多配体蛋白聚糖-1对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及迁移的影响

目的探讨多配体蛋白聚糖-1(syndecan-1,SDC-1)在瘢痕疙瘩组织及成纤维细胞中表达情况及其对细胞增殖及迁移的影响。方法采用免疫组织化学方法、qRT-PCR方法及Western blot法检测瘢痕疙瘩组织及成纤维细胞中的SDC-1蛋白表达情况。接下来通过转染SDC-1 siRNA序列,使SDC-1的表达下降。通过CCK-8法检测敲减SDC-1对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响。Western blot法测定敲减SDC-1对迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响。结果 SDC-1在瘢痕疙瘩组织及成纤维细胞中呈高表达(P0.05)。与NC siRNA组相比,SDC-1 siRNA组抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,同时抑制MMP-9蛋白的表达(P0.05);而两组间MMP-2蛋白表达差异无统计学意义(P0.05)。结论 SDC-1在瘢痕疙瘩组织及成纤维细胞中高表达,敲减SDC-1可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及迁移相关蛋白的表达,这为探讨SDC-1与瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及迁移的相关研究提供了依据。     

沉默单核细胞趋化蛋白3对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖、迁移及凋亡的影响北大核心CSCD

目的:探讨沉默单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖、迁移及凋亡等功能的影响。方法:取增生性瘢痕组织和正常皮肤组织,qRT-PCR检测正常皮肤组织和增生性瘢痕组织中MCP-3 mRNA表达水平;分离培养增生性瘢痕组织成纤维细胞(HSF)和正常皮肤组织成纤维细胞(NSF),qRT-PCR和Western blot检测两种成纤维细胞中MCP-3 mRNA和蛋白表达水平。采用MCP-3干扰慢病毒(shRNA-MCP-3)和其阴性对照病毒(shRNA-NC)感染HSF,MTT检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Transwell实验检测细胞的迁移能力,qRT-PCR检测各组细胞中MCP-3、collagenⅠ和collagenⅢmRNA水平,Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白MCP-3、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3及collagenⅠ和collagenⅢ蛋白表达水平。结果:MCP-3在增生性瘢痕组织及HSF中高表达。与blank组和shRNA-NC组比较,shRNA-MCP-3组细胞中MCP-3 mRNA和蛋白表达水平显著下降(P<0.01),细胞增殖活性、迁移能力及细胞中collagenⅠ、collagenⅢ和Bcl-2表达水平均显著降低(P<0.01),同时细胞凋亡率及凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3表达水平显著上升(P<0.01)。结论:干扰MCP-3表达可能通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,减少细胞合成胶原,从而发挥抑制瘢痕形成与发展的作用。     

紫外线对人皮肤成纤维细胞中Hrd1及Nrf2表达的影响

目的探讨紫外线(UV)照射对人皮肤成纤维细胞中羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白(Hrd)1及核因子E2相关因子(Nrf)2表达的影响及可能机制。方法共收集12份人皮肤组织标本,曝光及非曝光部位标本各6份,免疫组化检测2组Hrd1及Nrf2的表达。将体外培养人皮肤成纤维细胞分为对照组、UVA组、UVB组,照光后用Western blot法检测各组成纤维细胞中Hrd1及Nrf2的表达。应用Hrd1-siRNA转染体外培养人皮肤成纤维细胞,下调细胞中Hrd1的表达后,Western blot检测成纤维细胞Nrf2的表达。应用免疫荧光分析检测细胞中Hrd1与Nrf2在细胞中的共定位情况,应用免疫共沉淀检测体外培养人成纤维细胞中Hrd1与Nrf2是否存在内源性结合。结果临床标本实验中,曝光部位皮肤组织中Hrd1表达(0.4756±0.0785)明显高于避光部位(0.1270±0.0253,t=7.317,P<0.05),曝光部位皮肤组织中Nrf2表达(0.1190±0.0217)明显低于避光部位(0.2629±0.0263,t=7.306,P<0.05)。体外培养成纤维细胞实验中,经紫外线照射后,UVA组与对照组相比,Hrd1蛋白表达水平明显增高(t=7.227,P<0.05),Nrf2蛋白表达水平明显下降(t=6.456,P<0.05);同样,UVB组与对照组相比,Hrd1蛋白表达水平明显增高(t=2.980,P<0.05),Nrf2蛋白表达水平明显下降(t=13.52,P<0.05)。应用Hrd1-SiRNA下调体外培养人纤维细胞中Hrd1的表达后,无论是经UVA照射还是UVB照射,被下调Hrd1组细胞内Nrf2的表达较未下调组明显升高。免疫荧光分析结果显示Hrd1与Nrf2在体外培养人皮肤成纤维细胞中的均有表达,并且在细胞中存在Hrd1与Nrf2共定位。免疫共沉淀验证了Hrd1与Nrf2在体外培养人皮肤成纤维细胞中存在内源性结合。结论Hrd1与Nrf2在人皮肤成纤维细胞中存在结合,紫外线照射可通过增加细胞中Hrd1的表达从而抑制Nrf2的表达。     

