粉防己碱通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导卵巢癌细胞自噬

目的:研究粉防己碱(tetrandrine)对人卵巢浆液性囊腺癌SKOV3细胞活力及自噬的影响,并初步探讨其作用机制。方法:采用MTT法检测不同作用浓度的粉防己碱对SKOV3细胞活力的影响。采用吖啶橙染色法观察粉防己碱对SKOV3细胞中自噬溶酶体形成的影响。Western blot法检测粉防己碱处理前后SKOV3细胞自噬相关蛋白LC3的表达情况及相关信号通路的变化。最后,采用MTT法检测粉防己碱单用及联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对SKOV3细胞活力的影响。结果:粉防己碱可显著抑制SKOV3细胞的活力(P<0.01),作用24 h其半数抑制浓度为15.21μmol/L。吖啶橙染色结果显示,粉防己碱明显促进SKOV3细胞中自噬溶酶体的生成。Western blot实验结果显示,粉防己碱干预后,SKOV3细胞中LC3-Ⅱ和P62蛋白的表达水平明显上调;同时,粉防己碱能明显降低PI3K/AKT/mTOR信号通路中p-mTOR和p-AKT蛋白的水平(P<0.01)。自噬抑制剂3-MA增强了粉防己碱对SKOV3细胞活力的抑制作用。结论:粉防己碱可通过抑制PI3K/AKT/m...     

三七总皂苷通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路调控低氧高二氧化碳环境下大鼠PASMCs的自噬和增殖

目的:探讨三七总皂苷(PNS)在低氧高二氧化碳(HH)环境下对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs自噬和增殖的作用及其机制。方法:将大鼠PASMCs随机分为5组:对照(CON)组、HH组、HH+PNS组、PI3K抑制剂LY294002组(HH+LY组)及HH+PNS+LY组。CON组置于常氧细胞培养箱(21%O2、5%CO2)培养24 h,其余4组置于造模培养箱(5%O2、6%CO2)并加入各组对应的药物培养24 h。CCK-8法检测细胞活力;RT-qPCR和Western blot法检测自噬相关指标AKT、mTOR、LC3和P62的mRNA和蛋白水平;Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平;通过透射电镜观察细胞内部自噬小体形成情况。结果:与CON组比,HH组PASMCs的活力减弱,AKT、mTOR和P62的mRNA及p-AKT、p-mTOR和P62的蛋白水平降低,而LC3的mRNA和蛋白水平升高,PCNA表达上调,自噬小体数量增多(P0.05);与HH组比,HH+PNS组PASMCs的活力减弱,AKT、mTOR和P62的mRNA及p-AKT、p-mTOR和P62的蛋白水平升高,LC3的mRNA和蛋白水平降低,自噬小体数量减少,PCNA表达下调(P0.05);与HH组相比,HH+LY组PASMCs的活力减弱,AKT、mTOR和P62的mRNA及p-AKT、p-mTOR和P62的蛋白水平降低,而LC3的mRNA和蛋白水平升高,自噬小体数量增多,PCNA表达上调(P0.05);与HH+PNS组相比,HH+PNS+LY组AKT、mTOR和P62的mRNA及p-AKT、p-mTOR和P62的蛋白水平降低,LC3的mRNA和蛋白水平升高,自噬小体数量增加,PCNA表达上调(P0.05)。结论:在HH环境下,PNS可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制大鼠PASMCs的自噬和增殖。     

