千金藤素通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬

目的:研究千金藤素(cepharanthine)对人卵巢癌SKOV3细胞自噬的诱导作用,并探讨其可能的作用机制。方法:体外培养SKOV3细胞,CCK-8法检测cepharanthine(0、2、4、8、16和32μmol/L)对SKOV3细胞活力的影响;吖啶橙染色观察细胞酸性自噬泡;Western blot法检测cepharanthine作用后自噬相关蛋白LC3及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达的变化。结果:Cepharanthine抑制卵巢癌SKOV3细胞活力,呈一定的剂量依赖关系(P0.05)。Cepharanthine能显著增加SKOV3细胞内酸性自噬泡数量。Western blot结果表明在8和16μmol/L的cepharanthine作用下,卵巢癌SKOV3细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P0.01)。信号通路蛋白研究表明,cepharanthine显著降低p-AKT和p-mTOR的蛋白水平(P0.01),AKT和mTOR总蛋白水平均无明显变化。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可增强cepharanthine对SKOV3细胞活力的抑制作用(P0.01)。结论:Cepharanthine可诱导人卵巢癌SKOV3细胞自噬,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。     

细胞自噬在Aβ_(25-35)损伤SH-SY5Y细胞中的作用

目的:探究β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导的神经细胞损伤作用是否与调节细胞自噬相关,并基于Akt/mTOR通路对其作用机制进行初步探究。方法:5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L和25μmol/L的Aβ_(25-35)与人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞共同孵育24 h,MTT法检测细胞活力,Western blot检测细胞内微管相关蛋白1轻链3-I(LC3-I)、微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白表达情况。选用合适浓度的Aβ_(25-35),观察自噬诱导剂雷帕霉素(Rapa)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)分别与Aβ_(25-35)联用后上述指标的变化。结果:各浓度Aβ_(25-35)均能引起SH-SY5Y细胞损伤,使细胞活力下降。Aβ_(25-35)能够增加自噬标志蛋白LC3-II蛋白表达,提高LC3-II/LC3-I水平,下调Akt和mTOR蛋白磷酸化水平(P0.05)。与自噬诱导剂Rapa联用,细胞活力未见明显变化,而细胞内LC3-II蛋白表达升高,LC3-II/LC3-I明显增加,p-mTOR/mTOR明显降低(P0.05);与自噬抑制剂3-MA联用,LC3-II蛋白表达和LC3-II/LC3-I水平有下降趋势,p-Akt/Akt水平明显下降(P0.05)。结论:Aβ_(25-35)可能通过下调Akt和mTOR蛋白磷酸化水平而诱导SH-SY5Y细胞自噬状态及损伤。     

雷公藤甲素通过ERK通路诱导肺癌A549细胞自噬

目的:研究雷公藤甲素(tripchlorolide,TP)对肺癌A549细胞活力及自噬的影响,并初步探讨其作用机制。方法:应用TP作用于肺癌A549细胞后,MTT法检测细胞活力;吖啶橙染色(AO)法在荧光显微镜下观察细胞自噬状态;GFP-LC3质粒转染实验观察细胞胞质中绿色点状聚集的自噬小体;Western blot法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达情况及有关的信号通路ERK蛋白水平的变化。结果:TP可以显著抑制肺癌A549细胞的增殖(P0.05),并呈一定的剂量-时间依赖关系。TP作用于肺癌A549细胞48 h后,细胞内酸性滤泡染成亮红色荧光比例增多。GFP-LC3转染实验结果显示在100 nmol/L TP处理后,细胞胞质中出现绿色点状聚集的自噬小体,而正常培养组极少细胞有自噬小体形成;同时转染GFP-control质粒的细胞在100 nmol/L TP处理及正常培养条件下均未观察到点状聚集的自噬小体产生。TP作用于肺癌A549细胞48 h后,与对照组相比,100 nmol/L TP组LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P0.01),同时p-ERK/ERK蛋白水平也显著升高(P0.01);与100 nmol/L TP组相比,TP+3-MA组LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著下降(P0.01),同时p-ERK/ERK蛋白水平也显著下降(P0.01)。结论:TP可显著抑制肺癌A549细胞活力并诱导细胞发生自噬,这种作用可能与影响ERK的磷酸化有关。     