线粒体融合素基因 -2 对人骶韧带成纤维细胞增殖及功能的影响

目的：研究外源性线粒体融合素基因-2（Mfn2）表达对骶韧带成纤维细胞的增殖及其合成前胶原蛋白功能的影响。方法：取新鲜骶韧带组织,用组织块法在体外培养出成纤维细胞。将第2～4代细胞分组：转染LV-Mfn2-GFP组（Mfn2＋组）,转染LV-GFP组（Mfn2-组）和未转染组（对照组）。流式细胞仪检测细胞绿色荧光蛋白（GFP）表达,RT-PCR和Western blot检测Mfn2表达。细胞计数和cck-8法检测Mfn2对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期分布。RT-PCR和Western blot检测细胞前胶原1 A1/1A2/3A1的表达。结果：转染慢病毒的成纤维细胞GFP蛋白表达率73.2％～79.1％,转染Mfn2＋组成纤维细胞稳定高表达Mfn2蛋白,显著高于Mfn2-组和对照组（P＜0.05,both）。cck-8实验提示,转染表达Mfn2基因96h后,成纤维细胞增殖明显受到抑制,Mfn2＋组细胞数显著低于 Mfn2-组和未转染组（P＜0.05 both）;DNA直方图分析法测定显示转染Mfn2基因的细胞大部分停滞于G0/G1期,Mfn2＋组G0/G1期细胞比例（60.7％±3.26％）,显著高于 Mfn2-组（43.2％±3.32％）和对照组（40.8％±2.28％）,（P＜0.05, both）。半定量RT-PCR和Western blot示Mfn2＋组成纤维细胞合成表达前胶原1A1/1A2/3A1显著低于Mfn2-组和对照组（P＜0.05,all）。结论：Mfn2基因在体外转染成纤维细胞后,抑制细胞增殖并使成纤维细胞前胶原蛋白表达下降,可能是导致骶韧带细胞外基质减少,影响韧带纤维数量和质量的重要原因。     

氧化应激所致的人皮肤成纤维细胞衰老中β-连环蛋白的表达研究

目的 观察β-连环蛋白在氧化应激所致的人皮肤成纤维细胞衰老中的变化,探讨其在应激诱导的皮肤衰老中可能的作用.方法 从儿童包皮分离培养原代成纤维细胞,H2O2:处理第2～4代人皮肤成纤维细胞,显微镜观察其形态学改变,β-半乳糖苷酶细胞衰老试剂盒检测β-半乳糖苷酶活性,RT-PCR、Western印迹检测β连环蛋白mRNA和蛋白表达水平.结果 150 μmol/L H2O2:处理2 h后可以诱导人皮肤成纤维细胞衰老.在应激诱导的衰老(SIPS)细胞中β-半乳糖苷酶阳性率达到(37.67±1.53)%.而对照细胞中只有(2.97±0.25)%,两组差异有统计学意义(P<0.01).RT-PCR 结果显示,在对照细胞组β连环蛋白/GAPDH mRNA比值为0.59±0.04,SIPS细胞组为0.29±0.30,对照细胞组明显高于SIPS细胞组,两组差异有统计学意义(t=10.06,P<0.01).Western印迹结果显示,对照细胞组β连环蛋白/GAPDH蛋白比值为0.62±0.03,SIPS细胞组为0.31±0.01,对照细胞组明显高于SIPS细胞组,两组差异有统计学意义(t=14.97,P<0.0).结论 150 μmol/L H2O2:处理2 h可以诱导人皮肤成纤维细胞发生衰老改变,SIPS细胞中β连环蛋白表达水平明显降低,初步推测β连环蛋白可能是调控皮肤衰老的重要靶基因.

