BC022687基因真核表达质粒的构建及在CHO细胞内的蛋白表达和定位

目的:BC022687可能是调节纤毛形成的蛋白。本研究构建BC022687基因真核表达载体并探讨融合蛋白在细胞内表达及定位。方法:以小鼠睾丸cDNA文库为模板,PCR扩增全长BC022687编码序列,测序后亚克隆至携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的pEGFP-C1真核表达载体中。将构建的重组质粒转染到CHO细胞中,提取细胞蛋白进行Western印迹检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察BC022687/GFP融合蛋白在CHO细胞内定位。结果:翻译BC022687蛋白的cDNA序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小950 bp。Western印迹检测到相对分子质量约为64 000的融合蛋白表达。BC022687/GFP融合蛋白在细胞内定位以细胞质为主,并在中心体、纤毛形成的模板表达。结论:成功构建BC022687全长基因真核表达载体,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

phCMV1和pcDNA3表达人绒毛膜促性腺激素β-C3d3融合蛋白的表达效率比较

目的　比较真核表达载体 phCMV1和pcDNA3在中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞中表达人绒毛膜促性腺激素 β(hCGβ) C3d3融合蛋白的表达效率 ,以获得hCGβ C3d3融合蛋白的高效表达。　 方法　利用高效真核表达载体 phCMV1,构建带有 6个组氨酸纯化标签的融合蛋白表达质粒phCMV1 6His hCGβ C3d3;脂质体法介导phCMV1 6His hCGβ C3d3和pcDNA3 hCGβ C3d3转染CHO细胞 ,G4 18(80 0 μg/ml)筛选抗性克隆 ,G4 18(30 0 μg/ml)维持培养、扩增 ,待阳性克隆 95 % 汇片时换用无血清培养基培养。放射免疫法检测hCGβ表达量 ,Westernblot鉴定表达产物 ,Raji细胞免疫化学染色法鉴定hCGβ与C3d分子的成功融合。反复冻存和复苏高效表达hCGβ C3d3融合蛋白的阳性克隆 ,比较表达效率的变化。用镍柱和凝胶过滤层析纯化表达产物。　结果　酶切鉴定及测序证实 phCMV1 6His hCGβ C3d3构建正确 ,并成功地在CHO细胞中获得了 6His hCGβ C3d3融合蛋白的表达。无血清培液中 2 4、4 8、72h融合蛋白的表达量分别为 4 96、5 2 7、6 33mIU/ml/ 1× 10 6细胞 (以hCGβ含量计算 ) ,phCMV1比 pcDNA3载体的表达效率高 1.4倍。 3次冻存和复苏高效表达hCGβ C3d3融合蛋白的阳性克隆 ,表达效率无明显变化。表达产物经纯化后获得了所需的hCGβ C3d3?     

Cyr61蛋白表达载体的构建及表达

目的：体外表达并纯化Cyr61蛋白片段。方法：提取乳腺癌组织总RNA，用一步法RT—PCR选择扩增编码Cyr61蛋白的cDNA片段，并将之克隆到融合蛋白表达载体pQE80L中，转染大肠杆菌Rosetta—gami^TM2。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白，用亲和层析法纯化。纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹分析鉴定。结果：克隆到编码Cyr61蛋白片段的cDNA片段，其大小为930bp。构建的表达质粒PQE80-Cyr61经限制性内切酶酶切和DNA测序证实为所需要的质粒。表达出相对分子质量分别为32kD的可溶性融合蛋白，经蛋白质印迹分析鉴定为Cyr61的融合蛋白。结论：本实验克隆了编码Cyr61蛋白片段的cDNA序列，并成功地获得了可溶性表达的融合目的蛋白，为进一步制备抗Cyr61蛋白的抗体和建立Cyr61蛋白定量检测方法创造了条件。     

