蜕膜巨噬细胞经外泌体调控滋养细胞生物学行为参与不明原因复发性流产的作用机制分析

目的研究蜕膜巨噬细胞经外泌体调控滋养细胞生物学行为参与不明原因复发性流产的作用机制。方法采集从2018年1月～2019年2月于我院接受诊治的50例URSA患者蜕膜组织,记作实验组。另取同期于我院进行人工流产的50例孕早期女性蜕膜细胞组织作为对照组。以免疫磁珠法完成巨噬细胞的分选。借助透射电镜观察蜕膜巨噬细胞形态,以Western blot法检测外泌体标记蛋白CD63的表达。采用荧光显微镜观察外泌体是否可被滋养细胞所摄取。将两组不同蜕膜巨噬细胞外泌体和滋养细胞HTR8/Snveo共培养,以MTS法检测培养1～3d时HTR8/Snveo细胞的活力。采用Transwell迁移实验检测共培养3d后HTR8/Snveo细胞的迁移能力。结果在透射电子显微镜下观察发现,外泌体的形状为椭圆形,直径在40～80nm之间,且经Western blot法检测结果发现,蜕膜巨噬细胞外泌体存在明显的CD63高表达。将经PKH67染色处理的蜕膜巨噬细胞外泌体和滋养细胞HTR8/Snveo共培养,在荧光显微镜观察下发现:HTR8/Snveo胞质内存在荧光,提示了外泌体可被滋养细胞所摄取。实验组蜕膜巨噬细胞外泌体共培养2d、3d时的HTR8/Snveo活力低于对照组(均P0.05)。实验组HTR8/Snveo细胞迁移数少于对照组(P0.05)。结论蜕膜巨噬细胞经外泌体对滋养细胞的活力以及迁移能力均产生不同程度的抑制作用,继而可能引起胚胎的发育停止,进一步达到介导URSA发生的目的。     

肝癌细胞外泌体诱导巨噬细胞M2极化后促进肝癌细胞迁移及侵袭

目的：探讨外泌体在肝细胞癌（HCC）细胞与巨噬细胞间是否存在活性物质交通作用，分析肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）与HCC细胞转移的关系及机制。方法：采用超速离心法从Huh-7和RAW264.7细胞的培养基中提取外泌体，Western blot和透射电镜进行外泌体鉴定；激光共聚焦显微镜对外泌体与受体细胞结合内化进行追踪；qRT-PCR及ELISA检测巨噬细胞表型变化；miRNA模拟物进行功能性实验验证其作用；细胞划痕及Transwell试验检测TAMs对HCC细胞迁移及侵袭能力的影响。结果：HCC细胞外泌体可被巨噬细胞内吞；肝癌细胞外泌体及miR-151模拟物处理的巨噬细胞M2型标志物CD206、Arg-1 mRNA表达及IL-10、TGF-β蛋白表达显著高于对照组（P<0.05）;TAMs外泌体处理组HCC细胞迁移及侵袭能力高于其他组（P<0.05）。结论：HCC细胞来源外泌体miR-151可诱导巨噬细胞极化为TAMs,TAMs对肝癌细胞迁移及侵袭有促进作用。     

肝癌细胞自分泌外泌体通过TGF-β1调控自身细胞学行为北大核心CSCD

目的:研究肝癌Huh7细胞外泌体促进自身转移的机制。方法:培养肝癌Huh7细胞,分离提取外泌体并进行鉴定。将分离的外泌体与Huh7细胞共培养,Transwell比较细胞迁移和侵袭能力;检测外泌体中TGF-β1水平;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测TGF-β1、SMAD2/3、EMT相关分子表达。结果:提取的外泌体经Western blot检出CD63、TSG101条带;透射电镜检测出双侧膜结构小体;纳米粒径分析显示颗粒大小集中在100 nm左右。外泌体中检出TGF-β1。外泌体与Huh7细胞共培养,免疫荧光显示外泌体成功进入Huh7细胞。与对照组相比,共培养组细胞迁移和侵袭大幅增加,TGF-β/Smad通路相关分子活化,上皮标志物E-钙黏蛋白、p-Smad7表达下降,间充质标志物-波形蛋白表达升高。结论:肝癌Huh7细胞自分泌的外泌体通过运输TGF-β1上调TGF/Smad通路进而影响肝癌转移,探明了肝癌发展机制,为肝细胞癌治疗提供了新思路。     