Abstract：

Objective To observe the changes of β-catenin expression in human skin fibroblasts (HSFs) after induced by oxidative stress, and to explore its possible roles in oxidative stress-induced premature senescence (SIPS) of HSFs. Methods Fibroblasts were isolated from the foreskin of a child and subjected to a primary culture. The fibroblasts of second to fourth passage were treated with various concentrations of H2O2 for 2 hours to establish an optimized model of stress-induced premature senescence, β-galactosidase assay kit was used to detect the activity of β-galactosidase in H2O2rinduced HSFs, RT-PCR and Western blot to measure the mRNA and protein expressions of β-catenin in control and senescent HSFs. Results Premature senescence of HSFs could be induced by the treatment with H2O2 of 150 μmol/L for 2 hours. The proportion of β-galactosidase-positive cells was (2.97 ± 0.25)% in control HSFs and (37.67 ± 1.53)% in senescent HSFs (P< 0.01). A significant increase was observed in the β-catenin/GAPDH protein ratio and β-catenin/GAPDH mRNA ratio in control HSFs compared with the senescent HSFs (0.62 ± 0.03 vs. 0.31 ± 0.01, t = 14.97, P < 0.01; 0.59 ± 0.04 vs. 0.29 ± 0.30, t = 10.06, P < 0.01). Conclusions The two-hour treatment with H2O2 of 150 μmol/L could induce the premature senescence of HSFs, and there is a notable decrease in the expression of β-catenin in prematurely senescent HSFs induced by oxidative stress, implying that β-catenin is an important target gene for the regulation of skin aging.     

中波紫外线诱导的提前衰老成纤维细胞上清液对人真皮成纤维细胞增殖、老化及自噬的影响

目的 观察中波紫外线诱导的提前衰老的成纤维细胞条件培养液对人真皮成纤维细胞增殖、老化及自噬的影响.方法 取健康青少年男子环切术后包皮进行人真皮成纤维细胞的分离培养.将中波紫外线诱导的提前衰老的成纤维细胞条件培养液培养成纤维细胞设为实验组,并设立对照组即正常成纤维细胞条件培养液培养成纤维细胞.处理20 d后,用CCK8法检测细胞增殖活性,EDU(5-乙炔基-2,脱氧尿嘧啶核苷)法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,β半乳糖苷酶染色计算衰老细胞百分比,吖啶橙染色检测细胞自噬,Western印迹法及间接免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3-B的表达水平.数据采用Graphpad Prism 5软件分析,两组间比较采用成组t检验.结果 实验组成纤维细胞增殖活力(0.831±0.017)明显低于对照组(0.973±0.017),但EDU染色及流式细胞仪检测结果均显示,实验组S期细胞百分比明显高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).β半乳糖苷酶染色显示,实验组成纤维细胞阳性率(25.710％±0.304％)高于对照组(5.257％±1.023％),差异有统计学意义(t=19.170,P＜0.05).吖啶橙染色结果显示,实验组成纤维细胞红色荧光量(14.287±2.269)低于对照组(29.614±2.650).Western印迹及间接免疫荧光结果均显示,实验组成纤维细胞LC3-B表达量明显高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 中波紫外线诱导的提前衰老成纤维细胞的条件培养液可降低成纤维细胞的自噬及增殖,并加速其老化.     

组织蛋白酶D绿色荧光蛋白复合质粒转染慢性光损伤成纤维细胞的研究

目的 探讨组织蛋白酶D绿色荧光蛋白复合质粒（GFP-CatD）技术在成纤维细胞慢性光损伤研究中的作用。 方法 长波紫外线（UVA）25 J/cm2每天照射人皮肤成纤维细胞1次,共21 d,构建慢性光损伤成纤维细胞模型。构建GFP-CatD质粒,将其转染入慢性光损伤成纤维细胞,荧光显微镜观察绿色荧光标记的组织蛋白酶D表达,Western印迹检测组织蛋白酶D表达,流式细胞仪检测转染GFP-CatD后的慢性光损伤成纤维细胞凋亡率,噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖率。 结果 慢性光损伤成纤维细胞转染GFP-CatD质粒96 h,可见绿色荧光蛋白组织蛋白酶D在慢性光损伤细胞胞质内表达。Western印迹结果显示,慢性光损伤成纤维细胞转染GFP-CatD质粒后,组织蛋白酶 D蛋白表达为未转染细胞的1.28倍。细胞凋亡检测结果发现,转染后的光老化成纤维细胞凋亡细胞率为4.29% ± 1.30%,与无转染的空白对照组凋亡细胞率3.03% ± 1.70%比较,差异无统计学意义（P > 0.05）。MTT细胞增殖检测结果发现,转染后的光老化成纤维细胞的细胞增殖率为45.20% ± 4.70%,无转染质粒的光老化成纤维细胞为43.60% ± 3.90%（P > 0.05）。 结论 GFP-CatD复合质粒转染慢性光损伤成纤维细胞可示踪到组织蛋白酶 D荧光蛋白,且不影响慢性光损伤成纤维细胞原有的正常生物活性和周期。     