ARM结构的缺失对SPAG6在哺乳细胞中定位的影响

目的本研究构建精子相关抗原6(SPAG6)基因全长及6个不同长短ARM序列的真核表达载体pEGFPN2-SPAG6-△ARM,并使其在CHO细胞中表达,观察全长及6个ARM结构缺失后对真核细胞CHO细胞中SPAG6蛋白定位的影响。方法利用NCBI数据库,寻找小鼠SPAG6蛋白的保守功能区,分析全长蛋白序列,检索出SPAG6有7个ARM区域。利用PCR技术扩增出6个缺失不同ARM结构的SPAG6 cDNA,测序后亚克隆至携带绿色荧光蛋白基因的pEGFP-N2真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切和测序鉴定,将构建的重组质粒转染到CHO细胞中,分别提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察7个不同SPAG6/GFP融合蛋白在CHO细胞内的定位。结果酶切和测序鉴定表明,全长及6个缺失不同长短ARM结构的真核表达质粒构建成功,转染实验发现重组质粒均能够在CHO细胞中表达,但仅全长表达产物定位于微管,缺失任何一个ARM区域都可影响在细胞中的微管定位。结论SPAG6在哺乳动物细胞内的正确定位依赖于全长。该研究为进一步研究SPAG6蛋白的结构与功能奠定基础。     

P-selectin糖蛋白配体-1的基因克隆及其Ig融合蛋白的表达和纯化

目的:克隆P-selectin糖蛋白配体-1的基因,表达和纯化其Ig融合蛋白。方法:RT-PCR法克隆出P-选择素糖蛋白配体-1(CD162)cDNA,构建真核表达载体,DEAD-Dextran法转染COS7细胞,上清经纯化后,分别使用WesternBlot和流式细胞仪鉴定CD162-hIgFc融合蛋白的性质和活性。结果:RT-PCR克隆出801bp的CD-162cDNA片段,插入载体构建出pIg-CD162,将其转染COS7细胞后获得CD162-hIgFc融合蛋白,分子量为74KD。WesternBlot证实其为CD162-hIgFc融合蛋白,流式细胞仪证明获得的CD162-hIgFc融合蛋白能够识别血小板表面的CD62P。结论:本研究成功制备了CD162-hIgFc融合蛋白,为进一步探讨P选择素与其配体CD162之间的作用打下坚实的基础。     

小鼠睾丸gdnf基因的克隆及其在支持细胞中的表达

目的:从小鼠睾丸中克隆胶质细胞源神经营养因子基因gdnf,构建真核表达载体,并转染支持细胞,以便用作培养精原干细胞(SSCs)的滋养层。方法:以正常成年昆明鼠为材料,提取小鼠睾丸组织中总RNA后,以RT-PCR技术克隆小鼠睾丸gdnf基因,构建真核表达载体,并转染TM4细胞(睾丸支持细胞株),在转染后40h进行免疫荧光鉴定。结果:成功克隆小鼠睾丸gdnf基因的cDNA,测序正确,免疫荧光细胞染色显示转染后的支持细胞中有GDNF蛋白表达。结论:本研究为以转染了gdnf基因的支持细胞作饲养层培养SSCs奠定了基础。     

探讨抑制水通道蛋白-1在人前列腺癌细胞中的表达对癌细胞凋亡的影响

目的:通过抑制水通道蛋白-1在前列腺癌PC-3细胞的表达,了解前列腺癌细胞的凋亡情况。方法:设计合成针对前列腺癌PC-3细胞AQP1基因的小干扰RNA并构建高效表达载体,脂质体法转染PC-3细胞,Western Blot检测AQP1蛋白表达的变化。结果:AQP1在前列腺癌PC-3细胞表达,针对AQP1基因siRNA高效表达载体能够抑制AQP1蛋白在PC-3细胞的表达,AQP1蛋白相对表达量为:转染组0.54±0.04,正常对照组0.82±0.08,差异有显著性(P<0.01);成瘤实验中转染组caspase-3的含量明显高于对照组,差异显著(P<0.05),AQP1的表达量与癌细胞的凋亡呈负相关。结论:通过抑制AQP1基因的表达,有效抑制了前列腺癌PC-3细胞AQP1蛋白表达,近而使癌细胞的凋亡增加。     

重组蛋白Cox7a2原核表达及鉴定

目的:从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中克隆Cox7a2基因,构建pGEX4T-1-Cox7 a2载体,表达和鉴定重组蛋白。方法:应用RT-PCR方法从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中克隆Cox7 a2,利用BamH I和EcoR I酶切位点把Cox7a2克隆到pGEX4T-1载体,酶切和测序鉴定后,诱导重组蛋白的表达,进行纯化后,利用蛋白免疫印迹进行鉴定。结果:从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞克隆到Cox7a2完整的编码序列,构建了pGEX4T-1-Cox7 a2载体,表达了预期相对分子质量的融合蛋白,并经免疫印迹检测鉴定。结论:成功克隆Cox7a2,表达纯化了其融合蛋白,为基因的功能研究奠定了前期基础。     