NVP-BEZ235诱导多囊肾大鼠胆管上皮细胞自噬的机制研究

 目的:探讨PI3K/Akt/mTOR双靶点抑制剂NVP-BEZ235诱导多囊肾(polycystic kidney,PCK)大鼠胆管上皮细胞自噬的作用。方法:免疫组化法检测p-mTOR和p-Akt在PCK大鼠胆管上皮细胞中的水平。WST-1比色法检测NVP-BEZ235对胆管细胞活力的抑制作用以及LC3、Beclin 1基因沉默和自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对细胞活力的影响。蛋白免疫印迹法检测NVP-BEZ235对PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白及自噬标志蛋白LC3和Beclin 1的变化。结果:p-mTOR和p-Akt在PCK大鼠胆管上皮细胞中显著升高,NVP-BEZ235可明显抑制胆管上皮细胞的活力,且呈浓度和时间依赖性改变(P<0.05);NVP-BEZ235明显抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的水平;并上调自噬标志蛋白LC3 II/LC3 I比值和Beclin 1蛋白的表达水平。LC3、Beclin 1基因沉默和3-MA均可明显减弱NVP-BEZ235对细胞活力的抑制作用(P<0.01)。结论:NVP-BEZ235可抑制PCK大鼠胆管上皮细胞的活力,其机制与自噬密切相关。     

黄芩素诱导乳腺癌细胞自噬

目的:考察黄芩素诱导乳腺癌细胞的自噬作用,并初步探讨其机制。方法:采用MTT实验考察黄芩素对乳腺癌MCF-7细胞和4T1细胞活力的影响,确定给药剂量。Western blot检测黄芩素(25、50和100μmol/L)及联合自噬抑制剂3-MA作用下,MCF-7细胞和4T1细胞中自噬特征蛋白LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的表达水平,流式细胞术Annexin V/PI双染法观察3-MA对黄芩素诱导MCF-7细胞和4T1细胞凋亡的影响,确认黄芩素诱导自噬的作用。通过Western blot考察自噬信号通路相关蛋白p-mTOR、mTOR、p-AKT和AKT的蛋白水平,结合AKT-mTOR激活剂EGF明确AKT-mTOR通路在黄芩素诱导乳腺癌自噬中的作用。结果:50μmol/L及其以上剂量的黄芩素可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞和4T1细胞的活力,其作用具有显著的时效和量效性。Western blot结果表明,50和100μmol/L黄芩素作用下MCF-7细胞和4T1细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例显著增强,3-MA加入后又明显降低。流式细胞术结果显示,相比黄芩素单用组,联合自噬抑制剂可促进MCF-7细胞的坏死和凋亡。通路蛋白研究表明mTOR和AKT总量不变,其活化蛋白水平在黄芩素作用下显著降低,而加入EGF后又再次增加。结论:黄芩素可通过抑制AKT-mTOR通路诱导乳腺癌MCF-7细胞和4T1细胞自噬。     

紫草素通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡和自噬

目的:观察紫草素(shikonin)对人宫颈癌HeLa细胞凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)的影响,并初步探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路在其中的可能作用。方法:以紫草素作用于HeLa细胞后,采用CCK-8检测细胞活力;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡;GFP-LC3质粒转染HeLa细胞后观察自噬小体;紫草素分别与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK共同作用后,Western blot分析检测细胞内自噬和凋亡相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 (LC3)和cleaved caspase-3表达的变化,并检测PI3K/Akt/mTOR信号通路中磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达的变化。结果:紫草素显著抑制HeLa细胞活力(P0.05)。与对照组比较,紫草素可诱导HeLa细胞凋亡(P0.05)。GFP-LC3质粒转染分析结果显示,HeLa细胞经紫草素作用后,细胞质中出现绿色点状聚集的自噬小体,而对照组细胞中极少观察到点状聚集的自噬小体形成。与紫草素组比较,紫草素+3-MA组中LC3-II/LC3-I显著降低,而cleaved caspase-3表达显著升高(P0.05);与紫草素组比较,紫草素+Z-DEVD-FMK组LC3-II/LC3-I显著升高,而cleaved caspase-3表达显著降低(P0.05)。与对照组比较,紫草素可使p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表达明显降低(P0.05)。结论:论紫草素能诱导HeLa细胞凋亡和自噬,且其凋亡及自噬具有协同作用,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