葡萄籽提取物原花青素对长波紫外线诱导皮肤成纤维细胞表达TGF-βRⅡ与Smad7的影响

目的观察不同浓度葡萄籽提取物原花青素(GSPE)对长波紫外线(UVA)诱导人皮肤成纤维细胞表达转化生长因子-β(TGF-β)Ⅱ型受体和Smad7蛋白的影响。方法本实验选用体外培养的人皮肤成纤维细胞株(HSFs)为研究对象,实验主要分3组,空白对照组,单纯光照组(UVA照射人皮肤成纤维细胞),照光加药组(UVA照射细胞后予不同浓度GSPE干预)。应用免疫细胞化学技术检测UVA照射前、后及不同浓度GSPE干预后对皮肤成纤维细胞TGF-βRⅡ和Smad7蛋白表达的情况。结果与空白对照组相比,单纯UVA光照组人皮肤成纤维细胞TGF-βRⅡ蛋白表达下降(P0.05),Smad7蛋白表达升高(P0.05);与单纯光照组相比,UVA照射后经25μg/m L、50μg/m L和100μg/m L浓度GSPE处理后,成纤维细胞TGF-βRⅡ蛋白表达水平均升高(P0.05),Smad7蛋白表达水平均下降(P0.05),且于50μg/m L和100μg/m L GSPE处理后,成纤维细胞TGF-βRⅡ和Smad7蛋白表达量均接近正常水平(P0.05)。结论适当浓度GSPE可通过显著上调TGF-βRⅡ蛋白水平以及下调Smad7蛋白水平的表达来对抗UVA抑制TGF-β/Smad信号通路的传导,进而减轻UVA所致细胞外基质的降解,延缓了皮肤光老化的进程。     

白藜芦醇对病理性瘢痕成纤维细胞mTOR信号通路相关分子表达的影响

目的观察白藜芦醇对病理性瘢痕成纤维细胞mTOR信号通路关键分子PI3K、Akt、mTOR表达的影响。方法应用免疫荧光检测PI3K、Akt、mTOR在病理性瘢痕及正常皮肤组织成纤维细胞中的表达;病理性瘢痕成纤维细胞经不同浓度白藜芦醇处理后,分别应用RT-PCR、Western Blot检测PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白的表达。结果免疫荧光检测结果显示,PI3K、Akt、mTOR在病理性瘢痕成纤维细胞中表达明显增强,且主要表达于细胞核,而在正常皮肤组织成纤维细胞中未见明显表达;RT-PCR及Western Blot检测结果显示,病理性瘢痕成纤维细胞经不同浓度的Res干预后,Akt和mTOR mRNA和蛋白表达量降低,并且呈剂量依赖关系,与对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05),而PI3K mRNA和蛋白表达量降低不明显,与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。结论白藜芦醇抑制病理性瘢痕成纤维细胞增殖的机制可能与其下调mTOR信号通路关键分子Akt、mTOR表达有关。     