Cox7a2荧光载体构建及其在小鼠睾丸Leydig细胞表达和定位研究

目的构建Cox7a2的荧光表达载体,研究其在小鼠睾丸Leydig细胞中的表达和定位。方法原代培养小鼠睾丸Leydig细胞并利用3β-HSD染色法鉴定,应用PCR方法研究Cox7a2在小鼠睾丸Leydig细胞中的表达。利用BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点把Cox7a2克隆到pEYFP-N1。细胞转染和细胞荧光显微镜技术观察YFP-Cox7a2定位。结果Cox7a2表达在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞中。绿色荧光的YFP-Cox7a2和红色荧光的线粒体标记物- Mitotracker有完全的共定位。结论Cox7a2在小鼠睾丸Leydig细胞表达,成功构建Cox7a2真核荧光蛋白表达载体,明确YFP-Cox7a2定位在Leydig细胞的线粒体。这些结果将对老年男性睾丸间质细胞合成功能障碍的研究提供重要的信息。     

大鼠睾丸间质tau蛋白和微管结合蛋白表达的变化

目的 :检查老龄和青年大鼠睾丸间质组织中tau蛋白和微管结合蛋白的表达情况 ,籍此评价老龄大鼠睾丸衰退的发生机制。　方法 :应用二步法免疫组化技术检查 6月龄SD雄性大鼠 (10只 ,青年组 )和 2 8月龄同品系大鼠 (10只 ,老龄组 )睾丸组织抗Tau蛋白和抗微管结合蛋白的抗体免疫反应情况。　结果 :老龄大鼠睾丸间质组织中tau蛋白免疫反应阳性细胞数明显高于青年组 (P <0 .0 0 1) ,而青年组大鼠睾丸间质组织中微管结合蛋白免疫反应阳性细胞数明显高于老龄组 (P <0 .0 1)。　结论 :tau蛋白和微管结合蛋白免疫反应阳性细胞数量的变化可能与睾丸衰退有密切关系     

Labeling of human insulin-like growth factor-I eukaryotic expression vector with green fluorescent protein

Articularcartilageinjuriesinadultsarecommon.Theintrinsicrepairisgenerallyminimalandcartilageinjuriescanfurtherdevelopintoosteoarthritis.Insulin likegrowthfactor I(IGF I)is regardedasoneofthemostimportantgrowthfactorsin cartilagedevelopmentandhomeostasis.Theadditionof IGF Itochondrocytesinvitroenhanceschondrocyte metabolism,maintainsadifferentiatedchondrocyte morphologyandpromotessynthesisofmajorcartilage matrixproteins,includingtype IIcollagenand proteoglycans.1,2IGF Iinlowconcentrationi…     

绿色荧光蛋白标记神经干细胞的体外研究

目的　构建携带绿色荧光蛋白 (GFP)基因的逆转录病毒载体pLNCX2 GFP ,用GFP对神经干细胞进行标记示踪。方法　应用基因克隆的方法 ,制备 pLNCX2 GFP ,借助阳离子脂质体转染包装细胞PA3 17,G418筛选阳性克隆 ,获取病毒上清 ;从胚胎大鼠脑中解剖分离和培养神经干细胞 ,用病毒上清感染大鼠胚胎神经干细胞。结果　经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了重组GFP逆转录病毒 ,pLNCX2 GFP转染包装细胞后可以产生GFP逆转录病毒 ,病毒感染大鼠胚胎神经干细胞可以长期表达绿色荧光。结论　逆转录病毒能够快速、稳定、长期地将GFP基因转入神经干细胞 ,这种标记方法非常有利于神经干细胞移植后结构和功能的研究     

Pathogenesis of nephrogenic diabetes insipidus by aquaporin-2 C-terminus mutations