脐带间充质干细胞外泌体抑制BEL7402细胞增殖与迁移

目的 研究脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)外泌体对人肝癌细胞株BEL7402细胞增殖与迁移能力的影响.方法 收集hUC-MSCs培养上清,采用超速离心法收集hUC-MSCs外泌体,利用透射电镜检测外泌体形态大小,使用纳米粒度颗粒跟踪分析仪(Nanosight,NTA)检测外泌体粒径大小,使用Western blot技术检测外泌体表面标记物表达情况;利用CCK-8实验观察hUC-MSCs外泌体作用BEL7402细胞后,细胞的增殖情况;运用Transwell迁移实验观察hUC-MSCs外泌体对BEL7402细胞迁移能力的影响.结果 从hUC-MSCs培养上清中成功分离hUC-MSCs外泌体,经检测hUC-MSCs外泌体呈茶托状结构,粒径大小位于50～150nm之间,表面标志物Alix、CD63、CD81及HSP70表达阳性.细胞功能学实验发现:与对照组相比,hUC-MSC-外泌体处理后的BEL7402细胞的增殖和迁移能力均下降.结论 hUC-MSC-外泌体抑制BEL7402细胞的增殖、迁移.     

低氧对巨噬细胞外泌体的表达及其对骨肉瘤细胞的化疗抗性影响的体外研究

目的在体外探究低氧对巨噬细胞外泌体分泌的影响及对骨肉瘤细胞顺铂耐药性的改变。方法Transwell侵袭实验检测不同氧浓度(1%O2的低氧与常氧)条件下骨肉瘤细胞MG63对巨噬细胞的趋化能力;在低氧与常氧条件下将MG63与巨噬细胞进行共培养,流式细胞术及RT-PCR检测巨噬细胞的分化;分离纯化来源于不同氧浓度条件下培养的M2型巨噬细胞外泌体,利用透射电镜、纳米粒径、Western blot进行鉴定,双免疫荧光进行示踪MG63对外泌体的摄取;克隆形成实验及流式细胞术检测来源于不同氧浓度下的巨噬细胞外泌体对MG63的增殖、凋亡影响;CCK-8检测来源于不同氧浓度下的巨噬细胞外泌体对MG63顺铂耐药性的影响。结果低氧能够促进骨肉瘤细胞对巨噬细胞的趋化能力,并进一步诱导巨噬细胞向M2型分化;成功分离不同氧浓度下培养的M2巨噬细胞外泌体,且低氧能够显著上调巨噬细胞对外泌体的分泌;低氧能够明显上调巨噬细胞外泌体对骨肉瘤细胞增殖能力的促进作用,抑制骨肉瘤细胞发生凋亡,并上调骨肉细胞对顺铂的耐药性。结论在体外低氧能够促进骨肉瘤细胞对巨噬细胞的趋化能力,并进一步通过诱导巨噬细胞向M2型分化及提高M2型巨噬细胞外泌体的分泌,进而上调骨肉瘤细胞的增殖能力,抑制其凋亡,最终导致骨肉瘤细胞产生顺铂耐药性。     