NOD8抑制人胰腺癌细胞自噬及凋亡对其自噬作用的影响

目的:探讨NOD8(也称NLRP10或PYNOD)是否能抑制胰腺癌细胞发生自噬及其可能机制,并研究凋亡对NOD8调控自噬的影响。方法:用JetPRIME阳离子聚合物将空质粒pEGFP-C2和重组质粒pEGFP-NOD8分别转染入胰腺癌Panc-1细胞,并设立空白对照组,48 h后应用Western blot检测NOD8蛋白、自噬相关蛋白(beclin-1和LC3-Ⅱ)以及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白(Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR)的表达;并采用免疫荧光染色法观察细胞LC3斑点的数量。此外,用caspase抑制剂Z-VAD-FMK作用于过表达NOD8的Panc-1细胞后,Western blot检测beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平;免疫荧光染色法观察细胞LC3斑点数量。结果:pEGFP-NOD8组细胞NOD8蛋白表达明显高于对照组和pEGFP-C2组(P0.01)。与对照组和pEGFP-C2组相比,pEGFP-NOD8组细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达及细胞LC3斑点数量显著降低;并且pEGFP-NOD8组细胞p-Akt及p-mTOR蛋白表达量显著上升(P0.01),而AKT和mTOR蛋白表达无明显差异。与pEGFP-NOD8组相比,pEGFP-NOD8+Z-VAD-FMK组细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平及LC3斑点数量显著高于pEGFP-NOD8组。结论:NOD8可抑制Panc-1细胞自噬,其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR通路有关;凋亡可增强NOD8对自噬的抑制作用。     

黄芪多糖抑制黄嘌呤氧化酶诱导的肺癌A549细胞自噬并调节自噬相关蛋白的表达

目的探讨黄芪多糖(APS)对黄嘌呤氧化酶(XOD)诱导的肺癌A549细胞的自噬作用及微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、beclin1蛋白表达的影响。方法 A549细胞分为对照组、模型组、100μg/mL APS处理组、200μg/mL APS处理组及400μg/mL APS处理组,除对照组,其余4组均需XOD诱导24 h建立自噬模型。采用透射电镜观察自噬体的形态、单丹磺酰尸胺(MDC)染色荧光显微镜观察自噬体数量的变化, Western blot法检测LC3B、mTOR、beclin1蛋白水平。结果与空白组比较,模型组细胞自噬体数量增多,且LC3B、beclin1蛋白水平升高, mTOR蛋白水平降低;与模型组比较,(200、400)μg/mL APS处理组细胞自噬体数量显著减少, LC3B、beclin1蛋白水平降低, mTOR蛋白水平升高。结论 APS可降低XOD诱导的A549肺癌细胞自噬水平,并降低LC3B、beclin1蛋白表达、增加mTOR蛋白表达。     

粉防己碱通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导卵巢癌细胞自噬

目的:研究粉防己碱(tetrandrine)对人卵巢浆液性囊腺癌SKOV3细胞活力及自噬的影响,并初步探讨其作用机制。方法:采用MTT法检测不同作用浓度的粉防己碱对SKOV3细胞活力的影响。采用吖啶橙染色法观察粉防己碱对SKOV3细胞中自噬溶酶体形成的影响。Western blot法检测粉防己碱处理前后SKOV3细胞自噬相关蛋白LC3的表达情况及相关信号通路的变化。最后,采用MTT法检测粉防己碱单用及联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对SKOV3细胞活力的影响。结果:粉防己碱可显著抑制SKOV3细胞的活力(P<0.01),作用24 h其半数抑制浓度为15.21μmol/L。吖啶橙染色结果显示,粉防己碱明显促进SKOV3细胞中自噬溶酶体的生成。Western blot实验结果显示,粉防己碱干预后,SKOV3细胞中LC3-Ⅱ和P62蛋白的表达水平明显上调;同时,粉防己碱能明显降低PI3K/AKT/mTOR信号通路中p-mTOR和p-AKT蛋白的水平(P<0.01)。自噬抑制剂3-MA增强了粉防己碱对SKOV3细胞活力的抑制作用。结论:粉防己碱可通过抑制PI3K/AKT/m...     