组织蛋白酶B在光老化皮肤中的表达及意义

目的 探讨组织蛋白酶B在光老化皮肤中的表达意义。方法 6例成人曝光和非曝光皮肤标本,采用免疫组化法定位及对比组织蛋白酶B的表达。体外培养原代人皮肤成纤维细胞,甲氧沙林 ＋ UVA法体外诱导培养细胞光老化。衰老相关-β-半乳糖苷酶染色证明老化诱导成功。Western印迹技术及RT-PCR对比检测光老化成纤维细胞及正常成纤维细胞组织蛋白酶B蛋白及基因表达。结果 6例成人曝光和非曝光活体皮肤均见组织蛋白酶B阳性染色,和非曝光部位相比,曝光部位皮肤阳性染色A值降低。Western印迹结果示,成纤维细胞光老化诱导组蛋白表达较UVA诱导组、甲氧沙林孵育组及空白组明显下调。光老化成纤维细胞诱导后1周,组织蛋白酶B与内参的灰度比由28.099 ± 0.054下降为25.103 ± 0.102,诱导后3周灰度值进一步下降为17.693 ± 0.099。实时定量RT-PCR结果示,光老化细胞组织蛋白酶B mRNA表达下调为正常组的64％（P < 0.05）。结论 组织蛋白酶B在光老化皮肤及老化成纤维细胞中表达降低,且有时间依赖性,与光老化皮肤自我修复能力下降有关。     

强脉冲光对皮肤成纤维细胞TGF-β/Smads信号传导通路表达的影响

目的:探讨强脉冲光对皮肤成纤维细胞TGF-β/Smads信号传导通路表达的影响。方法:将原代培养人正常皮肤成纤维细胞分为2组,即强脉冲光(IPL)照射组和未用IPL照射的对照组。采用Western blot和RT-PCR法分别检测2组细胞的TGFβ受体Ⅱ、Smad4、Smad7蛋白和mRNA水平,并比较两组的差异性。结果:IPL照射后皮肤成纤维细胞的TGFβ受体Ⅱ、Smad4蛋白和mRNA表达水平均升高,Smad7蛋白和mRNA表达水平降低,与对照组比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论:IPL照射人皮肤成纤维细胞后,TGF-β/Smads信号传导通路活性增强,其在IPL非剥脱性嫩肤机制中占有重要地位。     

肉桂醛对UVA照射后体外成纤维细胞表达MMP-1,MMP-3和MAPK信号的影响

目的探讨肉桂醛对UVA照射后体外皮肤成纤维细胞表达基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)的影响。方法皮肤成纤维细胞在体外培养后,在培养基中加入不同浓度(0,5,10,20和40μM)肉桂醛,24h后MTT法检测细胞活性。皮肤成纤维细胞经肉桂醛预处理24h后再予UVA照射,Western blot法检测MMP-1,MMP-3,ERK,JNK,p38磷酸化蛋白水平。结果 0~40μM肉桂醛对成纤维细胞的活性无明显影响(P均>0.05)。肉桂醛能抑制UVA照射后成纤维细胞MAPK信号蛋白ERK,JNK,p38的活化,其也能抑制成纤维细胞表达MMP-1和MMP-3,且各浓度间作用差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论肉桂醛可能通过抑制UVA照射后成纤维细胞MAPK信号蛋白的活化来抑制MMP-1和MMP-3的表达,减少胶原降解,延缓皮肤光老化。     

雷帕霉素对人皮肤成纤维细胞光老化模型自噬及氧化应激的影响

目的分析雷帕霉素对中波紫外线(UVB)诱导的人皮肤成纤维细胞光老化模型自噬及氧化应激的影响。方法将人皮肤成纤维细胞HSF2细胞株分组培养:对照组;UVB照射组(A组),UVB+雷帕霉素0.1 mg/L组(B组),UVB+雷帕霉素1 mg/L组(C组),UVB+雷帕霉素10 mg/L组(D组)。分别采用β-半乳糖苷酶染色法和MDC染色法检测细胞衰老和自噬情况,采用Western blot分析细胞中自噬相关蛋白LC3B和Beclin1蛋白表达水平,检测细胞中ROS水平及过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)水平。结果 UVB照射可引起HSF2细胞提前衰老,自噬水平降低,ROS水平升高及氧化应激。B组细胞衰老率、自噬阳性细胞比例及细胞中p62、LC3B和Beclin1蛋白表达水平与A组比较差异无统计学意义(P0.05),但随雷帕霉素浓度升高,C、D组细胞衰老率呈下降趋势(P0.05),自噬阳性细胞比例和LC3B、 Beclin1蛋白表达水平呈升高趋势(P0.05),p62蛋白水平呈降低趋势(P0.05);B组细胞中ROS水平及CAT、SOD、POD水平与A组比较差异无统计学意义(P0.05),但随雷帕霉素浓度升高,C、D组ROS和POD水平逐渐降低至正常水平(P0.05),CAT和SOD水平逐渐升高至正常水平(P0.05)。结论雷帕霉素能够增加UVB诱导的人皮肤成纤维细胞光老化的自噬水平,减少细胞衰老,同时降低ROS水平,改善氧化应激水平。     