肺腺癌细胞源性外泌体活化的人THP-1巨噬细胞促进肺癌细胞的侵袭

目的研究肺腺癌细胞来源的外泌体对巨噬细胞极化的作用及受外泌体作用后的巨噬细胞对肺癌细胞生物学行为的影响。方法提取A549和H1299肺腺癌细胞外泌体, Western blot法检测其表面标志物CD9、 CD63进行鉴定。100 ng/mL佛波酯(PMA)处理人THP-1细胞48 h,实时定量PCR检测细胞CD68的mRNA水平。200μg/mL外泌体处理贴壁巨噬细胞24 h后,实时定量PCR检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、 CD163的mRNA水平, IMMULITE 1000化学发光免疫分析仪检测白细胞介素6(IL-6)、 IL-8、 IL-10的蛋白水平;将外泌体处理后的巨噬细胞分别与A549细胞和H1299细胞共培养,通过Transwell~(TM)实验检测肺腺癌细胞侵袭能力,实时定量PCR检测基质金属蛋白酶2(MMP2)、 MMP9的mRNA水平。结果 CD9、 CD63在外泌体高表达, PMA诱导后的巨噬细胞高表达CD68,外泌体处理后的巨噬细胞iNOS表达降低, CD163、 TNF-α、 IL-6、 IL-8、 IL-10表达水平均增加;外泌体处理后的巨噬细胞与肺腺癌细胞共培养,可增强肺腺癌细胞的侵袭能力并促进MMP2、 MMP9的表达。结论肺腺癌细胞来源的外泌体可以诱导巨噬细胞极化,表现为M1/M2的混合表型,进而增强肺癌细胞的自身侵袭能力。     

巨噬细胞J774A.1外泌体促进结直肠癌细胞系MC38和CT26的增殖和迁移

目的探讨巨噬细胞J774A.1分泌的外泌体对小鼠结直肠癌细胞系MC38和CT26增殖和迁移的影响及作用机制。方法应用流式细胞术对J774A.1细胞进行表型鉴定;应用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和Western blot分别检测J774A.1细胞外泌体的形态特征、大小和表面标志物;荧光显微镜下观察MC38和CT26细胞对外泌体的摄取情况;应用CCK8法检测外泌体对MC38和CT26细胞增殖作用的影响;细胞划痕实验检测MC38和CT26细胞的迁移能力;Western blot检测增殖相关通路的磷酸化蛋白p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达变化。结果 J774A.1细胞为表达细胞表面标志分子CD68和CD206的M2型巨噬细胞。J774A.1细胞的外泌体均能被结直肠癌细胞MC38和CT26摄取,而且能够促进它们增殖(P0.05)、迁移及MEK-ERK信号通路激活。结论巨噬细胞J774A.1的外泌体能够促进结直肠癌细胞系MC38和CT26的增殖及迁移,这可能与MEK-ERK信号通路的磷酸化增加有关。     

前列腺癌源性外泌体通过MMP家族蛋白酶调控骨髓源性免疫抑制细胞的迁移能力

目的探讨前列腺癌来源的外泌体(exosomes)是否通过上调骨髓源性免疫抑制细胞(MDSCs)的金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinase)MMP9、MMP2的分泌,进而增强MDSCs向外周迁移的能力。方法通过超速离心法提取鼠源性前列腺癌RM-1细胞上清中的外泌体,电镜观察外泌体的典型形态,Western blot鉴定外泌体的表面标记蛋白。流式细胞术检测荷瘤小鼠不同时间段肿瘤组织中MDSCs的比例,以及外泌体注射至正常小鼠体内后骨髓、脾脏中MDSCs的比例变化。免疫磁珠提取正常小鼠骨髓中的MDSCs,将MDSCs与RM-1-exosomes(50μg)共培养24 h后,免疫荧光观察MDSCs对外泌体的摄取情况。Western blot检测MDSCs表达MMP9、MMP2蛋白的情况,并用侵袭迁移实验检测MDSC与外泌体共培养前后的穿透能力。结果电镜下观察RM-1来源的外泌体呈典型椭圆碟形结构,直径约为30～100 nm。其表面标志蛋白CD63、HSP70、TSG101高表达验证了提取物质为外泌体。MDSCs与外泌体共培养后,免疫荧光可观察到MDSCs能大量摄取RM-1-exosome,侵袭迁移实验显示共培养后的MDSCs穿透基底膜的能力显著增强(P0.05)。Western blot验证了共培养后的MDSCs表达MMP9、MMP2蛋白较空白组明显升高(P0.05)。结论前列腺癌细胞来源的外泌体可通过增加MDSCs分泌MMP9、MMP2蛋白从而增强MDSCs向外周迁移的能力。     

