MicroRNA-200a通过抑制上皮-间充质转化影响乳腺癌细胞的恶性生物学行为

目的:探讨微小RNA-200a(miR-200a)表达改变对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响及其调节机制。方法:RT-qPCR法检测人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7中miR-200a的表达水平与正常人乳腺上皮细胞株MCF-10A的差异。CCK-8法检测转染miR-200a mimic和miR-inhibitor后MDA-MB-231细胞活力的变化。采用流式细胞术及Transwell实验检测转染后MDA-MB-231细胞凋亡及侵袭能力的变化。采用RT-qPCR和Western blot检测上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)、SIP1、Snail、Twist、ZEB1和ZEB2 mRNA及蛋白表达的变化。结果:与MCF-10A细胞相比,miR-200a在MDA-MB-231细胞中表达显著降低(P0.05)。过表达miR-200a使MDA-MB-231细胞活力降低(P0.05),凋亡率升高(P0.05),侵袭能力下降(P0.05), SIP1、N-cadherin、Snail、Twist、ZEB1和ZEB2的mRNA及蛋白表达显著下调(P0.05),而E-cadherin的mRNA及蛋白表达显著增加(P0.05);抑制miR-200a的表达使上述结果逆转(P0.05)。结论:上调miR-200a能够抑制MDA-MB-231细胞的活力和侵袭,促进MDA-MB-231细胞的凋亡。miR-200a可能通过抑制上皮-间充质转化调控乳腺癌的恶性生物学行为。     

HDAC1调控Wnt/β-catenin信号通路对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的:研究组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)对乳腺癌细胞凋亡的影响及机制。方法:RT-qPCR和Western blot法分别测定正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和乳腺癌细胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231中HDAC1的m RNA和蛋白水平。在MDA-MB-231细胞中转染HDAC1 si RNA,RT-qPCR和Western blot测定HDAC1的表达水平,MTT法测定细胞活力,流式细胞术测定凋亡,Western blot测定细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和cleaved caspase-3的蛋白水平。用Wnt/β-catenin信号通路激活剂处理下调HDAC1表达后的乳腺癌细胞,测定细胞活力和凋亡。结果:乳腺癌细胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231中HDAC1的m RNA和蛋白水平均明显高于正常乳腺上皮细胞系MCF-10A(P 0. 01),并且MDA-MB-231细胞中的HDAC1水平最高。HDAC1 si RNA可以降低乳腺癌细胞中HDAC1的m RNA和蛋白水平。敲减HDAC1表达后的MDA-MB-231细胞活力降低,细胞凋亡率升高,细胞中cleaved caspase-3水平升高,β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白水平降低(P 0. 05)。Wnt/β-catenin信号通路激活剂可以逆转HDAC1下调诱导的MDA-MB-231细胞凋亡和细胞活力降低,减少cleaved caspase-3的水平(P 0. 05)。结论:敲减HDAC1的表达可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活诱导乳腺癌细胞凋亡。     

核糖核酸酶抑制因子对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡和侵袭的影响

目的:将核糖核酸酶抑制因子(RI)转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231中,探讨RI对细胞凋亡和侵袭的影响。方法:(1)应用脂质体LipofectamineTM2000分别将重组表达载体pLNCX-RI和空载体pLNCX导入MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆并扩增传代。RT-PCR和Western blot检测RI表达。(2)流式细胞术、Transwell细胞侵袭实验分别观察RI对乳腺癌细胞凋亡、侵袭的影响。(3)RT-PCR和West-ern blot法检测Survivin mRNA和蛋白的表达,Western blot方法检测Caspase-3蛋白的活化情况,初步探讨RI诱导乳腺癌细胞凋亡的相关机制。(4)RT-PCR和Western blot法检测CD24mRNA和蛋白的表达,初步探讨RI抑制细胞侵袭的机制。结果:(1)成功构建表达外源性RI的亚克隆细胞系MDA-MB-231/pLNCX-RI。(2)与未转染的MDA-MB-231细胞及转染空载体的MDA-MB-231/pLNCX细胞相比,MDA-MB-231/pLNCX-RI细胞凋亡率增加(P<0.01);细胞穿膜数减少(P<0.01);Survivin mRNA和蛋白的表达量下降(P<0.01),且能活化Caspase-3;CD24 mRNA和蛋白的表达量亦下降(P<0.01)。结论:(1)外源性RI基因在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的稳定表达可以通过抑制Survivin的表达和激活Caspase-3促进细胞凋亡,并能通过抑制CD24表达降低细胞侵袭力。     

