人CCR5Delta32基因的克隆及其重组慢病毒载体的构建

目的:克隆人CCR5Delta32基因并构建含目的基因的重组慢病毒载体pLenti-CCR5Delta32,用于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗研究. 方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMCs)内提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序. 再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析. 结果:经PCR扩增获得约650 bp的DNA片段,测序结果与GenBank上的序列完全一致,克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO中. 结论:成功克隆了人CCR5Delta32基因并构建了含目的基因的重组慢病毒载体pLenti-CCR5Delta32,为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础.     

中华按蚊多态微卫星DNA位点的筛选和特征研究

目的:对中华按蚊多态的微卫星DNA位点进行分离和筛选,并阐明其特征.方法:应用中华按蚊基因组DNA的酶切片段与生物素标记的寡核苷酸探针杂交,亲合素富集和超滤离心浓缩目的片段,扩增放大,克隆并测序,构建中华按蚊微卫星DNA库.在其中挑选合适的微卫星位点,建立扩增体系.应用中华按蚊现场样本扩增不同的微卫星位点,聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选具有多态性的微卫星位点.结果:构建的中华按蚊微卫星DNA库中包含252条序列,GenBank注册登记号为EF620047～EF620298.其中,双核苷酸重复最为常见,三核苷酸重复次之,多核苷酸重复少见;含(CA)和(GT)重复的序列最多,重复次数最多可达56次;完整序列占35.3%,非完整序列占20.2%,复合序列占18.7%,其余为非典型序列.设计了22对引物扩增不同的微卫星位点,其中20个位点产生特异的PCR产物,PAGE结果显示其中15个位点具有多态性.结论:获得了中华按蚊新的多态微卫星位点共15个,为中华按蚊群体遗传和其他相关研究提供了分子标志.     

RIP140基因多态性及其与济宁青山羊产羔数关系的研究

根据牛R1P140基因mRNA序列,设计5对引物(P1 ～ P5),利用每对引物分别扩增随机选取的济宁青山羊和辽宁绒山羊各5个个体,PCR产物克隆测序,获得山羊R1P140基因全部CDS序列.通过序列比对在此序列822位发现C→T的沉默突变.根据获得的山羊R1P140基因的CDS序列设计引物P6,采用PCR-RFLP技术检测C822T多态位点在高繁殖力品种(济宁青山羊、贵州白山羊)和低繁殖力品种(辽宁绒山羊、波尔山羊、内蒙古绒山羊)中的单核苷酸多态性,并研究该基因对山羊产羔数的影响.结果发现,引物P6扩增片段在济宁青山羊、贵州白山羊、辽宁绒山羊和波尔山羊中均检测到CC、CT和TT3种基因型,内蒙古绒山羊中只检测到CT和TT两种基因型.济宁青山羊CC、CT和TT基因型频率分别为0.056、0.309和0.635,CC型和CT型母羊平均产羔数分别比TT型多0.81只(P＜0.05)和0.65只(P＜0.05),CC型比CT型多0.16只(P＞0.05).研究结果初步表明,RIP140基因的C等位基因是提高山羊产羔数的一个潜在有效的DNA标记.     

Migfilin基因的克隆和真核表达载体的构建

目的 克隆Migfilin全长cDNA,构建Flag-migfilin真核表达载体并进行序列测定,为研究migfilin与疾病的关系奠定基础.方法 根据人全长migfilin cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板,利用PCR技术克隆migfilin全长cDNA.将扩增出的目的基因克隆至pCR 2.1载体,经Xba I/Hind Ⅲ双酶切后进行重组质粒鉴定,DNA序列测定.将测序正确的目的基因克隆至Flag载体并鉴定.结果 成功克隆了migfi-lin全长cDNA,序列测定表明与已知migfilin基因序列一致.在此基础上,构建了flag-migfilin真核表达载体并进行了鉴定.结论 Flag-migfilin真核表达载体构建成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础.     

神经营养素3基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠神经营养素-3(NT-3)基因的表达序列,构建大鼠NT-3基因真核表达载体.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-N3,用限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为822 bp的特异片段,重组质粒酶切后产生822 bp和5.2 kb片段,DNA测序证实822 bp片段的碱基序列与大鼠NT-3 cDNA序列完全一致.结论 成功克隆大鼠NT-3基因表达序列并构建了NT-3基因真核表达载体pcDNA3-N3.     