BACKGROUND: We previously reported three aquaporin-2 (AQP2) gene mutations known to cause autosomal-dominant nephrogenic diabetes insipidus (NDI) (Am J Hum Genet 69:738, 2001). The mutations were found in the C-terminus of AQP2 (721delG, 763 to 772del, and 812 to 818del). The wild-type AQP2 is a 271 amino acid protein, whereas these mutant genes were predicted to encode 330 to 333 amino acid proteins due to the frameshift mutations leading to the creation of a new stop codon 180 nucleotides downstream. The Xenopus oocyte expression study suggested that the trafficking of the mutant AQP2s was impaired. METHODS: To determine the cellular pathogenesis of these NDI-causing mutations in mammalian epithelial cells, Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells were stably transfected with the wild-type AQP2, or the 763 to 772del mutant AQP2, or both. Cells were grown on the membrane support to examine the localization of AQP2 proteins by immunofluorescence microscopy. RESULTS: Confocal immunofluorescence microscopy showed that the wild-type AQP2 was expressed in the apical region, whereas the mutant AQP2 was apparently located at the basolateral region. Furthermore, the wild-type and mutant AQP2s were colocalized at the basolateral region when they were cotransfected, suggesting the formation of mixed oligomers and thereby mistargeting. CONCLUSION: Mixed oligomers of the wild-type and the 763 to 772del mutant AQP2s are mistargeted to the basolateral membrane due to the dominant-negative effect of the mutant. This defect is very likely to explain the pathogenesis of autosomal-dominant NDI. The mistargeting of the apical membrane protein to the basolateral membrane is a novel molecular pathogenesis of congenital NDI.     

Labeling of human insulin-like growth factor-Ⅰ eukaryotic expression vector with green fluorescent protein

To label human insulin-like growth factor-Ⅰ (hIGF-Ⅰ) eukaryotic expression vector with green fluorescent protein (GFP) for the repair of articular cartilage defects. Methods: GFP cDNA was inserted into pcDNA3.1-hIGF-Ⅰ to construct the co-expression vector with two multiple cloning sites mammalian expression vector under two cytomegalovirus promoters/enhancers respectively. Recombinant pcGI was transfected into NIH 3T3 cells with the help of lipofectamine. Results : Enzyme digestion and agarose gel electrophoresis analysis revealed that pcGI vector contained correct GFP and hIGF-Ⅰ eDNA. Expression of hIGF-Ⅰ and GFP was confirmed in transfected NIH 3T3 cells by immunocytochemical analysis and fluorescence microscopy. Conclusions : hIGF-Ⅰ eukaryotic expression vector has been successfully labeled with GFP.     

人VEGF-C基因荧光真核表达载体的构建和表达

目的:构建含有绿色荧光蛋白基因的人血管内皮生长因子C基因的真核表达载体,检测该基因在真核细胞中的表达,研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用.方法:含有绿色荧光蛋白基因的质粒pEGFP-1通过末端平滑化,酶切获得5'(粘端)BamHI-EGFP-XbaI(平端)3'片断,已经构建的VEGF-C表达载体pcDNA3.1/VEGF-C通过末端平滑化,酶切获得5'-(粘端)BamHI-pcDNA3.1-目的基因-KpnI(平端)3',两片段连接构建含有绿色荧光蛋白的真核表达载体,琼脂糖凝胶电泳并测序检测插入片段的正确性.将该载体通过脂质体转染到真核细胞CHO中,观察绿色荧光蛋白在CHO细胞中的表达情况.通过G418筛选阳性转染细胞,提取总RNA,行RT-PCR,PCR产物琼脂糖凝胶电泳观察VEGF-C基因在CHO细胞中的表达情况.结果:琼脂糖凝胶电泳证实了插入EGFP片段的大小,测序结果证实了插入片段的正确性,CHO细胞中看到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR产物中含有VEGF-C cDNA.结论:成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的VEGF-C真核表达载体并检测到在真核细胞CHO中的表达.     