紫草素通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡和自噬

目的:观察紫草素(shikonin)对人宫颈癌HeLa细胞凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)的影响,并初步探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路在其中的可能作用。方法:以紫草素作用于HeLa细胞后,采用CCK-8检测细胞活力;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡;GFP-LC3质粒转染HeLa细胞后观察自噬小体;紫草素分别与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK共同作用后,Western blot分析检测细胞内自噬和凋亡相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 (LC3)和cleaved caspase-3表达的变化,并检测PI3K/Akt/mTOR信号通路中磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达的变化。结果:紫草素显著抑制HeLa细胞活力(P0.05)。与对照组比较,紫草素可诱导HeLa细胞凋亡(P0.05)。GFP-LC3质粒转染分析结果显示,HeLa细胞经紫草素作用后,细胞质中出现绿色点状聚集的自噬小体,而对照组细胞中极少观察到点状聚集的自噬小体形成。与紫草素组比较,紫草素+3-MA组中LC3-II/LC3-I显著降低,而cleaved caspase-3表达显著升高(P0.05);与紫草素组比较,紫草素+Z-DEVD-FMK组LC3-II/LC3-I显著升高,而cleaved caspase-3表达显著降低(P0.05)。与对照组比较,紫草素可使p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表达明显降低(P0.05)。结论:论紫草素能诱导HeLa细胞凋亡和自噬,且其凋亡及自噬具有协同作用,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

和厚朴酚通过mTOR信号通路诱导肺癌A549细胞自噬

目的:探讨和厚朴酚(honokiol)对人肺腺癌A549细胞自噬的诱导作用及可能的作用机制。方法:体外培养A549细胞,加入不同浓度(0、10、20、40、60和80μmol/L)的honokiol处理48 h,MTT法检测honokiol对细胞活力的影响;吖啶橙染色观察细胞酸性自噬泡情况;Western blot法检测honokiol及联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用后对自噬相关蛋白LC3及相关的信号通路mTOR蛋白表达的变化。结果:Honokiol剂量依赖地抑制肺癌A549细胞的活力(P0.05)。Honokiol处理肺癌A549细胞能显著增加细胞内发出亮红色荧光的酸性自噬泡的比例。在40μmol/L的honokiol作用下肺癌A549细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P0.01),3-MA作用则显著降低。Honokiol可显著降低p-mTOR蛋白表达水平(P0.01),而联合3-MA作用后则使p-mTOR蛋白水平显著升高(P0.01),mTOR总蛋白表达水平均无显著变化。结论:Honokiol可诱导肺癌A549细胞自噬,其机制可能与抑制mTOR信号通路相关。     

鸡内金对冠状动脉内皮细胞损伤的影响及可能机制研究

目的 探究鸡内金对冠状动脉内皮细胞(HCAEC)的影响及可能机制。方法 将HCAEC细胞分为对照组、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)组和ox-LDL+鸡内金组。CCK-8方法检测各组细胞的活力;流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。Western blot方法检测各组细胞自噬相关蛋白LC3II和p62的表达以及PI3K、Akt、mTOR的表达。结果 ox-LDL可显著抑制HCAEC的细胞活力,抑制LC3II和PI3K/Akt/mTOR的表达水平,促进凋亡和p62蛋白的表达;而鸡内金预培养则可显著缓解由ox-LDL引起的细胞活力降低和凋亡率的升高,促进自噬,激活PI3K/Akt/mTOR通路。结论 鸡内金可通过调控自噬和上调PI3K/AKT/mTOR通路减轻ox-LDL引起的冠状动脉内皮细胞损伤。     