血清中乙型肝炎病毒全基因组及X基因的克隆与鉴定

目的:建立从血清样品直接扩增乙型肝炎病毒(HBV)全长DNA的方法,构建HBV全基因组克隆.方法:用长链PCR从血清样品一次性扩增HBV全长DNA,测序鉴定后插入质粒puc19构建含HBV全基因组的重组质粒,再从重组质粒扩增X基因并进行序列分析.结果:经DNA序列测定和酶切分析,获得HBV全基因组克隆,从克隆的HBV全基因组扩增到X基因.结论:从血清中可直接扩增到HBV全基因组DNA,为整体水平研究HBV基因组的变异与其致病及宿主抗感染免疫之间的关系奠定了实验基础.     

含变形链球菌PAcA基因的真核表达质粒pcDNA3.1-PAcA的构建与鉴定

目的 :构建含有免疫刺激序列、可防止变形链球菌在牙面粘附的DNA疫苗。方法 :利用PCR技术由质粒pPAcA CTA2 B扩增编码PAcA的DNA片段 ;通过T A克隆技术将目的DNA片段克隆于载体pMD1 8 T ,鉴定插入方向后 ,将目的DNA从载体上释放 ,再克隆于含有CpG免疫刺激序列的真核表达载体pcDNA3 .1 ,构建出用作防龋疫苗的真核表达质粒pcDNA3 .1 PAcA。结果 :通过对重组质粒pcDNA3 .1 PAcA进行酶切图谱和DNA序列测定分析 ,证明真核表达重组质粒pcDNA3 .1 PAcA构建成功、阅读框架正确。结论 :利用T A克隆等技术可成功将编码PAcA的DNA片段克隆到含有免疫刺激序列CpG的真核表达载体pcDNA3 .1 ,构建出真核表达重组质粒pcDNA3 .1 PAcA。     

人CCR5Delta32基因重组慢病毒载体的构建及表达

目的:构建含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并鉴定其表达性能。方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMCs)内提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化感受态E.coliDH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序。再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析。最后用pLP1、pLP2、pLP/VSVG及pLenti-CCR5Delta32四种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并通过Western blot鉴定目的基因在靶细胞内的表达。结果:经PCR扩增获得约650bp的DNA片段,测序结果与发表于GenBank上的序列完全一致。经酶切鉴定,克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO中。四种质粒共转染293T细胞,产生出5×105TU/ml高滴度的重组慢病毒。用其感染靶细胞,Western blot结果显示有目的蛋白表达。结论:成功构建了含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并将其在293T细胞内表达,为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础。     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

菌落PCR快速鉴定Bcl-2基因及测序

目的克隆大鼠Bcl-2基因(B cell lymphoma)全长cDNA,快速筛选重组pMD18-T-Bcl-2阳性克隆。方法采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,用单菌活PCR扩增快速鉴定DNA片段后酶切进一步鉴定及序列分析。结果在筛选的阳性克隆中扩增到大鼠Bcl-2基因,经菌落PCR、酶切鉴定及DNA序列分析证实该序列正确。结论用单菌落PCR扩增快速鉴定克隆在pMD18-T载体上的Bcl-2基因是一种简便、经济的方法。成功克隆了Bcl-2基因,为进一步研究Bcl-2cDNA的基因功能及进行基因治疗奠定了基础。     

豚鼠基因组26个多态性微卫星标记的筛选

目的：筛选豚鼠基因组的多态性微卫星标记，为豚鼠遗传质量控制及基因定位等工作奠定基础。方法：采用磁珠富集法和豚鼠基因组数据库筛选法获取微卫星位点序列，通过分析和初步筛选，挑选部分候选位点，根据其序列设计引物，对5种不同来源的豚鼠基因组DNA标本进行PCR扩增，以期获得多态性分子标记。结果：本实验采用磁珠法共获得微卫星序列304个，设计引物125对，最终获得多态性位点1个，暂未发现多态性的特异性位点17个；用数据库筛选法共获得微卫星序列292个，设计并合成相应引物178对，最终发现多态性位点25个，暂未发现多态性的特异性位点28个。结论：本实验共获得26个多态性微卫星标记，45个潜在的候选标记，为微卫星标记在豚鼠遗传质量监测及突变基因定位等工作的应用奠定了基础。     