SEDT-PA致病基因WISP3突变体的构建及在COS-7细胞中的表达定位

目的通过构建晚发型脊柱骨骺发育不良伴进行性骨关节病（SEDT-PA）致病型（1000 T-C，840deIT）Wnt诱导分泌蛋白3（WISP3）与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体，观察其在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位，为研究WISP3突变致SEDT-PA的机理奠定基础。方法从正常人软骨细胞获得野生型WISP3基因的全长cDNA（WT-WISP3）；定点突变方法构建携带WISP3基因致病型的重组真核表达质粒MUT^1000T-C／pEGFP-C2和MUT^840deIT／pEGFP-C2；以空白载体pEGFP-C2为对照，脂质体转染法将重组质粒瞬时转染COS-7细胞，48h后用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达；半定量RT-PCR法检测WISP3基因的表达。结果测序和酶切鉴定证实插入片段大小和序列的正确；突变体在COS-7细胞中均高效表达；荧光显微镜观察发现，转染野生型WISP3基因的COS-7细胞中绿色荧光均匀分布在细胞浆和细胞膜，转染突变体的COS-7细胞中荧光呈斑点状染色和聚集现象。结论成功构建了SEDT-PA致病基因WISP3突变体，且发现野生型WISP3蛋白定位于细胞浆和细胞膜，而突变型的WISP3蛋白在细胞浆内异常聚集，为进一步探讨SEDT-PA的发病机制创造条件。     

抗菌肽葛佬素在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达及其活性的初步分析

目的 观察自行设计的葛佬素cDNA在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达及其表达产物的抗菌作用。方法 分析同种族蛋白质Attacin A cDNA序列各种遗传密码子的出现频度，结合已知的葛佬素蛋白质序列，设计、合成其cDNA序列。经测序验证后，将葛佬素基因插入真核细胞表达载体pCDSI中，构建载体pBZHG。随后以脂质体为载体，对COS—7细胞进行质粒pBZHG和空载体pCDSI的转染，72h后收集细胞培养上清液，进行杀菌活性的检测(以正常C0S—7细胞培养上清作对照)。结果 人工设计的葛佬素cDNA序列在COS—7中得到表达。与转染空载体的细胞和正常细胞比较，转染pBZHG的COS—7细胞培养上清对大肠杆菌J5具有杀菌活性。结论 笔所设计的葛佬素cDNA序列是正确的，由此可为深入研究葛佬素的抗菌及抗内毒素作用提供实验依据。     

BMPR1A mutations in juvenile polyposis affect cellular localization

Background

Juvenile polyposis (JP) is characterized by the development of hamartomatous polyps of the gastrointestinal tract that collectively carry a significant risk of malignant transformation. Mutations in the bone morphogenetic protein receptor type 1A (BMPR1A) are known to predispose to JP. We set out to study the effect of such missense mutations on BMPR1A cellular localization.

Methods

We chose eight distinct mutations for analysis. We tagged a BMPR1A wild-type (WT) expression plasmid with green fluorescent protein on its C-terminus. Site-directed mutagenesis was used to recreate JP patient mutations from the WT–green fluorescent protein BMPR1A plasmid. We verified mutant expression vector sequences by direct sequencing. First, we transfected BMPR1A expression vectors into HEK-293T cells; then, we performed confocal microscopy to determine cellular localization. Four independent observers used a scoring system from 1 to 3 to categorize the degree of membrane versus cellular localization.

Results

Of the eight selected mutations, one was within the signaling peptide, four were within the extracellular domain, and three were within the intracellular domain. The WT BMPR1A vector had strong membrane staining, whereas all eight mutations had much less membrane and much more intracellular localization. Enzyme-linked immunosorbent assays for BMPR1A demonstrated no significant differences in protein quantities between constructs, except for one affecting the start codon.

Conclusions

Bone morphogenetic protein receptor type 1A missense mutations occurring in patients with JP affected cellular localization in an in vitro model. These findings suggest a mechanism by which such mutations can lead to disease by altering downstream signaling through the bone morphogenetic protein pathway.     

人骨形成蛋白7基因重组2型腺相关病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人骨形成蛋白7基因（hBMP7）重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达。方法将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7。KpnⅠ和鼠Ⅱ双酶切质粒pUC18-hBMP7／与pSNAV,用T4DNA连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV—hBMP7／,转染BHK-21细胞,筛选培养,用能表达Rap和Cap的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSVl-rc／△UL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液。采用氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度。用rAAV2-hBMP7／和rAAV2-EGFP在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞。流式细胞仪、RT-PCR和Western—blot方法检测兔骨髓间充质干细胞中hBMP-7基因的转录和表达。结果成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7／,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99．8％,hBMP7／在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达。结论成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7／载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率。