黄芩素诱导乳腺癌细胞自噬

目的:考察黄芩素诱导乳腺癌细胞的自噬作用,并初步探讨其机制。方法:采用MTT实验考察黄芩素对乳腺癌MCF-7细胞和4T1细胞活力的影响,确定给药剂量。Western blot检测黄芩素(25、50和100μmol/L)及联合自噬抑制剂3-MA作用下,MCF-7细胞和4T1细胞中自噬特征蛋白LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的表达水平,流式细胞术Annexin V/PI双染法观察3-MA对黄芩素诱导MCF-7细胞和4T1细胞凋亡的影响,确认黄芩素诱导自噬的作用。通过Western blot考察自噬信号通路相关蛋白p-mTOR、mTOR、p-AKT和AKT的蛋白水平,结合AKT-mTOR激活剂EGF明确AKT-mTOR通路在黄芩素诱导乳腺癌自噬中的作用。结果:50μmol/L及其以上剂量的黄芩素可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞和4T1细胞的活力,其作用具有显著的时效和量效性。Western blot结果表明,50和100μmol/L黄芩素作用下MCF-7细胞和4T1细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例显著增强,3-MA加入后又明显降低。流式细胞术结果显示,相比黄芩素单用组,联合自噬抑制剂可促进MCF-7细胞的坏死和凋亡。通路蛋白研究表明mTOR和AKT总量不变,其活化蛋白水平在黄芩素作用下显著降低,而加入EGF后又再次增加。结论:黄芩素可通过抑制AKT-mTOR通路诱导乳腺癌MCF-7细胞和4T1细胞自噬。     

黄芩素抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路并诱导MGC-803细胞自噬

目的研究黄芩素(BAI)对胃癌细胞系MGC-803细胞自噬的影响。方法使用(0、 5、 15、 25、 50)μmol/L BAI处理胃癌MGC-803细胞24、 48、 72 h,噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性,吖啶橙(AO)染色结合免疫荧光细胞化学染色观察微管相关蛋白1轻链3(LC3)和P62的表达确定MGC-803细胞的自噬情况, Western blot法检测细胞LC3、 P62、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化的PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、 p-AKT的蛋白水平。结果与对照组相比, BAI可显著抑制MGC-803细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性; BAI处理的MGC-803细胞内酸性溶酶体显著增加, LC3表达增强; BAI处理后可显著降低PI3K和AKT蛋白的磷酸化, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加、上调P62蛋白的表达。结论黄芩素抑制PI3K/AKT信号通路诱导MGC-803细胞发生自噬。     

NVP-BEZ235诱导多囊肾大鼠胆管上皮细胞自噬的机制研究

 目的:探讨PI3K/Akt/mTOR双靶点抑制剂NVP-BEZ235诱导多囊肾(polycystic kidney,PCK)大鼠胆管上皮细胞自噬的作用。方法:免疫组化法检测p-mTOR和p-Akt在PCK大鼠胆管上皮细胞中的水平。WST-1比色法检测NVP-BEZ235对胆管细胞活力的抑制作用以及LC3、Beclin 1基因沉默和自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对细胞活力的影响。蛋白免疫印迹法检测NVP-BEZ235对PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白及自噬标志蛋白LC3和Beclin 1的变化。结果:p-mTOR和p-Akt在PCK大鼠胆管上皮细胞中显著升高,NVP-BEZ235可明显抑制胆管上皮细胞的活力,且呈浓度和时间依赖性改变(P<0.05);NVP-BEZ235明显抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的水平;并上调自噬标志蛋白LC3 II/LC3 I比值和Beclin 1蛋白的表达水平。LC3、Beclin 1基因沉默和3-MA均可明显减弱NVP-BEZ235对细胞活力的抑制作用(P<0.01)。结论:NVP-BEZ235可抑制PCK大鼠胆管上皮细胞的活力,其机制与自噬密切相关。     

自噬在红景天甙诱导胃癌细胞凋亡中的作用及机制

目的:探讨自噬在红景天甙诱导人胃癌细胞凋亡中的作用及机制。方法:红景天甙处理人胃癌AGS细胞,Hoechst33342染色观察凋亡形态学变化,流式细胞术检测凋亡细胞数;透射电镜观察自噬体形成,mRFP-GFP-LC3转染观察荧光自噬斑点;Western blot观察凋亡蛋白、自噬蛋白及PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达;自噬抑制剂氯喹(CQ)预处理AGS细胞,流式细胞术检测凋亡细胞数,Western blot观察凋亡相关蛋白变化,Hoechst33342染色观察凋亡形态学变化;PI3K/AKT激动剂胰岛素样生长因子(IGF-1)预处理AGS细胞,mRFP-GFP-LC3转染和Western blot分别观察自噬变化。结果:红景天甙诱导人胃癌AGS细胞自噬体形成,荧光自噬斑点增多,抑制PI3K/AKT/mTOR通路蛋白活化;CQ预处理胃癌细胞后,细胞凋亡数量显著增加,细胞核固缩现象增强,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase9表达上调;IGF-1预处理胃癌细胞明显减弱红景天甙诱导的自噬现象。结论:中药红景天甙可诱导人胃癌AGS细胞自噬,与抑制PI3K/AKT/mTOR通路相关,抑制自噬可促进红景天甙诱导的细胞凋亡。     