GSK3β抑制非小细胞肺癌细胞自噬增强放疗敏感性

目的探讨糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)在非小细胞肺癌中对自噬的调节及调节自噬对放疗敏感性的影响。方法通过Western blot检测正常支气管上皮细胞HBE和肺癌细胞A549,H460,H292,H1299,Calu1和SK-MES-1中GSK3β的表达情况。转染或抑制GSK3β的表达并经X射线照射后,通过Western blot检测磷酸腺苷蛋白激酶(AMPK),自噬标记物微管相关蛋白轻链-3(LC3)和自噬降解底物p62的蛋白表达水平。应用集落形成实验检测转染或抑制GSK3β的表达并经X射线照射后的细胞增殖能力,促进或抑制自噬并经X射线照射后的细胞增殖能力。结果在H460细胞中分别转染野生型GSK3β-WT,激酶激活型GSK3β-S9A,激酶失活型GSK3β-K85R并经X射线照射,下调AMPK和LC3表达水平,上调P62表达水平,抑制肺癌细胞的增殖能力,其中转染激活型GSK3β-S9A的作用最显著。在A549细胞中抑制GSK3β并X射线照射,上调AMPK和LC3表达水平,促进肺癌细胞的增殖能力。在H460细胞中施加自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)或自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)并经X射线照射,3-MA抑制细胞自噬水平,抑制细胞增殖能力,细胞存活能力下降更显著。结论GSK3β抑制细胞自噬,抑制细胞自噬水平可以增强非小细胞肺癌的放射敏感性。     

Rip2诱导人胰腺癌细胞自噬及其机制研究

目的:研究受体相互作用蛋白2(Rip2)是否诱导人胰腺癌细胞株Panc-1发生自噬及其作用机制。方法:用jet PRIME转染试剂将空质粒pEGFP-C2和重组质粒pEGFP-Rip2分别转染入Panc-1细胞,不做处理的细胞为对照组。转染后培养细胞48 h,采用Western blot检测Rip2、自噬相关蛋白[beclin-1和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)]及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白的表达;透射电子显微镜观察自噬体的数量。结果:转染pEGFP-Rip2的细胞Rip2蛋白表达显著增加。与对照组和pEGFP-C2组相比,pEGFP-Rip2组细胞的beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(均P0.01);在透射电子显微镜下观察发现,pEGFP-Rip2组细胞内自噬体的数量明显多于对照组和pEGFP-C2组。pEGFP-Rip2组细胞的p-Akt和p-mTOR蛋白水平明显低于对照组和pEGFP-C2组(均P0.01),而总Akt和mTOR的蛋白水平变化不明显。结论:过表达Rip2可诱导Panc-1细胞发生自噬,其作用机制可能与Rip2抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化有关。     

shRNA 沉默CCAT2 通过抑制自噬对非小细胞肺癌细胞A549 化疗敏感性的 影响

目的:探究shRNA沉默CCAT2抑制自噬对非小细胞肺癌细胞A549化疗敏感性的影响及机制。方法:细胞分为A549/DDP组、Scramble组、CCAT2 shRNA组,转染相应的shRNA处理细胞,RT-PCR检测CCAT2基因表达水平,CCK8检测A549/DDP的细胞活力,Hoeschst和流式细胞法检测细胞凋亡,Western blot检测B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活性半胱天冬酶3(cl-caspase-3)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、LC3Ⅰ、Beclin1、p62蛋白表达水平。结果:与A549细胞株相比,A549/DDP细胞株中CCAT2表达水平显著升高。与A549/DDP组相比,CCAT2 shRNA组CCAT2表达水平显著降低,细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高,凋亡相关蛋白Bax、cl-caspase-3蛋白表达水平显著升高,Bcl-2蛋白表达水平显著降低,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平比率显著降低,Beclin1蛋白表达水平降低,p62蛋白表达水平升高。结论:沉默CCAT2可提高非小细胞肺癌细胞A549株化疗敏感性,作用机制可能与抑制自噬作用有关。     

荷叶碱通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路促进自噬减少巨噬细胞泡沫化的机制研究

目的:探讨荷叶碱对泡沫细胞形成的影响及其可能的分子机制。方法:体外培养人单核-巨噬细胞系THP-1,利用氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导建立泡沫细胞模型,同时用5、10和20μmol/L荷叶碱进行干预。采用油红O染色观察细胞内脂质沉积;用试剂盒测定细胞总胆固醇含量;通过Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白水平,免疫荧光检测自噬流,透射电镜检测自噬小体,评估细胞内自噬水平及自噬相关通路的变化。利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制细胞自噬,观察荷叶碱是否通过调控自噬抑制泡沫细胞形成。结果:与正常对照组相比,Ox-LDL组细胞内脂质沉积和总胆固醇含量显著增加。与Ox-LDL组相比,荷叶碱组细胞内脂质沉积和总胆固醇含量显著减少,自噬流显著增强,自噬小体增多;3-MA处理后,荷叶碱抑制细胞泡沫化的作用被削弱。荷叶碱降低p-mTOR和p-Akt蛋白水平。结论:荷叶碱可能通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR通路促进自噬,减少细胞内脂质沉积,从而抑制泡沫细...     