RNA干扰UBQLN1基因表达对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及机制研究

目的：观察抑制泛素1（UBQLN1）基因表达对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。方法： Western blot检测UBQLN1在乳腺癌T47D、BT549、MDA-MB-231、MCF7细胞中相对于正常乳腺上皮细胞MCF-10A的蛋白表达;用Lipofectamine^TM2000将干扰UBQLN1表达的siRNA（UBQLN1-siRNA）转染MDA-MB-231细胞,同时转染阴性对照组（NC组）,并设置空白对照组,收集转染48 h的细胞Western blot检测其UBQLN1的蛋白表达;CCK8法检测UBQLN1-siRNA转染24 h、48 h和72 h的细胞活力;流式细胞仪及Transwell小室分别检测UBQLN1-siRNA转染48 h的细胞凋亡率及侵袭能力;Western blot检测促凋亡蛋白p53和抑凋亡蛋白Survivin、侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）及STAT3和磷酸化的信号转导与转录因子3(p STAT3)的蛋白表达。结果：与MCF-10A细胞比较,UBQLN1在T47D、BT549、MDA-MB-231、MCF7乳腺癌细胞中的表达均显著升高（P<0.01）;与NC组比较,UBQLN1-siRNA组UBQLN1的蛋白表达显著降低,24 h、48 h和72 h的细胞活力均显著降低,细胞凋亡率显著升高,细胞侵袭能力显著降低,Survivin、MMP-2、MMP-9和p-STAT3的蛋白表达均显著降低,p53蛋白表达显著升高（P<0.01）,三组间STAT3的蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论：抑制乳腺癌细胞中UBQLN1基因表达可降低乳腺癌细胞活力和侵袭能力,并诱导细胞凋亡和下调STAT3信号通路。     

miR-504靶向CHD1L抑制乳腺癌细胞侵袭的分子机制

目的探讨miR-504靶向染色质解旋酶DNA结合蛋白(chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like gene,CHD1L)抑制乳腺癌细胞侵袭的分子机制。方法 qRT-PCR检测人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)与乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MCF-7)中miR-504的表达量,同时检测miR-504在MDA-MB-231细胞中的转染效率;双荧光素酶实验检测miR-504与CHD1L是否存在结合靶点;qRT-PCR及Western blot法检测CHD1L mRNA和蛋白的表达水平;Transwell侵袭实验检测MDAMB-231细胞的侵袭能力;Western blot法检测p-Akt、MMP-2和MMP-9的表达情况。结果乳腺癌细胞中miR-504的表达量明显低于人正常乳腺上皮细胞(P 0. 05);miR-504在MDA-MB-231/miR-504组中的表达水平明显增高(P 0. 05);双荧光素酶实验检测显示miR-504能与CHD1L mRNA的3'-UTR结合;此外,过表达miR-504后CHD1L mRNA的表达水平无显著变化,但CHD1L蛋白表达水平显著降低(P 0. 05);与MDA-MB-231/NC组相比,MDA-MB-231/miR-504组侵袭能力明显降低,而MDA-MB-231/miR-504+CHD1L组侵袭能力比MDA-MB-231/miR-504+Con组明显增加;用表皮生长因子分别刺激转染不同质粒的MDA-MB-231细胞,与MDA-MB-231/NC组相比,MDA-MB-231/miR-504组中p-Akt、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显降低(P 0. 05),而MDA-MB-231/miR-504+CHD1L组中p-Akt、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平与MDA-MB-231/miR-504+Con组相比明显增加(P 0. 05)。结论 miR-504靶向CHD1L通过PI3K/Akt/MMP信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭。     