NOD8抑制人胰腺癌细胞自噬及凋亡对其自噬作用的影响

目的:探讨NOD8(也称NLRP10或PYNOD)是否能抑制胰腺癌细胞发生自噬及其可能机制,并研究凋亡对NOD8调控自噬的影响。方法:用JetPRIME阳离子聚合物将空质粒pEGFP-C2和重组质粒pEGFP-NOD8分别转染入胰腺癌Panc-1细胞,并设立空白对照组,48 h后应用Western blot检测NOD8蛋白、自噬相关蛋白(beclin-1和LC3-Ⅱ)以及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白(Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR)的表达;并采用免疫荧光染色法观察细胞LC3斑点的数量。此外,用caspase抑制剂Z-VAD-FMK作用于过表达NOD8的Panc-1细胞后,Western blot检测beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平;免疫荧光染色法观察细胞LC3斑点数量。结果:pEGFP-NOD8组细胞NOD8蛋白表达明显高于对照组和pEGFP-C2组(P0.01)。与对照组和pEGFP-C2组相比,pEGFP-NOD8组细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达及细胞LC3斑点数量显著降低;并且pEGFP-NOD8组细胞p-Akt及p-mTOR蛋白表达量显著上升(P0.01),而AKT和mTOR蛋白表达无明显差异。与pEGFP-NOD8组相比,pEGFP-NOD8+Z-VAD-FMK组细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平及LC3斑点数量显著高于pEGFP-NOD8组。结论:NOD8可抑制Panc-1细胞自噬,其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR通路有关;凋亡可增强NOD8对自噬的抑制作用。     

雷公藤甲素对TLR7激动剂Resiquimod诱导RAW264.7巨噬细胞自噬的影响

目的考察TLR7激动剂Resiquimod(R848)能否诱导RAW264.7细胞自噬以及雷公藤甲素对R848诱导的自噬的影响。方法用0.01、0.1、1μg/ml的TLR7激动剂R848诱导RAW264.7细胞12、24、36 h,Western blot检测自噬蛋白LC3II/I、P62、Beclin1和Atg5表达情况;RAW264.7细胞采用0.1μg/ml R848处理24 h诱导自噬后,给予5 ng/ml、10 ng/ml雷公藤甲素12、24 h对自噬相关蛋白LC3II/I、P62及通路蛋白AKT检测。结果 RAW264.7细胞采用0.1μg/ml R848处理24 h后自噬相关蛋白LC3II/I、P62、Beclin1和Atg5表达显著升高;加入不同质量浓度的TP后,LC3II/I、P62显著表达减少,通路蛋白AKT表达升高。结论TLR7激动剂R848能够诱导RAW264.7细胞自噬,而TP能够抑制R848诱导的自噬,并且该作用可能与PI3K/AKT信号通路有关。     

oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物通过激活AKT通路抑制小鼠RAW264.7细胞自噬

目的探讨氧化低密度脂蛋白/β2糖蛋白I/抗β2糖蛋白I抗体(oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体)复合物对RAW264.7小鼠巨噬细胞自噬的影响及机制。方法分别用培养基、 oxLDL、 oxLDL/β2GPI复合物、 oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物、 oxLDL/抗β2GPI抗体复合物和β2GPI/抗β2GPI抗体复合物处理RAW264.7细胞。采用Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、 P62的蛋白水平,采用携带双荧光蛋白和LC3基因的腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染巨噬细胞检测自噬体形成以及自噬流情况,采用蛋白激酶B(AKT)通路抑制剂LY294002 (50μmol/L)预处理,观察AKT通路在oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物介导的RAW264.7细胞自噬中的作用。结果 oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物能够降低LC3Ⅱ蛋白水平,减少自噬体数量,增加P62蛋白水平,阻断自噬流; LY294002预处理可部分恢复细胞自噬水平,改善自噬流阻断情况。结论oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物可以通过激活AKT通路抑制RAW264.7细胞的自噬。     

MEG3和腺苷对HepG2细胞自噬和增殖的影响

目的:研究母系表达基因3(MEG3)过表达和腺苷对人肝细胞癌HepG2细胞自噬和增殖的影响,并探讨MEG3和腺苷影响HepG2细胞自噬的可能机制和抑制细胞增殖的效果。方法:常规培养HepG2细胞,分为对照组、MEG3组(MEG3慢病毒转染)、腺苷组(1 mmol/L腺苷处理)和MEG3+腺苷组(腺苷组中加入MEG3慢病毒转染)。Western blot检测LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等蛋白的表达,MDC染色观察自噬体数量,CCK-8法观察细胞的活力,细胞计数仪检测活细胞数量。结果:与对照组比较,MEG3组和腺苷组中HepG2细胞内LC3-Ⅱ减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,mTOR表达增加,HepG2细胞的活力降低(P0.05),自噬体减少。与MEG3组和腺苷组比较,MEG3+腺苷组中HepG2细胞内LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值进一步降低,mTOR表达进一步增加,HepG2细胞的活力进一步降低,自噬体减少更加显著(P0.05或P0.01)。MEG3组和腺苷组中HepG2活细胞数在24～72 h较对照组均明显降低(P0.01),在MEG3+腺苷组中降低更为明显(P0.01)。结论:MEG3过表达和低浓度腺苷可激活mTOR通路,抑制HepG2细胞自噬和增殖。MEG3增强了腺苷对HepG2细胞的作用。     

抑制miRNA-301a表达对卵巢癌中SKOV3细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的探讨抑制miRNA-301a表达对卵巢癌中SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭的影响。方法转染miRNA-301a抑制剂抑制SKOV3细胞中miRNA-301a表达,采用CCK8法、划痕实验和Transwell实验分别检测SKOV3细胞增殖、迁移及侵袭;应用Western blot检测p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白水平。结果增殖实验、划痕实验、Transwell实验显示,抑制miRNA-301a表达能显著抑制SKOV3细胞的增殖、迁移及侵袭(P0.05),减少p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白水平(P0.05)。结论抑制miRNA-301a表达能有效抑制SKOV3细胞增殖、迁移及侵袭,其可能通过影响PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活发挥作用。     

AMPK/mTOR信号通路介导的自噬在血根碱抑制鼻咽癌细胞增殖中的作用研究北大核心CSCD

目的:研究血根碱(SAN)对人鼻咽癌5-8F细胞自噬和增殖的影响,并探讨5-8F细胞自噬与增殖的关系及作用机制。方法:MTT和实时无标记细胞分析技术(RTCA)检测细胞增殖;单丹磺酰戊二胺(MDC)染色和透射电镜观察自噬情况;Western blot检测蛋白表达。结果:与Control组相比,SAN可显著抑制鼻咽癌细胞增殖,降低PCNA表达,诱导自噬小体形成,降低P62表达,提高Beclin-1表达、LC3Ⅱ/Ⅰ;而抑制自噬后(3-MA预处理),SAN诱导自噬和抑制细胞增殖作用显著减弱,同时,SAN对Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、PCNA的影响改变;SAN可激活AMPK/mTOR信号通路关键蛋白AMPK、p-AMPK并抑制mTOR表达;而抑制AMPK/mTOR信号通路后(抑制剂Compound C预处理),SAN诱导自噬和抑制细胞增殖作用显著减弱。结论:SAN能够抑制人鼻咽癌5-8F细胞增殖并诱导自噬,可能通过诱导细胞自噬抑制细胞增殖,其机制可能与激活AMPK/mTOR信号通路有关。     