肺鳞癌患者癌组织和血液中微卫星DNA变异的检测

目的：检测肺鳞癌患者癌组织和外周血中微卫星DNA的变异。方法：选择30例原发性肺鳞癌患者的癌组织、外周血液标本及30例肺部良性疾病患者的外周血液标本,用PCR—银染法,对其中的20个微卫星位点进行检测。结果：癌组织微卫星DNA变异的检出率较高(26％),肺鳞癌患者外周血20个位点微卫星DNA变异的检出率(20．2％)与癌组织相比差异均无统计学意义,检测出的敏感位点有D3S1067、D3S1447、D3S1611、D3S1284、D3S1110、D3S1007、D5S346、D9S1748。30例肺部良性疾病患者外周血在全部20个微卫星DNA位点上没有检测到变异。结论：肺鳞癌患者存在微卫星DNA的变异,进行外周血中敏感位点微卫星DNA变异的检测对肺鳞癌的早期诊断有重大意义。     

基因扫描微卫星DNA进行常染色体显性遗传性多囊肾病囊肿前诊断

目的；利用与多囊肾病PKD1基因紧密连锁的微卫星DNA，通过家系连锁分析，进行了常染色体显性遗传性多囊肾病（ADPKD）的囊肿前诊断，为临床分子诊断奠定基础。方法：采用PCR－基因扫描的方法，对4个ADPKD家系共39人进行了连锁分析。结果：通过连锁分析，发现4个家系中1名16岁个体为PKD1突变携带者，处于囊肿发生前期。结论：基因扫描微卫星DNA是一种快速，准确的基因分型方法，可用于ADPKD的囊肿前诊断。     

五个微卫星DNA在儿童失神癫痫关联研究中的应用

目的 研究γ－氨基丁酸（GABA）A型受体亚单位基因GABRA5以及GABRB3是否与儿童失神癫痫（CAE）相关联。方法 以染色体15q11-15q13附近5个微卫星DNA 69CA、85CA、155CA1、155CA2和A55CA1作为遗传标记,对90个CAE患儿和100名正常对照采用微卫星荧光标记半自动基因分型技术进行基因分型,应用病例对照研究进行关联分析。结果 5个微卫星DNA在中国正常人群等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡,多态信息含量分别为：0．47、0．82、0．66、0．86和0．86。5个微卫星DNA的某些等位基因频率在病例组中显著高于正常对照组。结论 除69CA以外,其他4个微卫星DNA均是多态性较好的遗传标记,γ－氨基丁酸A型受体亚单位基因GABRA5以及GABRB3与CAE的发病机制可能相关。     

hMSH2基因在散发卵巢癌中突变研究

目的：研究卵巢癌患者ＤＮＡ错配修复基因ｈＭＳＨ２（ＨｕｍａｎｍｕｔＳｈｏｍｏｌｏｇ）基因突变，同时检测其基因组微卫星Ｄ２Ｓ１２３序列变化。方法：应用ＰＣＲ、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＤＮＡ序列分析方法检测了１５例卵巢癌患者正常细胞和肿瘤细胞中的ｈＭＳＨ２基因突变。结果：３例患者存在ｈＭＳＨ２基因生殖细胞或体细胞突变，序列分析表明有碱基置换的同义突变，有碱基丢失产生的无义突变。有３例患者基因组表现Ｄ２Ｓ１２３变化，其中１例检测到ｈＭＳＨ２突变。结论：ｈＭＳＨ２基因突变和卵巢癌发生有关。机理可能为其突变引起基因组不稳定，而引起一系列基因变化，导致细胞恶性转化     

用微卫星DNA多态性进行血友病甲基因诊断的研究

目的 :研究FⅧ基因 13内含子 (CA)n重复序列 (CA 13)、2 2内含子 (CA)n重复序列 (CA 2 2 )及基因旁微卫星DNADXS15位点的多态性在血友病甲基因诊断中的应用价值。方法 :用聚合酶链反应 (PCR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(测序胶 )的方法 ,检测了三个血友病甲家系共 12名成员X染色体CA 13、CA 2 2、DXS15的长度变化 ,并进行连锁分析结果 :三个家系均得到诊断 ,并检出一名携带者。结论 :用微卫星多态性进行血友病甲基因诊断 ,方法简便可行 ,有望成为血友病甲基因诊断的新方法     