外泌体介导miR-106a转运对胃癌细胞腹膜种植转移的影响

目的探讨肿瘤源性外泌体(tumor-derived exosomes, TDEs)介导miR-106a转运对胃癌细胞腹膜种植的影响及可能机制。方法选择人低分化胃癌细胞系AGS进行培养,从细胞培养上清液中提取外泌体,透射电镜及蛋白质印迹法对外泌体进行鉴定;采用Real-time PCR检测外泌体与细胞内miR-106a的表达差异;将外泌体标记荧光染料PKH26与人腹膜间皮细胞HMrSV5共培养,采用激光共聚焦显微镜观察外泌体的吞噬;增设阴性对照组,划痕实验检测外泌体介导下miR-106a转运对间皮细胞迁移能力的影响,Real-time PCR和Western blot检测miR-106a靶基因Smad7及间质标志物α-SMA的表达。结果透射电镜显示AGS细胞培养上清液中所提取的微囊泡直径30～150 nm,Western blot显示外泌体标记蛋白CD9、CD81均为阳性。Real-time PCR结果显示外泌体miR-106a表达量显著高于细胞内(P0.05)。携带PKH26红色荧光信号的外泌体可被间皮细胞摄取。划痕实验结果显示外泌体处理组间皮细胞迁移能力明显增强(P0.001),Real-time PCR和Western blot检测结果显示靶基因Smad7表达下调,α-SMA表达上调(P0.001)。结论胃癌细胞来源的外泌体可促进腹膜间皮细胞迁移,参与转移前微环境形成,其机制可能与外泌体介导miR-106a转运,转录后抑制Smad7表达并诱导间质转化相关。     

M2型巨噬细胞来源外泌体对乳腺癌细胞系4T1干性特征的影响

目的探讨M2型巨噬细胞来源的外泌体对乳腺癌细胞系4T1细胞肿瘤干性特征的影响。方法用超速离心法分离M2型巨噬细胞来源的外泌体;用透射电子显微镜、纳米粒子追踪技术,Western blot等对其进行鉴定;然后以乳腺癌细胞系4T1为肿瘤模型,使用Dil染料标记M2型巨噬细胞来源的外泌体,通过免疫荧光技术观察其能否进入4T1细胞。此外,用流式细胞计量术、共培养体系和Transwell实验探究在M2型巨噬细胞来源的外泌体影响下的4T1细胞的干性特征。结果 M2型巨噬细胞在体外被成功诱导,分离并鉴定了M2型巨噬细胞来源的外泌体。通过免疫荧光,看到Dil标记的外泌体可成功进入4T1细胞。M2型巨噬细胞来源的外泌体与4T1细胞共孵育后,可明显增强4T1细胞的迁移能力(P0.001)和成球能力(P0.05);外泌体抑制剂GW4869可明显抑制4T1细胞的成球能力(P0.05)。同时,M2型巨噬细胞来源的外泌体可明显增加4T1细胞中CD44~(high)CD24~(low)细胞的比例(P0.001)。结论 M2型巨噬细胞来源的外泌体能够促进4T1肿瘤细胞的迁移和成球能力,并明显增加4T1细胞中肿瘤干细胞的比例。     

M1型巨噬细胞源外泌体增强卵泡膜细胞的活力

目的:探讨M1型巨噬细胞源外泌体对卵泡膜细胞活力的影响及其作用机制。方法:采用脂多糖(LPS)处理Raw264.7小鼠巨噬细胞,构建M1型巨噬细胞模型及巨噬细胞-卵泡膜细胞共培养体系。超速离心法分离巨噬细胞分泌的外泌体;通过电镜、Western blot和纳米流式检测仪鉴定外泌体。体外分离培养小鼠卵泡膜细胞,与PKH67荧光标记的外泌体共孵育,观察卵泡膜细胞摄取外泌体的情况。CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术分析细胞周期分布,q PCR及Western blot检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1B(CDKN1B)的表达。结果:在巨噬细胞-卵泡膜细胞共培养体系中,LPS诱导的M1型巨噬细胞通过外泌体增强卵泡膜细胞活力。电镜、Western blot及纳米流式检测结果显示,巨噬细胞源外泌体被成功分离。PKH67标记的外泌体与卵泡膜细胞共孵育实验证实卵泡膜细胞能摄取大量巨噬细胞源外泌体。这些外泌体可增强卵泡膜细胞的活力,使卵泡膜细胞G0/G1期比例下降,S期比例升高,且卵泡膜细胞CDKN1B的m RNA及蛋白相对表达量均明显低于对照组。结论:卵泡膜细胞能摄取巨噬细胞分泌的外泌体。M1型巨噬细胞源外泌体通过抑制CDKN1B的表达而增强卵泡膜细胞的活力。     