重组人脑钠肽对高糖诱导下内皮细胞的作用

目的:研究重组人脑钠肽(rhBNP)对高糖环境下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的作用和机制。方法:利用高糖诱导HUVECs凋亡模型,给予rhBNP、rhBNP+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)或rhBNP+ERK通路抑制剂U0126干预,观察rhBNP对高糖诱导下HUVECs自噬、凋亡及其相关信号通路的影响。结果:体外高糖诱导HUVECs,细胞活力被抑制,细胞凋亡增加,自噬相关蛋白beclin-1表达水平和LC3-II/LC3-I比值均显著降低,ERK信号通路活性显著减弱(P0.05或P0.01)。1 mg/L rhBNP干预后细胞活力和迁移能力显著增强(P0.01),LC3-II/LC3-I比值提高(P0.05),beclin-1表达增加(P0.01),Bax/Bcl-2比值和cleaved caspase-3蛋白水平降低,ERK蛋白水平增加(P0.05)。加入ERK抑制剂后,beclin-1自噬蛋白表达减弱(P0.05),提示rhBNP可能通过激活ERK信号通路促进自噬蛋白表达进而调节HUVECs的生物学活性。结论:高糖抑制ERK信号通路,自噬降低,凋亡增加;rhBNP通过激活ERK信号通路,促进自噬发生,减少细胞凋亡,保护细胞。     

雷帕霉素通过活化MAPK促进神经胶质瘤U87-MG细胞自噬

目的:探讨雷帕霉素(Rapa)对神经胶质瘤U87-MG细胞自噬的相关作用和机制。方法:用Rapa处理U87-MG细胞,分为正常对照(NC)组(0μmol/L Rapa)及Rapa各浓度组(1、2.5、5、10、20和40μmol/L Rapa),MTT实验检测细胞活性,软琼脂集落形成实验和平板集落形成实验检测细胞集落形成能力,Western blot法检测mTOR、p-mTOR、LC3-Ⅱ、beclin-1、p-S6、p70S6K、p-MAPK及GFAP蛋白水平的变化。结果:MTT实验结果显示,Rapa显著抑制U87-MG细胞的活力,并呈现剂量依赖性(P0.05)。软琼脂和平板集落形成实验结果显示,Rapa显著抑制U87-MG细胞集落形成数(P0.05)。Western blot结果显示,Rapa处理后mTOR及p-mTOR蛋白水平降低;自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和beclin-1水平显著升高(P0.05);自噬相关信号通路分子p70S6K表达趋势呈抛物线轨迹,差异无统计学意义(P0.05);p-S6表达趋势与p70S6K相反,Rapa干预后p-S6表达显著降低,在40μmol/L Rapa干预后上升至NC组的水平;p-MAPK和GFAP水平显著增高(P0.05)。结论:Rapa通过激活MAPK促进细胞自噬,从而抑制U87-MG细胞增殖。     

AMPK/mTOR信号通路介导的自噬在血根碱抑制鼻咽癌细胞增殖中的作用研究北大核心CSCD

目的:研究血根碱(SAN)对人鼻咽癌5-8F细胞自噬和增殖的影响,并探讨5-8F细胞自噬与增殖的关系及作用机制。方法:MTT和实时无标记细胞分析技术(RTCA)检测细胞增殖;单丹磺酰戊二胺(MDC)染色和透射电镜观察自噬情况;Western blot检测蛋白表达。结果:与Control组相比,SAN可显著抑制鼻咽癌细胞增殖,降低PCNA表达,诱导自噬小体形成,降低P62表达,提高Beclin-1表达、LC3Ⅱ/Ⅰ;而抑制自噬后(3-MA预处理),SAN诱导自噬和抑制细胞增殖作用显著减弱,同时,SAN对Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、PCNA的影响改变;SAN可激活AMPK/mTOR信号通路关键蛋白AMPK、p-AMPK并抑制mTOR表达;而抑制AMPK/mTOR信号通路后(抑制剂Compound C预处理),SAN诱导自噬和抑制细胞增殖作用显著减弱。结论:SAN能够抑制人鼻咽癌5-8F细胞增殖并诱导自噬,可能通过诱导细胞自噬抑制细胞增殖,其机制可能与激活AMPK/mTOR信号通路有关。     