黄连素对人卵巢癌SKOV3细胞内质网应激-自噬途径的调节作用

目的:观察黄连素对人卵巢癌SKOV3细胞内质网应激-自噬途径的调节作用。方法:体外培养人卵巢癌SKOV3细胞,分别加入12.5、25、50、100、200和400μmol/L黄连素,作用12 h、24 h和48 h后,MTT法检测黄连素对SKOV3细胞活力的影响;将细胞分为对照组、黄连素(50μmol/L)组、黄连素(100μmol/L)组和黄连素(200μmol/L)组,处理SKOV3细胞24 h后,倒置相差显微镜观察黄连素对SKOV3细胞形态的影响;间接免疫荧光法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)和泛素结合蛋白p62的表达;采用Western blot法检测beclin-1、LC3、p62、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)蛋白的表达。结果:MTT结果显示,黄连素(12.5、25、50、100、200和400μmol/L)作用SKOV3细胞12 h、24 h和48 h,SKOV3细胞活力明显降低,12 h、24 h和48 h的IC_(50)分别为(764.7±0.3)μmol/L、(231.6±0.1)μmol/L和(96.2±0.1)μmol/L。激光共聚焦显微镜检测发现,LC3和p62蛋白散在分布,且荧光强度增加的同时呈现点状聚集,黄连素(200μmol/L)组可见明显增强,且有明显的共定位现象。Western blot检测结果表明,与空白对照组相比,黄连素(200μmol/L)组内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP及自噬相关蛋白beclin-1、LC3和p62表达显著上升(P0.05)。结论:黄连素可能通过调节细胞自噬促进SKOV3细胞内质网应激。     

丝氨酸羟甲基转移酶2(SHMT2)调控AMPK/mTOR通路诱导自噬促进结肠癌细胞化疗耐药

目的探讨丝氨酸羟甲基转移酶2(SHMT2)诱导自噬促进结肠癌细胞化疗耐药的机制。方法通过TCGA数据库、实时定量PCR检测结肠癌组织SHMT2 mRNA水平,免疫组织化学染色法检测结肠癌组织SHMT2的表达和分布, Western blot法检测SW480、 SW620、 HCT116、 CACO2、 RKO、 HCT8、 HT15和HT29结肠癌细胞中的SHMT2蛋白水平;在CACO2结肠癌细胞过表达SHMT2后,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性、异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测SHMT2对5-氟尿嘧啶(5-Fu)处理的结肠癌细胞的凋亡,透射电镜观察结肠癌细胞自噬小体, Western blot法检测自噬相关的信号通路微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)、 P62、裂解型多腺苷二磷酸核糖聚合酶(c-PARP)和裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)的蛋白水平,信号通路蛋白质磷酸化广谱筛选抗体芯片及Western blot法检测腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)的磷酸化水平。结果 SHMT2在结肠癌组织及细胞中高表达;过表达SHMT2后,细胞活力显著增加, LC3Ⅱ/Ⅰ比值上升;过表达SHMT2后, AMPK磷酸化水平升高, mTOR磷酸化水平降低。结论 SHMT2可能通过促进AMPK磷酸化直接或间接抑制mTOR活性诱导自噬,抑制化疗诱导的细胞凋亡,降低化疗敏感性。     