缺氧条件下沉默DEC1基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞活力、侵袭及迁移的影响

目的:探讨在缺氧条件下沉默人胚胎软骨发育基因1 (differentiated embryonic chondrocyte gene 1,DEC1)的表达对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响及作用机制。方法:分别检测不同培养条件(常氧和缺氧)下MDA-MB-231细胞中DEC1基因的表达情况;设计、合成靶向抑制DEC1基因的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),通过脂质体转染入缺氧条件下的MDA-MB-231细胞中,采用RT-qPCR和Western blot法验证细胞转染效率,CCK-8法、Transwell和划痕实验分别检测沉默DEC1基因表达对MDA-MB-231细胞活力、侵袭及迁移能力的影响;此外,采用Western blot法分析转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smad3信号通路关键分子的表达。结果:在缺氧条件下人乳腺癌MDA-MB-231细胞中DEC1表达显著增高(P0.05),沉默DEC1表达后,MDA-MB-231细胞的活力、侵袭和迁移能力显著下降(P0.01);Western blot结果显示,缺氧条件下,沉默DEC1后磷酸化Smad3 (phosphorylated Smad3, p-Smad3)蛋白表达显著降低(P0.05)。结论:在缺氧条件下,沉默DEC1基因表达可能通过阻断TGF-β/Smad3信号通路进而抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的活力、侵袭及迁移能力。     

IL-24对乳腺癌细胞CXCR4表达及肿瘤细胞侵袭、迁移及凋亡能力的影响北大核心CSCD

目的:探究过表达IL-24对乳腺癌细胞CXCR4表达及肿瘤细胞侵袭、迁移及凋亡的影响与机制。方法:免疫组织化学染色(IHC)检测乳腺癌与癌旁正常乳腺组织CXCR4与其配体CXCL12表达,并分析其相关性;Western blot检测CXCR4在人正常乳腺上皮细胞MCF-10A及乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-231中的表达;采用慢病毒稳转技术在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中过表达IL-24,免疫荧光显微镜、RT-PCR和ELISA检测感染效率;将细胞分为5组:LV-IL-24组(感染过表达IL-24慢病毒)、LV-NC组(感染阴性对照慢病毒)、AMD3100组(采用CXCR4/CXCL12轴阻滞剂AMD3100进行培养)、LV-IL-24+AMD3100组(采用AMD3100进行培养的感染过表达IL-24慢病毒的细胞)、阴性对照组(正常培养的MDAMB-231细胞);Transwell、划痕实验和Annexin V-FITC细胞凋亡实验检测上述各组细胞侵袭、迁移及凋亡;Western blot检测各组细胞CXCR4、AKT与mTOR蛋白磷酸化水平及凋亡相关蛋白Bax与cleaved-Caspase-3表达。结果:CXCR4与CXCL12在乳腺癌组织中的表达均显著高于正常乳腺组织,且二者表达呈正相关;与MCF-10A细胞相比,CXCR4在乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453及MDA-MB-231中表达明显增加(P<0.05),以MDA-MB-231最为显著(P<0.01)。转染过表达IL-24的慢病毒后,MDA-MB-231细胞IL-24 mRNA与蛋白表达均显著增加(P<0.05);与阴性对照组相比,LV-IL-24组、AMD3100组和LV-IL-24+AMD3100组细胞侵袭、迁移能力均显著降低(P<0.05),而凋亡率明显提高(P<0.05),LV-IL-24+AMD3100组变化最为显著(P<0.01);Western blot结果显示,与阴性对照组相比,LV-IL-24组、AMD3100组和LV-IL-24+AMD3100组细胞CXCR4、AKT与mTOR蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.05),而凋亡相关蛋白Bax与cleaved-Caspase-3表达明显增加(P<0.05),LV-IL-24+AMD3100组变化最为显著(P<0.01)。结论:乳腺癌细胞中过表达IL-24可抑制CXCR4表达,通过下调PI3K/AKT/mTOR信号通路降低肿瘤细胞侵袭、迁移能力,促进其凋亡,联合使用CXCR4/CXCL12阻滞剂AMD3100可显著提高IL-24的上述抑癌效应。     

原钙黏蛋白10通过NF-κB/cyclin D1信号通路抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖

目的:探讨原钙黏蛋白10(PCDH10)对人乳腺癌细胞的增殖抑制作用及机制。方法:采用RTPCR法检测4种人乳腺癌细胞和正常乳腺上皮MCF-10A细胞中PCDH10的mRNA表达;将PCDH10慢病毒表达载体(pLV-PCDH10)感染MDA-MB-231细胞,建立稳定表达PCDH10的细胞系,同时设置空白对照(blank)和阴性对照(pLV-NC)细胞;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验和集落形成实验检测细胞增殖能力的变化;流式细胞术检测细胞周期变化;Western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、核因子κB p65亚基(NF-κB p65)和NF-κB抑制蛋白α(IκBα)蛋白表达。结果:人乳腺癌细胞中PCDH10的mRNA水平表达均低于正常乳腺上皮MCF-10A细胞(P<0.05)。经RT-PCR与Western blot验证,稳定过表达PCDH10的人乳腺癌MDA-MB-231细胞构建成功;与pLV-NC组相比,过表达PCDH10可显著抑制细胞增殖(P<0.05),诱导细胞发生G1期阻滞;Western blo...     

RNA干扰抑制MTA1基因对人乳腺癌细胞ERα表达及浸润能力的影响

目的 通过观察pGenesil-1肿瘤转移相关基因1(MTA1)对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞MTA1基因的沉默效应,了解其对ERα表达及浸润能力的影响.方法 设计合成并构建重组质粒pGenesil-1MTA1,将该质粒分别转染MDA-MB-231和MCF-7细胞,荧光显微镜评估转染效率,RT-PCR检测MTA1和基质金属蛋白酶(MMP)-9 mRNA表达,免疫细胞化学检测ERα和MMP-9表达,Western blot检测ERα蛋白表达,用Boyden小室体外侵袭实验检测转染前后两株细胞侵袭力的变化.结果 成功构建重组质粒pGenesil-1MTA1,并成功转染入MDA-MB-231和MCF-7细胞(平均转染效率分别为82.5%和78.2%).两株细胞MTA1 mRNA表达均受到不同程度的抑制(分别为80.2%和58.7%).经干扰MTA1基因后MDA-MB-231细胞ERα蛋白表达得到逆转,呈阳性表达;MMP-9 mRNA表达下降;细胞体外侵袭力减弱(侵袭指数为27.2%±2.1%),与干扰前(76.3%±2.4%)相比差异有统计学意义(P＜0.05).而MCF-7细胞转染重组质粒并干扰MTA1基因后,ERα蛋白、MMP-9 mRNA表达和体外侵袭能力变化均无统计学意义(P＞0.05).结论 重组质粒pGenesil-1MTA1能有效抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞MTA1基因表达,ERa在MDA-MB-231细胞得到逆转,表达阳性,其高侵袭能力减弱,使干扰肿瘤转移靶基因成为可能.     

microRNA-31通过靶向调控Dock1抑制乳腺癌的上皮-间质转化

目的:探讨microRNA-31(miR-31)靶向调控Dock1对乳腺癌上皮-间质转化的影响。方法:通过qRT-PCR、Western blot检测人正常乳腺上皮细胞与乳腺癌细胞中miR-31、Dock1的表达情况;将含有miR-31的过表达质粒或Dock1的敲除质粒转入乳腺癌细胞MDA-MB-231中并检测转染效率;用Western blot检测转染后各组细胞中Dock1的表达变化; Transwell侵袭实验检测转染及共转染后各组细胞的侵袭能力的变化; Western blot检测转染及共转染后各组细胞中EMT标志物的表达情况。结果:MCF-7细胞中miR-31的表达明显高于MDA-MB-231细胞,但两组都低于其在MCF-10A中的表达。转染对照及过表达质粒后,MDA-MB-231细胞中miR-31的表达较正常组与对照组明显上调,Dock1表达明显下调。Transwell侵袭实验结果显示,MDA-MB-231/miR-31组相比于MDA-MB-231/NC组穿过基底膜的细胞数明显减少,而与MDA-MB-231/miR-31+con组相比无明显差距; MDA-MB-231/miR-31+Dock1组与MDA-MB-231/miR-31+con组相比穿过基底膜的细胞数明显增多。Western blot结果显示,MDA-MB-231/miR-31和MDA-MB-231/miR-31+con细胞相比于MDA-MB-231/NC细胞中E-cadherin表达水平显著上调,在MDA-MB-231/miR-31+Dock1细胞中E-cadherin的表达水平与对照组相比无统计学意义;与MDA-MB-231/NC细胞相比,MDA-MB-231/miR-31和MDA-MB-231/miR-31+con细胞中Vimentin表达水平明显下调,MDA-MB-231/miR-31+Dock1细胞中Vimentin的表达水平几乎无变化。结论:miR-31可以靶向调控Dock1来抑制乳腺癌的上皮-间质转化,进而抑制乳腺癌的侵袭与转移。     