阿司匹林对早发子痫前期外泌体诱导滋养细胞功能的作用

目的 构建子痫外泌体细胞模型研究阿司匹林改善滋养细胞功能并预防子痫前期（PE）的作用及分子机制。方法 收集早发型PE病例14例和正常孕妇作为对照8例，提取血浆外泌体。体外培养人滋养细胞HTR-8/SVneo，分别加入不同浓度的PE外泌体造模并给予阿司匹林处理；CCK-8法检测滋养细胞增殖情况；细胞划痕和Transwell小室检测滋养细胞迁移、侵袭变化；RT-qPCR和Western blot检测血管内皮生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达水平情况；ELISA法检测孕妇血浆VEGF水平。结果 PE外泌体可以显著抑制滋养细胞活力，且PE孕妇血浆中VEGF浓度低于NC组。体外PE外泌体滋养细胞模型实验证实，与NC组相比，100μg/mL PE外泌体显著抑制滋养细胞增殖、影响滋养细胞迁移、侵袭能力，抑制内皮细胞HUVEC小管形成功能，降低VEGF的表达（P<0.001）；而给予阿司匹林处理后，滋养细胞增殖、迁移、侵袭能力以及内皮细胞小管形成功能均改善。结论 阿司匹林提高滋养细胞增殖、迁移和侵袭能力，改善PE外泌体诱导后滋养细胞功能损伤，提高VEGF水平。这为阿司匹林用于早发型PE的预防...     

黑色素瘤细胞来源的外泌体通过上调Treg的CXCR3促进其趋化

目的检测黑色素瘤细胞通过外泌体途径上调CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)CXCR3(chemokine receptor 3)受体表达,提高Treg向肿瘤免疫抑制微环境趋化的能力。方法以超速离心法纯化小鼠黑色素瘤细胞B16上清中的外泌体,透射电镜检测外泌体形态,Western blot检测外泌体标记性蛋白的表达。B16细胞荷瘤小鼠。流式细胞术检测荷瘤小鼠(1、2、3周)和尾静脉注射外泌体后脾脏、肿瘤内Treg的频率。磁珠法分离纯化小鼠的Treg;Transwell实验检测Treg的趋化能力。Western blot检测Treg的CXCR3、p-Smad2的表达水平。结果电镜结果显示,B16细胞释放的外泌体为直径30～100 nm的圆形或类圆形结构;高表达标志性蛋白CD63和Alix,不表达Calnexin。在外泌体刺激下Treg的趋化能力显著增强,但可被抗CXCR3的单克隆抗体阻断。Western blot结果显示外泌体可提高Treg细胞内Smad2的磷酸化,并上调CXCR3的表达水平,Treg的趋化能力随之增强。结论 B16细胞来源的外泌体通过Smad2磷酸化途径提高了Treg细胞内CXCR3的表达,进而增强其趋化能力。     

妊娠期糖尿病中胎盘外泌体对滋养细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

目的：探讨妊娠期糖尿病（GDM）中胎盘外泌体对滋养细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法： 选取2018 年3 月至2019 年4 月间重庆市第七人民医院50 例诊断为GDM患者（GDM组）,另选取50 例正常孕产 妇作为对照组。分离纯化GDM组和对照组孕产妇外周血血浆中的胎盘外泌体,通过透射电镜观察外泌体的形 态,纳米粒径分析检测外泌体的直径,免疫印迹检测外泌体标志性蛋白CD63、TSG101 及胎盘标志性分子胎盘 碱性磷酸酶（PLAP）的表达。PKH67染色后荧光共聚焦显微镜观察体外培养滋养细胞系对外泌体的摄取情况; 应用MTT实验检测外泌体对滋养细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测外泌体对滋养细胞周期的影响,Annexin V-FITC/PI 双染色结合流式细胞术检测外泌体对滋养细胞凋亡的影响。结果：成功从外周血中分离获得了胎盘外 泌体,形态呈典型的杯状或双凹状,直径为40 ～ 120 nm,CD63、TSG101、PLAP 表达呈阳性;与对照组相比, GDM组胎盘外泌体以浓度依赖性促进滋养细胞的增殖、细胞周期进展,并抑制滋养细胞的凋亡。结论：GDM中 胎盘外泌体可能通过促进滋养细胞的增殖、细胞周期进展,抑制滋养细胞凋亡等参与GDM的发生和发展。     