四氢嘧啶对人皮肤成纤维细胞衰老的影响

目的 探究四氢嘧啶(ectoine)对人皮肤成纤维细胞(HSFs)是否具有减缓衰老的功效及其具体机制。方法 采用不同浓度四氢嘧啶作用于HSFs 24 h, MTT法检测细胞活性，β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色观察细胞衰老情况，流式细胞术检测细胞调亡和活性氧(ROS)的水平，qPCR检测p16、p21、p53 mRNA的表达水平。结果 MTT结果显示，与对照组相比，各四氢嘧啶处理组对细胞无毒性作用，随着四氢嘧啶浓度增加，HSFs细胞凋亡率、ROS水平以及p16、p21、p53 mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。结论 四氢嘧啶可通过降低细胞凋亡率、抑制ROS活性和减少p16、p21、p53 mRNA的表达来减缓HSFs衰老，这将为今后开发以四氢嘧啶作为主要成分针对HSFs的抗衰老产品提供一定的理论依据。     

过表达YAP对过氧化氢诱导皮肤成纤维细胞氧化损伤的影响

目的研究过表达Yes相关蛋白(YAP)对过氧化氢(H_2O_2)诱导皮肤成纤维细胞氧化损伤的影响。方法皮肤成纤维细胞中转染pcDNA3.1-YAP质粒、对照pcDNA3.1质粒,经过H_2O_2处理后记为pcDNA3.1-YAP+H_2O_2、pcDNA3.1+H_2O_2,同时设置不转染的皮肤成纤维细胞经H_2O_2处理后记为H_2O_2,以不做任何处理的皮肤成纤维细胞作为对照。Real-time PCR和Western blot方法检测细胞中YAP表达变化,MTT检测细胞增殖,2,4-二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)蛋白水平,钼酸铵比色法检测过氧化氢酶(CAT)活性,硫代巴比妥酸法检测细胞中丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,二硫对二硝基苯甲酸比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,羟脯氨酸法检测胶原合成水平。结果 pcDNA3.1-YAP+H_2O_2细胞中YAP水平高于pcDNA3.1+H_2O_2和对照(P0.05)。H_2O_2细胞增殖能力降低,LDH漏出率升高,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,CAT活性、SOD活性、GSH-PX活性降低,细胞中MDA含量升高,胶原含量降低,与对照比较,差异有统计学意义(P0.05)。pcDNA3.1-YAP+H_2O_2细胞增殖能力升高,LDH漏出率降低,细胞凋亡率降低,细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平降低,CAT活性、SOD活性、GSH-PX活性升高,细胞中MDA含量降低,胶原含量升高,与pcDNA3.1+H_2O_2和H_2O_2比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论过表达YAP可以减轻H_2O_2诱导的皮肤成纤维细胞氧化损伤,减少细胞凋亡。     

二聚糖对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的影响

目的探讨二聚糖(biglycan, BGN)在瘢痕疙瘩中的表达及其对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的影响。方法应用免疫组织化学及Western blot检测BGN在瘢痕疙瘩组织及瘢痕疙瘩成纤维细胞中的蛋白表达。采用siRNA的方法对BGN基因进行敲减,利用体外细胞划痕实验方法观察瘢痕疙瘩成纤维细胞的移行能力。结果免疫组织化学与Western blot结果显示,与瘢痕疙瘩旁正常皮肤组织比较,BGN在瘢痕疙瘩组织中表达增高,与正常皮肤成纤维细胞比较,BGN在瘢痕疙瘩成纤维细胞内和外液中表达增高。敲减BGN基因可显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的移行能力。结论敲减BGN有明显的抗瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移作用。     

强脉冲光对皮肤成纤维细胞 TGF-β／Smads信号传导通路表达的影响

目的：探讨强脉冲光对皮肤成纤维细胞TGF-β／Smads信号传导通路表达的影响。方法：将原代培养人正常皮肤成纤维细胞分为2组,即强脉冲光（ IPL）照射组和未用 IPL照射的对照组。采用Western blot和RT-PCR法分别检测2组细胞的TGFβ受体Ⅱ、Smad4、Smad7蛋白和mRNA水平,并比较两组的差异性。结果：IPL照射后皮肤成纤维细胞的TGFβ受体Ⅱ、Smad4蛋白和mRNA表达水平均升高,Smad7蛋白和mRNA表达水平降低,与对照组比较差异均有统计学意义（ P值均＜0.05）。结论：IPL照射人皮肤成纤维细胞后,TGF-β／Smads信号传导通路活性增强,其在IPL非剥脱性嫩肤机制中占有重要地位。     