微卫星DNA与生化标记分析对长爪沙鼠群体遗传分析的比较

目的比较生化标记和微卫星DNA标记方法对长爪沙鼠群体遗传分析的可靠性。方法应用27个生化位点和13个微卫星DNA位点,采用已建立的生化标记和微卫星DNA标记分析方法对国内2个长爪沙鼠群体进行遗传分析,计算并比较两种方法测得的各群体遗传参数。结果生化基因位点中有13个位点在整体中呈现遗传多态性,多态率为48.1%;微卫星位点中有11个位点在整体中表现出多态性,多态率均为84.6%。两种方法测得的平均有效等位基因数趋于一致,微卫星DNA的多态位点百分率和平均杂合度均明显高于生化标记方法。但生化标记和微卫星DNA检测对两个长爪沙鼠群体的遗传多样性差异反映一致,所反映的群体平衡状况也基本一致。结论生化标记分析和微卫星DNA方法均可较好地反映长爪沙鼠群体遗传结构。     

中国人散发性大肠癌中微卫星DNA不稳定的研究

目的：探讨中国人散发性大肠癌中微卫星 Ｄ Ｎ Ａ 不稳定及复制差错与大肠癌生物学行为的关系。方法：选择１０ 个微卫星位点, 应用 Ｐ Ｃ Ｒ－ 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对３９ 例散发性大肠癌组织进行检测。结果：在多个位点上发现了较高的微卫星 Ｄ Ｎ Ａ 不稳定（ Ｍ Ｉ） ,其中 Ｄ３ Ｓ１３１７ 位点上 Ｍ Ｉ为４４ ％ , Ｄ３ Ｓ９６６ 上 Ｍ Ｉ为２６ ．６ ％ , Ｄ２ Ｓ１２３ 和 Ｄ２ Ｓ１１９ 上 Ｍ Ｉ分别为３６ ％ 和２５ ．７ ％ 。结论： Ｍ Ｉ阳性率和肿瘤组织学分类无明显相关性,而与肿瘤组织的分化程度、浸润程度等有显著的相关关系,因而微卫星 Ｄ Ｎ Ａ 可以为肿瘤的早期诊断及患者预后判断提供帮助。同时,在散发性结肠癌中也存在较高的微卫星 Ｄ Ｎ Ａ 不稳定,这可能与某种 Ｄ Ｎ Ａ 错配修复基因发生突变有关。     

应用荧光标记基因分型对中国汉族人群进行遗传多态性研究

目的：为了确定我国汉族人群遗传多态性片段大小范围与法国人群的差异，更好的进行基因组扫描和个体识别等方面研究。方法：400个微卫生位点分别在32个反应管中进行扩增。在5μl反应体系中加6－17对PCR引物，多个微卫生位点同时扩增，产物在AB1377XLDNA测序仪上进行电泳。结果：400个微卫生位点共有306个有满意的结果，其中124个微卫星位点与法国CEPH家系存在片段范围的差异。结论：遗传多态性片段大小范围在种族间存在较大差异；在对中国汉族人群进行基因分型时，应在Genethon提供的范围基础上向两侧各扩大10bp。     

散发性非息肉性大肠癌微卫星DNA不稳定性分析

为分析Ｄ２Ｓ４４１、Ｄ２Ｓ１１９和Ｄ２Ｓ１２３３个微卫星ＤＮＡ标记位点不稳定性,研究ＳＮＰＣＣ发生机理的分子基础。应用ＰＣＲ－ＳＳＬＰ扩增微卫星ＤＮＡ,聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对３１例临床诊断为散发性非息肉性大肠癌的肿瘤组织及其相应的正常组织的Ｄ２Ｓ４４１、Ｄ２Ｓ１１９和Ｄ２Ｓ１２３３个微卫星ＤＮＡ标记位点进行分析。结果显示,３１例中,２例在所检测的３个位点均存在微卫星ＤＮＡ不稳定性。提示微卫星ＤＮＡ不稳定性与散发性非息肉性大肠癌发生有关,可通过检测微卫星ＤＮＡ不稳定性筛选大肠癌高危人群,以便早期预防。