Rab23在人乳腺癌细胞Bcap-37侵袭迁移中的作用

目的 探讨过表达和敲除Rab23对人乳腺癌Bcap-37细胞侵袭迁移能力的影响.方法 应用Western blot法检测乳腺细胞HBL-100及乳腺癌细胞Bcap-37、MDA-MB-231、MCF-7中Rab23的表达情况.慢病毒转染乳腺癌细胞Bcap-37,筛选出稳定过表达和敲除Rab23的Bcap-37细胞.划痕愈合试验、Transwell实验检测过表达和敲除Rab23后Bcap-37细胞侵袭迁移能力的变化.结果 Western blot法结果显示,Rab23在乳腺和乳腺癌细胞系中均有表达,且Bcap-37细胞表达水平最高,与HBL-100细胞相比,差异有统计学意义(P＜0.01);与空载体Bcap-37细胞比较,过表达Rab23的Bcap-37细胞侵袭迁移能力明显增强(P＜0.01);敲除Rab23的Bcap-37细胞侵袭迁移能力明显减弱(P＜0.01).结论 Rab23在乳腺癌细胞Bcap-37的侵袭迁移中发挥着重要作用.     

优降宁与奥沙利铂协同抑制乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖

目的研究优降宁抑制赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)对奥沙利铂抗人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖作用的影响及其用于抗人三阴性乳腺癌临床研究的潜在价值。方法优降宁和奥沙利铂单独以及联合处理MDAMB-231细胞后,CCK-8法分析细胞增殖; Western blot检测细胞内LSD1表达及其下游底物组蛋白H3K4二甲基化修饰水平、下游基因E-cardherin表达和Bax、Bcl-2及细胞浆内细胞色素C蛋白水平; Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。结果优降宁能够以时间和剂量依赖性地抑制MDA-MB-231细胞增殖(P0. 05); 1 mmol/L优降宁可显著抑制MDAMB-231细胞内LSD1蛋白的组蛋白去甲基化酶活性(P0. 05); 1 mmol/L优降宁和奥沙利铂联合处理具有抑制MDAMB-231细胞增殖的药物协同效应; 1 mmol/L优降宁显著促进奥沙利铂诱导MDA-MB-231细胞凋亡发生(P0. 05),伴随着Bax基因表达上调、Bcl-2基因表达下调和细胞色素C从线粒体向细胞浆的转移。过表达LSD1则可部分逆转优降宁与奥沙利铂对MDA-MB-231细胞增殖的协同抑制(P0. 05)。结论优降宁通过抑制LSD1促进奥沙利铂诱导的MDA-MB-231细胞增殖抑制、细胞凋亡,并产生药物协同效应抑制MDA-MB-231细胞增殖。     

维替泊芬通过下调Yes相关蛋白表达抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖及侵袭和迁移北大核心CSCD

目的探讨维替泊芬对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制。方法选取对数生长期的MDA-MB-231细胞,随机分为对照组和维替泊芬处理组。先采用CCK-8法确定维替泊芬对MDA-MB-231细胞增殖抑制的最低抑制浓度,而后采用4μmol/m L维替泊芬处理MDA-MB-231细胞,采用TranswellTM侵袭实验检测细胞的侵袭能力,采用划痕实验检测细胞迁移能力;采用Western blot法检测(0、4、8、12、16)μmol/m L维替泊芬对MDA-MB-231细胞中增殖相关蛋白c-MYC、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、Yes相关蛋白(YAP)及其靶基因富半胱氨酸蛋白61(CYR61)和结缔组织生长因子(CTGF)的蛋白表达水平。结果维替泊芬明显抑制MDA-MB-231细胞的增殖,且呈剂量依赖性,最低抑制浓度为4μmol/m L。4μmol/m L维替泊芬显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭及迁移。维替泊芬下调MDA-MB-231细胞中增殖相关蛋白c-MYC、细胞周期蛋白cyclin D1及YAP、CYR61和CTGF的蛋白表达水平。结论维替泊芬通过下调YAP及其靶基因CYR61、CTGF表达显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭及迁移。     