细胞自噬在Aβ_(25-35)损伤SH-SY5Y细胞中的作用

目的:探究β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导的神经细胞损伤作用是否与调节细胞自噬相关,并基于Akt/mTOR通路对其作用机制进行初步探究。方法:5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L和25μmol/L的Aβ_(25-35)与人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞共同孵育24 h,MTT法检测细胞活力,Western blot检测细胞内微管相关蛋白1轻链3-I(LC3-I)、微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白表达情况。选用合适浓度的Aβ_(25-35),观察自噬诱导剂雷帕霉素(Rapa)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)分别与Aβ_(25-35)联用后上述指标的变化。结果:各浓度Aβ_(25-35)均能引起SH-SY5Y细胞损伤,使细胞活力下降。Aβ_(25-35)能够增加自噬标志蛋白LC3-II蛋白表达,提高LC3-II/LC3-I水平,下调Akt和mTOR蛋白磷酸化水平(P0.05)。与自噬诱导剂Rapa联用,细胞活力未见明显变化,而细胞内LC3-II蛋白表达升高,LC3-II/LC3-I明显增加,p-mTOR/mTOR明显降低(P0.05);与自噬抑制剂3-MA联用,LC3-II蛋白表达和LC3-II/LC3-I水平有下降趋势,p-Akt/Akt水平明显下降(P0.05)。结论:Aβ_(25-35)可能通过下调Akt和mTOR蛋白磷酸化水平而诱导SH-SY5Y细胞自噬状态及损伤。     

乌骨藤提取物通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制黑色素瘤细胞的活力并诱导细胞凋亡

目的:探究乌骨藤提取物(Marsdenia tenacissima extract,MTE)对黑色素瘤细胞活力及凋亡的作用及机制。方法:用不同浓度(0、50、100和200 mg/L) MTE处理小鼠皮肤黑色素瘤B16-F10细胞24 h或不同浓度MTE处理不同时间(0、24、48、72和96 h),MTT法检测细胞活力。流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot法检测细胞增殖、凋亡和PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达,同时检测通路激动剂胰岛素样生长因子1(IGF-1)处理细胞后p-PI3K及细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达。结果:根据预实验结果,选择MTE作用时间为72 h。MTE浓度为100 mg/L和200 mg/L时能明显抑制B16-F10细胞活力及增殖相关蛋白Ki67和PCNA的表达,并且还可诱导B16-F10细胞凋亡,提高凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白水平;同时,MTE还可显著降低p-PI3K、p-AKT和mTOR的蛋白水平;此外,激动剂IGF-1可明显减弱MTE抑制细胞活力及诱导细胞凋亡的作用。结论:MTE可通过下调PI3K/AKT/mTOR通路活性抑制黑色素瘤细胞活力,诱导细胞凋亡。     

重组人脑钠肽对高糖诱导下内皮细胞的作用

目的:研究重组人脑钠肽(rhBNP)对高糖环境下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的作用和机制。方法:利用高糖诱导HUVECs凋亡模型,给予rhBNP、rhBNP+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)或rhBNP+ERK通路抑制剂U0126干预,观察rhBNP对高糖诱导下HUVECs自噬、凋亡及其相关信号通路的影响。结果:体外高糖诱导HUVECs,细胞活力被抑制,细胞凋亡增加,自噬相关蛋白beclin-1表达水平和LC3-II/LC3-I比值均显著降低,ERK信号通路活性显著减弱(P0.05或P0.01)。1 mg/L rhBNP干预后细胞活力和迁移能力显著增强(P0.01),LC3-II/LC3-I比值提高(P0.05),beclin-1表达增加(P0.01),Bax/Bcl-2比值和cleaved caspase-3蛋白水平降低,ERK蛋白水平增加(P0.05)。加入ERK抑制剂后,beclin-1自噬蛋白表达减弱(P0.05),提示rhBNP可能通过激活ERK信号通路促进自噬蛋白表达进而调节HUVECs的生物学活性。结论:高糖抑制ERK信号通路,自噬降低,凋亡增加;rhBNP通过激活ERK信号通路,促进自噬发生,减少细胞凋亡,保护细胞。