CP-25调控巨噬细胞来源的外泌体分泌对子宫内膜癌Ishikawa细胞系自噬性细胞死亡的影响

目的：探讨芍药苷-6’-O-苯磺酸酯（CP-25）通过调控巨噬细胞来源的外泌体对子宫内膜癌Ishikawa细胞自噬性细胞死亡的影响。方法：使用佛波酯（PMA）将人单核细胞THP-1诱导为巨噬细胞，并提取其外泌体，透射电子显微镜观察外泌体形态，Western blot鉴定外泌体标志蛋白表达；使用不同浓度CP-25(0.1、0.5、1.0μmol/L)干预巨噬细胞外泌体，并与Ishikawa细胞共培养24 h,CCK-8法检测各处理组Ishikawa细胞活性，Transwell小室检测各处理组Ishikawa细胞的迁移与侵袭；以自噬抑制剂3-MA干预细胞，实验分为对照组、3-MA组、Exo-CP-25组、3-MA+Exo-CP-25组，进行对应处理后，Hoechst 33342染色观察各处理组Ishikawa细胞凋亡形态，流式细胞术检测各处理组Ishikawa细胞凋亡率，透射电子显微镜观察各处理组Ishikawa细胞自噬体，免疫荧光染色检测各处理组Ishikawa细胞自噬相关标志物LC3表达，Western blot检测各处理组Ishikawa细胞自噬相关蛋白表达。结果：经鉴定成功分离了诱...     

尿毒症毒素通过刺激巨噬细胞外泌体分泌miR-22促进心肌细胞自噬

目的:探讨在尿毒症毒素微环境下巨噬细胞外泌体分泌微小RNA-22(miR-22)对心肌细胞自噬的影响。方法:收集硫酸吲哚酚(IS)刺激后的巨噬细胞源性外泌体,并将其与H9c2细胞共培养,RT-qPCR检测巨噬细胞及其分泌的外泌体中miR-22的表达水平,CCK-8法检测H9c2细胞的活力,Western blot检测外泌体表面标志蛋白CD63及自噬相关蛋白LC3和P62的表达。结果:在IS刺激下,巨噬细胞中外泌体表面标志蛋白CD63的水平显著高于对照组(P0. 05),同时IS组巨噬细胞及其分泌的外泌体中miR-22的水平较对照组显著上调(P0. 01)。随着共培养体系中巨噬细胞外泌体浓度的增大,H9c2细胞的活力逐渐降低(P0. 05),并且巨噬细胞外泌体的刺激降低了H9c2细胞P62的表达,并促进了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化,这种变化呈剂量依赖性(P0. 05)。在巨噬细胞外泌体刺激下,miR-22模拟物转染的H9c2细胞与相应阴性对照miRNA转染的细胞相比,具有更高的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率(P0. 05)及更低的P62蛋白表达量(P0. 05);而转染miR-22抑制物则产生了相反的结果。结论:IS刺激的巨噬细胞可通过外泌体途径上调心肌细胞miR-22表达,促进心肌细胞的自噬反应。     