沉默CD98hc表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、侵袭的影响

目的观察沉默CD98hc对乳腺癌MDA-MB-231细胞体外增殖、迁移及侵袭的影响。方法应用RNA干扰技术沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞CD98hc的表达,筛选并获得稳定CD98hc低表达的MDA-MB-231细胞株(CD98hc-shRNA)及对照组细胞(Vector)。应用Western blot及qRT-PCR技术鉴定CD98hc的表达;应用MTT细胞增殖实验检测细胞增殖能力的改变;细胞迁移侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力的改变。结果 CD98hc-shRNA下调乳腺癌MDA-MB-231细胞CD98hc的表达,与空白组(0.706±0.013)、对照组(0.724±0.018)相比,实验组(0.580±0.035)细胞的增殖能力明显下调(P0.05),且迁移和侵袭能力也显著受抑制(P0.05),空白组与对照组差异无统计学意义(P0.05)。结论 CD98hc可能参与乳腺癌细胞生物学行为的调控。     

M2巨噬细胞分泌的IL-10通过JAK2/STAT3信号通路调节乳腺癌细胞的增殖、侵袭与凋亡

目的探讨M2巨噬细胞分泌的IL-10通过JAK2/STAT3信号通路对乳腺癌细胞的增殖、侵袭迁移与凋亡的影响。方法THP-1细胞诱导为M2巨噬细胞,并对标志基因(CD206、ARG1、IL-6和IFN-β)进行检测;ELISA检测细胞上清液中IL-10的表达;细胞集落形成实验和EdU实验检测细胞的增殖能力;细胞侵袭与迁移实验检测细胞的侵袭与迁移能力;细胞流式术检测细胞的凋亡率和细胞周期;Western blot检测JAK2/STAT3通路相关蛋白的表达。结果 M2巨噬细胞在体外被成功诱导并进行了鉴定;与未经处理的THP-1细胞相比,M2巨噬细胞上清液中IL-10的明显增加;M2巨噬细胞分泌的IL-10可促进MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭与迁移(均P0.001),抑制MDA-MB-231细胞的凋亡(P0.001);抑制IL-10的表达可抑制MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭与迁移(均P0.05),促进MDA-MB-231细胞的凋亡(P0.05);IL-10可激活JAK2/STAT3信号通路,而抑制IL-10的表达可抑制JAK2/STAT3信号通路的激活。结论 M2巨噬细胞分泌的IL-10可促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭与迁移,抑制乳腺癌细胞凋亡,其机制可能与JAK2/STAT3信号通路激活有关。     

单羧酸转运蛋白基因过表达对MDA-MB-231乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的研究单羧酸转运蛋白(MCT)基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、细胞周期、侵袭和转移能力的影响。方法将真核表达质粒pcDNA3.1/MCT及空质粒pcDNA3.1分别转染乳腺癌MDA-MB-231细胞。采用实时定量PCR(qRTPCR)和Western blot法分别检测转染后细胞内MCT基因的表达。Annexin V-FITC/PI染色和PI单染色结合流式细胞术检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、细胞周期的影响,Transwell实验检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响,划痕实验检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响。结果实验组MCT的mRNA和蛋白水平明显高于转染空质粒的阴性对照组和未处理组;MCT过表达能促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡,G2期细胞减少、S期细胞增多,同时能抑制癌细胞的侵袭和迁移能力。结论 MCT基因过表达能促进MDA-MB-231细胞的凋亡、调节细胞G2/M期检控点,抑制细胞的侵袭和迁移能力。     

沉默JAG1基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

 目的:探究沉默Jagged 1 (JAG1)基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响及其分子生物学机制。方法:
用已构建的pRS-JAG1重组质粒转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞, 采用Western blotting方法检测重组质粒对JAG1蛋白表达的影响;MTT比色法测定沉默JAG1对细胞生长的抑制情况;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;蛋白印记分析细胞周期蛋白1(cyclin D1)、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p-Rb、Bcl-2、Bax、Bcl-xL和cleaved caspase-3蛋白水平的变化。结果:Western blotting结果证实重组质粒可在72h内有效抑制JAG1蛋白表达;人乳腺癌MDA-MB-231细胞JAG1被沉默后,细胞的生长速度明显减慢,细胞明显阻滞于G 0/G 1期,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),cyclin D1、p-Rb、Bcl-2和Bcl-xL蛋白水平被下调(P<0.05),而p21CIP1/WAF1、p27KIP1、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论:沉默JAG1可有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,并诱导其凋亡。本研究为以JAG1为分子靶点的三阴乳腺癌治疗提供实验依据。     

