: Human keratinocytes (HaCaT cell line) were irradiated (0.005, 0.05 and 0.5 Gy) using a cobalt 60 teletherapy unit. For bystander experiments, the medium was harvested from donor HaCaT cells 1 hour after irradiation and transferred to recipient HaCaT cells. Clonogenic assay, apoptosis, necrosis, mitotic cell death, senescence and cell cycle analysis were measured in both directly irradiated cells and bystander cells

Results: A reduction in cell survival was observed for both directly irradiated cells and irradiated cell conditioned medium (ICCM)-treated cells. Early apoptosis and necrosis was observed predominantly after direct irradiation. An increase in the number of cells in G2/M phase was observed at 6 and 12 h which led to mitotic cell death after 72 h following direct irradiation and ICCM treatment. No senescence was observed in the HaCaT cell line following either direct irradiation or treatment with ICCM.

Conclusion: This study has shown that directly irradiated cells undergo apoptosis, necrosis and mitotic cell death whereas ICCM-treated cells predominantly undergo mitotic cell death.     

受照脑胶质瘤细胞诱导神经干细胞旁效应

目的 探讨受照脑胶质瘤细胞U251是否可通过在未受照神经干细胞（NSCs）中产生旁效应从而影响神经干细胞的增殖、干性及分化等特性。方法 将细胞分为NSCs组、NSCs+U251组（与U251共培养的NSCs）和NSCs+受照U251组（与10 Gy X射线照射后的U251共培养的NSCs）。采用插入式小室共培养U251和NSCs。通过细胞计数、测量神经球直径等方法评估NSCs增殖、成球能力的变化;采用免疫荧光实验检测Nestin蛋白的表达评估NSCs干性维持能力的变化;检测Tuj1、GFAP蛋白的表达、测量分化后神经元细胞的树突数目、轴突长度以及胶质细胞突起终端数、突起长度等评估神经干细胞分化能力的变化情况。结果 NSCs+受照U251组的细胞数量明显低于NSCs+U251组（t=2.52,P<0.05）;NSCs+受照U251组的Nestin阳性率和成球能力明显低于NSCs+U251组（t=-3.50,P<0.05）;NSCs+受照U251组向神经元和胶质细胞（t=6.09,P<0.05）分化的比例和程度也明显低于NSCs+U251组。结论 受照胶质瘤细胞可通过电离辐射旁效应显著抑制未受照神经干细胞的增殖、干性和分化能力。     

新生大鼠肌源性干细胞跨胚层分化为胰岛素分泌细胞的研究

目的探讨新生大鼠肌源性干细胞(MDSCs)在体外跨胚层转分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)的可能性。方法提取新生大鼠MDSCs原代细胞,差速贴壁培养后行Desmin免疫细胞化学鉴定。然后将细胞分为3组:胰腺提取液诱导组、化学方法诱导组、空白对照组,分别诱导并同期观察细胞的生长形态,采用双硫腙(DTZ)染色鉴定胰岛素分泌细胞,RT-PCR方法检测诱导后细胞的基因表达情况。结果获得高纯度的MDSCs,且Desmin免疫细胞化学鉴定呈阳性。胰腺提取液诱导组诱导后4d,相差显微镜下可见细胞团结构,诱导后6d呈半贴壁状态,诱导后12d形成典型的胰岛样细胞团,较化学方法诱导组诱导时间缩短3d。RT-PCR检测显示:胰腺提取液诱导组诱导6d后可检测到胰岛前体细胞相关基因Ngn3、nestin、PDX-1的表达;诱导12d后可检测到胰岛素基因的表达,但未检测到Ngn3、nestin、PDX-1的表达。结论胰腺提取液可模仿胰岛细胞发育的微环境,并诱导大鼠MDSCs跨胚层分化为胰岛素分泌细胞。     

脂肪间充质干细胞分化为肾小管上皮细胞的实验研究

目的 探讨脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMCSs)是否能分化为肾小管上皮细胞,用于急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的治疗.方法 体外分离和培养ADMSCs,用一种携带有荧光素酶和红色荧光蛋白(fluc-mrfp)报告基因的慢病毒转染ADMSCs;构建SD大鼠缺血再灌注诱导的AKI模型,将病毒转染ADMSCs直接从肾实质注射移植2×106细胞量.使用生物发光成像仪(bioluminescence imaging,BLI)示踪移植后的ADMSCs在大鼠体内的分布;免疫荧光染色法检测ADMSCs在体内的分化.结果 ADMSCs高表达CD29、CD90,不表达CD31、CD45、CD34;慢病毒转染后的ADMSCs稳定表达fluc和mrfp报告基因.体内ADMSCs移植后,BLI可以检测到荧光信号一直持续到第14天;免疫荧光结果进一步证实移植的ADMSCs可能分化为肾小管上皮细胞.结论 ADMSCs在体内可以分化为肾小管上皮细胞,为进一步研究ADMSCs治疗AKI提供实验基础.     

Stable radioresistance in ataxia-telangiectasia cells containing DNA from normal human cells

SV40-transformed ataxia-telangiectasia (AT) cells were transfected with a cosmid that contains a normal human DNA library and a selectable marker, the neo gene, which endows successfully transformed mammalian cells with resistance to the antibiotic G418. After a three-part selection protocol for G418 resistance and radioresistance, a cell line stably resistant to ionizing radiation was recovered. Cells from this line were irradiated with 50 Gy of X-rays and fused with non-transfected AT cells. Among the G418-resistant colonies recovered was one that was stably resistant to radiation. Resistance to ionizing radiation of both the primary transfectant line and its fusion derivative was intermediate between that of AT cells and normal cells, as assayed by colony-forming ability and measurement of radiation-induced G2 chromatid aberrations; both cell lines retained AT-like radioresistant DNA synthesis. These results suggest that, because radioresistance in the transfected cells was not as great as that in normal human cells, the two hallmarks of AT, radiosensitivity and radioresistant DNA synthesis, may still be the result of a single defective AT gene.     

凋亡素选择性诱导肿瘤细胞凋亡及其分子机制

来源于鸡贫血病毒的凋亡素能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡,且不依赖于ｐ５３介导,对ｂｃｌ－２过表达不敏感的特点,使其成为一种非常有前景的抗肿瘤剂。该文介绍了凋亡素诱导细胞凋亡的作用特点,并对其凋亡选择性诱导研究的分子机制进行了探讨。