低氧预处理脐带间充质干细胞来源的外泌体对内皮细胞功能的影响

目的:探讨低氧预处理人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)后,其释放的外泌体对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移和小管形成的影响。方法:分离、培养并鉴定hUCMSCs和HUVECs。采用超速离心法提取hUCMSCs释放的外泌体,透射电镜观察外泌体的形态,纳米颗粒跟踪分析技术检测外泌体的粒径和浓度,Western blot检测外泌体表面特异性标志蛋白。将hUCMSCs分为常氧组和低氧预处理组,用CCK-8法检测细胞活力。将HUVECs分为对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组,用EdU法检测细胞增殖能力,细胞划痕和Transwell实验检测细胞迁移能力,小管形成实验检测细胞小管形成能力。结果:与常氧组相比,低氧预处理增强hUCMSCs活力,促进其外泌体释放。与常氧外泌体组相比,低氧预处理hUCMSCs释放的外泌体增强HUVECs的增殖、迁移和小管形成能力。结论:低氧预处理hUCMSCs分泌的外泌体增强HUVECs增殖、迁移和小管形成能力。     

MDA-MB-231细胞在乏氧条件下通过外泌体传递miR-221、miR-222增强乳腺癌细胞侵袭和迁移能力

目的探讨乳腺癌细胞MDA-MB-231在乏氧条件下分泌的外泌体对肿瘤细胞侵袭和迁移的影响。方法利用差速离心法分离外泌体,并通过动态光散射和透射电镜对外泌体的粒径、形态进行表征。通过对外泌体进行PKH26染色,进而观察肿瘤细胞对外泌体的摄取情况。应用qRT-PCR法检测肿瘤细胞及外泌体中miR-221、miR-222的含量。Transwell侵袭实验和细胞划痕实验检测MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移能力。Western blot法检测MDA-MB-231细胞中上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin和vimentin)的表达。结果MDA-MB-231细胞经乏氧处理后,其侵袭和迁移能力增强,并且N-cadherin和vimentin的表达上调;乏氧处理的肿瘤细胞分泌的外泌体通过传递miR-221、miR-222,促进MDA-MB-231细胞的EMT进展。结论MDA-MB-231细胞在乏氧条件下,可以通过外泌体传递miR-221、miR-222增加癌细胞侵袭和迁移能力。     

外泌体介导miR-335-5p通过靶向LKB1对胶质瘤细胞上皮-间质转化的影响

目的 探讨外泌体中microRNA-335-5p(miR-335-5p)被胶质瘤细胞摄取并作用于肝激酶B1(liver kinase B1, LKB1)影响胶质瘤细胞侵袭的分子机制。方法 通过外泌体提取试剂盒提取外泌体;运用透射电镜、粒度仪、Western blot法鉴定分离获取的外泌体;RT-PCR检测不同肿瘤细胞来源外泌体中miR-335-5p的表达量;外泌体摄取实验检测胶质瘤细胞对外泌体的摄取情况;Transwell实验检测加入外泌体后胶质瘤细胞的侵袭能力;双荧光素酶报告实验验证miR-335-5p是否靶向结合LKB1;Transwell实验检测转染miR-335-5p mimic后胶质瘤细胞的侵袭能力;Western blot法检测转染miR-335-5p mimic后胶质瘤细胞中LKB1和上皮-间质转化相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin和vimentin)的表达水平。结果 LN229细胞来源的外泌体中miR-335-5p表达水平明显高于H4细胞来源的外泌体;过表达miR-335-5p后LN229细胞侵袭能力增强;miR-335-5p靶向结合LKB1 mRNA...     

小鼠骨髓间充质干细胞外泌体的分离与鉴定

目的探讨骨髓间充质干细胞的外泌体的分离与鉴定方法。方法通过全骨髓贴壁法培养间充质干细胞;用新兴试剂法收集外泌体,采用电镜、粒径检测、流式细胞仪和Western blot鉴定外泌体。结果第三代骨髓间充质干细胞表面CD45呈阴性表达,CD73和CD105呈阳性表达;骨髓间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形,大小不均匀,直径30~100 nm,有完整的膜结构;粒径检测显示颗粒直径主峰为61.25 nm,直径为20~200 nm的颗粒占72.4%;外泌体CD63和CD81呈阳性表达;细胞培养上清液中可检测到外泌体CD9和CD63的蛋白表达。结论在培养间充质干细胞的培养基中可以收集到外泌体,可以通过透射电镜、粒径检测、流式细胞仪和Western blot对骨髓间充质干细胞的外泌体进行鉴定。