自噬在熊果酸抑制人肺癌PC9细胞增殖中的作用

目的:研究自噬在熊果酸(UA)抑制人肺癌PC9细胞增殖中的作用及机制。方法:应用MTT法和台盼蓝拒染法检测UA对PC9细胞增殖的影响。吖啶橙染色法在荧光显微镜下观察UA对PC9细胞自噬的影响。Western blot检测自噬相关蛋白LC3及ATG5的表达情况。采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)观察UA对PC9细胞增殖的抑制作用。结果:UA可以显著抑制PC9细胞的活力(P0.05或P0.01),随着给药剂量和时间的增加,UA对PC9细胞的生长抑制率显著上升。UA诱导PC9细胞自噬体表达增加,并诱导自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和ATG5表达的增加(P0.01)。自噬抑制剂3-MA提高了UA对PC9细胞的抑制作用(P0.01)。结论:UA抑制PC9细胞的增殖,并诱导细胞发生自噬。UA诱导PC9细胞自噬的机制有可能依赖ATG5细胞自噬途径。自噬抑制剂3-MA能够增强UA对PC9细胞的增殖抑制作用,有望为肺癌的临床治疗提供新的联合治疗方案。     

维生素D抑制细颗粒物(PM2.5)诱导的A549人肺泡上皮细胞自噬及细胞因子释放

目的 探讨维生素D(VD)在细颗粒物(PM_2.5)诱导A549人肺泡上皮细胞发生自噬过程中的作用及对上皮细胞因子产生的影响。方法 燃烧器的乙炔扩散火焰上部采集制备PM_2.5,采用PM_2.5体外处理A549细胞，并给予VD或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理。Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)及beclin-1的表达，实时荧光定量PCR检测A549细胞白细胞介素25(IL-25)、 IL-33及胸腺间质淋巴细胞生成素(TSLP)的mRNA表达，透射电镜观察自噬体的形成。结果 PM_2.5导致A549细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、 beclin-1蛋白表达增加，自噬体形成增多，给予VD处理后，PM_2.5诱导的细胞自噬水平降低；在3-MA抑制A549细胞自噬水平后，PM_2.5仍可诱导细胞自噬，且VD依然可逆转PM_2.5诱导的自噬；PM_2.5通过诱导自噬促进A549细胞分泌...     

肝素结合血凝素通过抑制A549细胞的自噬作用增强耻垢分枝杆菌的感染能力

目的将肝素结合血凝素(HBHA)重组表达于耻垢分枝杆菌(MS),鉴定其对A549细胞自噬作用的影响。方法将HBHA克隆于穿梭表达质粒pMV261,构建HBHA重组载体,电转化至MS;感染A549细胞,Western blot法鉴定A549细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况,并检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化可估计自噬的水平;利用单丹磺酰尸胺(MDC)将自噬体染色后,激光共聚焦观察细胞内自噬体变化的情况;通过MS、rMS-HBHA感染A549细胞18 h,计算胞内活菌数,鉴定感染状况。结果 rMS-HBHA经42℃热诱导成功表达HBHA蛋白;相对野生型MS,重组表达HBHA蛋白的MS(rMS-HBHA)可以显著抑制A549细胞中的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的表达,rMS-HBHA组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值为0.625显著低于MS组2.025,表明rMS-HBHA组自噬体形成受到抑制;并且rMS-HBHA感染A549细胞18 h后胞内活菌为6.3×106,明显高于MS组1×105。结论外源性HBHA可以通过抑制A549细胞的自噬作用增强MS的感染能力。     

丹酚酸B 通过mTOR / Ulk1 信号通路诱导胶质瘤细胞C6 自噬性死亡

目的:探究丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)对胶质瘤细胞自噬的作用机制。方法:不同浓度的Sal B 处理细胞,CCK8 检测细胞活性,流式检测细胞凋亡情况,Western blot 检测增殖、凋亡及自噬标记蛋白表达,免疫荧光检测LC3 含量。结果:Sal B 浓度达到100 μmol/ L 时能明显抑制细胞活性,因此,选择10、20、50 μmol/ L 三个剂量进行后续试验;Sal B 能显著促进C6 细胞凋亡和凋亡标记蛋白caspase-3、Bax 的表达,降低Bcl-2 及增殖标记蛋白Ki67 的表达水平,并具有量效关系;同时,Sal B 能显著促进自噬标记蛋白(Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1)的表达,升高LC3Ⅱ/ Ⅰ的比值,促进LC3 荧光斑点的形成并降低p62 的表达水平;此外,Sal B 可明显抑制mTOR/ Ulk1 通路蛋白mTOR 的表达,促进Ulk1 的表达。结论:Sal B 可通过mTOR/ Ulk1 信号通路诱导胶质瘤细胞自噬性死亡。