靶向COL1A1基因的shRNA对乳腺癌MDA-MB-231细胞体外侵袭与迁移的影响

目的探讨Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭与转移的影响。方法设计2条shRNA干扰载体及1条阴性对照载体,分别稳定转染乳腺癌MDA-MB-231细胞。用Western blot法筛选抑制效率最高的细胞进行细胞平板集落形成实验、细胞黏附实验、细胞迁移及侵袭实验,观察COL1A1基因对MDA-MB-231细胞黏附、运动及侵袭能力的影响。结果转染pshRNA-COL1A1-2干扰载体的MDA-MB-231细胞COL1A1蛋白表达降低最明显,抑制率达66.98%±2.08%,选择该组细胞作为有效干扰组进行后续实验。pshRNA-COL1A1转染组细胞的集落形成率显著低于空白对照组和阴性质粒pshRNA-scramble转染组(P<0.05);细胞黏附实验中pshRNA-COL1A1转染组细胞的吸光度值较对照组明显降低(P<0.001);转染pshRNA-COL1A1质粒组细胞的穿膜细胞数也显著低于空白对照组和阴性质粒pshRNA-scramble转染组(P<0.001)。结论 COL1A1基因沉默可在体外抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的黏附、侵袭和迁移。     

干扰IL-8表达对乳腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响

目的探究IL-8对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学特性的影响以及作用机制。方法将siRNA IL-8转染至乳腺癌细胞中,实验分为空白对照组、阴性对照组、siRNA1 IL-8组、siRNA2 IL-8组。噻唑蓝(MTT)实验观察干扰IL-8基因表达对细胞活力的影响,Transwell小室法检测细胞侵袭、迁移能力的变化,采用荧光定量PCR(RT-PCR)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测转染后IL-8 mRNA和蛋白水平,蛋白质印迹法(Western blot)法检测Wnt/β-catenin信号通路的变化。结果与空白对照组相比,siRNA1 IL-8组、siRNA2 IL-8组乳腺癌细胞中IL-8 mRNA和蛋白表达量显著下降(P0.05);siRNA2 IL-8组细胞中IL-8 mRNA和蛋白水平较siRNA1 IL-8组显著下调(P0.05),表明siRNA2 IL-8的干扰效果较强,因此用于后续实验。干扰IL-8表达对抑制乳腺癌细胞的活力无显著影响,抑制其侵袭、迁移能力(P0.05),细胞中β-catenin、MMP-2、MMP-9的蛋白水平显著降低(P0.05)。结论干扰IL-8表达可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路从而抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭、迁移能力。     

miR-101通过抑制DNA甲基转移酶3a抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移

目的研究miR-101对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响,并分析miR-101影响乳腺癌细胞生物学行为的可能机制。方法采用实时荧光定量PCR检测miR-101和DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)在乳腺癌组织和相对应的正常乳腺组织,正常乳腺细胞以及多种乳腺癌细胞系中的表达水平,应用慢病毒介导感染的方法分别将miR-101序列及shRNA-DNMT3a转至MDAMB-231人乳腺癌细胞,通过Western blot法检测DNMT3a以及上皮钙黏素(E-cadherin)的表达,分析miR-101影响乳腺癌细胞生物学行为的可能机制。通过MTT法检测乳腺癌细胞的增殖能力,划痕实验检测乳腺癌细胞的迁移能力。结果miR-101在MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-361、HCC70乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中表达低于正常乳腺组织及MCF-10A乳腺细胞系,而DNMT3a表达则升高。Western blot实验结果显示过表达miR-101的MDA-MB-231细胞中,DNMT3a的表达明显下降,而E-cadherin的表达升高;应用shRNA-DNMT3a抑制DNMT3a表达后,E-cadherin的表达也明显升高,证实miR-101可能通过抑制DNMT3a而发挥作用。体外实验显示过表达miR-101可明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和迁移能力。结论miR-101抑制乳腺癌细胞增殖和迁移能力可能是通过抑制DNMT3a进而恢复E-cadherin表达来实现。