RNA干扰p53基因表达对人皮肤成纤维细胞衰老的影响

目的 建立抑制p53基因表达的人皮肤成纤维细胞（HSF）,探讨抑制p53表达对HSF衰老的影响。方法 脂质体转染法将针对p53的shRNA的真核表达质粒pGCsi-p53导入HSF中,经G418筛选抗性克隆,扩大培养,建立稳定转染克隆细胞系。用RT-PCR、实时荧光定量PCR和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。通过SA β-gal染色法检测细胞衰老,MTT法检测细胞增殖能力。 结果 成功建立RNA干扰抑制p53表达的HSF细胞系,转染细胞中p53基因及蛋白水平明显下调（P < 0.01）。SA β-gal染色结果显示,转染组衰老细胞百分比（13.47% ± 1.01%）与对照组（18.10% ± 0.66%）相比降低（P < 0.05）,MTT检测结果显示,转染组细胞增殖能力较对照组加快（P < 0.05）。结论 抑制p53表达能够延迟HSF的衰老,促进细胞增殖。     

UVB照射对皮肤成纤维细胞产生受体相互作用蛋白-1的影响

目的:评价UVB照射对培养皮肤成纤维细胞受体相互作用蛋白-1(RIP-1)的影响.方法:采用150 mJ/cm2 UVB照射体外培养的人皮肤成纤维细胞,照射后12、24、36和48 h,MTT法检测细胞活性,RT-PCR法检测细胞中RIP-1 mRNA的变化,Western blot检测RIP-1蛋白水平.结果: UVB照射后,细胞活性进行性下降,RIP-1 mRNA逐渐减少,RIP-1蛋白含量逐渐升高.结论: 在UVB引起的皮肤成纤维细胞急性损伤过程中,RIP-1可能发挥着重要作用.     

SIRT6对老年人皮肤成纤维细胞迁移能力和增殖能力的影响及机制研究

目的 探讨沉默信息调节因子2同源类似物6（SIRT6）对老年人皮肤成纤维细胞迁移能力和增殖能力的影响及机制。方法 在山西医科大学第二附属医院泌尿外科取不同年龄患者包皮环切术切取的包皮组织,其中老年组8例,青年组8例。用胶原酶消化法提取人皮肤成纤维细胞,Western印迹法检测不同年龄组人皮肤成纤维细胞中SIRT6和磷酸化p65蛋白（p-p65）的表达,划痕实验检测细胞迁移活性,CCK8法检测细胞增殖活性。将老年组皮肤成纤维细胞分成两组,一组用SIRT6慢病毒感染使其SIRT6表达增高作为SIRT6组,另一组以空病毒感染作为对照组,用上述方法分别检测SIRT6组和对照组细胞迁移活性、增殖活性和p-p65蛋白表达水平,实时PCR检测两组Ⅰ型和Ⅲ胶原蛋白、整合素亚基α3、α5和β1 mRNA的表达。采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析,t检验分析两组之间数据的差异。结果 老年组皮肤成纤维细胞SIRT6表达水平（0.434 ± 0.179）显著低于青年组（1.000 ± 0.067,t = 3.040,P = 0.012）,p-p65表达水平（1.694 ± 0.148）显著高于青年组（1.000 ± 0.093, t = 2.949,P = 0.015）,迁移率（43.81% ± 18.84%）显著低于青年组（94.63% ± 12.32%,t = 5.903,P = 0.003）,24、48 h增殖活性也较青年组显著下降（P < 0.05）。老年组成纤维细胞过表达SIRT6后,与对照组相比,p-p65表达显著下降（P < 0.05）,迁移能力和增殖能力显著提高（P < 0.05）,同时Ⅲ胶原蛋白和整合素亚基α3、α5和β1的mRNA表达水平显著升高（P < 0.05）。结论 SIRT6可提高老年人成纤维细胞的迁移能力和增殖能力,其机制可能与抑制NF-κB通路有关。