UVB照射对系统性红斑狼疮自噬相关基因及蛋白表达水平的影响

目的观察UVB照射对SLE患者的外周血单个核细胞(PBMC)的自噬现象,探讨UVB、自噬对SLE产生的影响。方法应用RT-q PCR,Western blotting技术在基因和蛋白水平测定活动性SLE患者外周血淋巴细胞自噬标志物Uvrag,Beclin1和LC3Ⅱ的表达水平,并通过统计学分析其内在联系,探讨自噬在SLE发病中的作用机制。结果 RT-q PCR显示:SLE患者外周血单个核细胞接受UVB照射后Uvrag,Beclin1和LC3ⅡmRNA的表达水平较照射前明显升高(P0.05);SLE患者外周血单个核细胞接受UVB照射后LC3ⅡmRNA的表达水平明显高于正常对照组接受UVB照射的水平(P0.01)。Western blotting显示:SLE患者的外周血单个核细胞接受UVB照射组较SLE患者组的外周血单个核细胞中的Uvrag,Beclin1和LC3Ⅱ的蛋白水平升高,Uvrag,Beclin1差异有统计学意义(P0.05);SLE患者的外周血单个核细胞接受UVB照射组较正常人的外周血单个核细胞接受UVB照射组的Uvrag,Beclin1和LC3Ⅱ的蛋白水平轻度升高,LC3Ⅱ差异有统计学意义(P0.05);SLE患者的外周血单个核细胞在接受UVB照射组较正常未照射UVB组的外周血单个核细胞中的Uvrag,Beclin1和LC3Ⅱ蛋白水平升高(P0.05)。结论活动性SLE患者外周血单个核细胞中存在自噬现象,UVB能够引发SLE患者发生异常自噬,自噬相关基因/蛋白参与了SLE外周血单个核细胞异常自噬的发生。     

雷帕霉素对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬诱导效应及其分子机制的初步研究

目的:初步探讨雷帕霉素在不同浓度和不同孵育时间下,对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的诱导效应及其分子机制。方法:不同浓度雷帕霉素处理HaCaT细胞4 h或12 h后,利用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测雷帕霉素对细胞活力的影响,并提取蛋白进行蛋白印迹实验,检测LC3-Ⅱ表达水平,作为自噬的检测方法;通过透射电镜分析自噬体形成,确认雷帕霉素对自噬的诱导效果。检测自噬调控上游关键元件哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表达及其se~(2481)和ser~(2448)磷酸化产物水平,分析mTOR活性;并分析自噬调控下游的另一关键基因Atg7的表达,初步分析雷帕霉素诱导HaCaT细胞的分子机制。结果:不同浓度雷帕霉素处理4 h,对HaCaT细胞的活力没有显著的影响。高剂量雷帕霉素(80 nmol/L和100 nmol/L)在处理12 h后对HaCaT细胞的活力产生毒性效应。20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h诱导HaCaT细胞LC3-Ⅱ表达上调,而20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育12 h仍具有诱导效应。相较于其他浓度,在50 nmol/L雷帕霉素孵育诱导的LC3-Ⅱ表达上调效应最为显著,并且在药物孵育4h时超微结构水平诱导产生胞质内大量自噬体形成。1~50nmol/L浓度的雷帕霉素孵育4 h或12 h均可诱导HaCaT细胞mTOR ser~(2481)和mTOR ser~(2448)磷酸化产物水平降低:然而Atg7表达不能观测到显著的差异。结论:50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h具有显著的诱导HaCaT细胞自噬效应。HaCaT细胞mTOR分子对雷帕霉素处理敏感,可被其诱导产生蛋白活化抑制效应。这种mTOR信号抑制可能参与了雷帕霉素对HaCaT细胞的自噬诱导效应,但Atg7没有参与这种调控效应。     

富氢液通过自噬途径下调中波紫外线诱导的HaCaT细胞炎症因子的表达

目的 探讨氢气是否能通过自噬途径调节中波紫外线（UVB）诱导的HaCaT细胞炎症因子的表达。 方法 将培养的HaCaT细胞分为空白对照组（不做任何处理）,氢气组（仅用富氢培养液培养）,1、10、50 mJ/cm2 UVB组,1、10、50 mJ/cm2 UVB + 氢气组,50 mJ/cm2 UVB + 3甲基腺嘌呤（3MA）组,50 mJ/cm2 UVB + 雷帕霉素组,50 mJ/cm2 UVB + 3MA + 氢气组,50 mJ/cm2 UVB + 雷帕霉素 + 氢气组。细胞经过不同处理培养12 h后,噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,LDH试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）,细胞提取蛋白检测自噬蛋白LC3和Beclin1的表达,上清液用ELISA检测炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）α、白细胞介素（IL）-1β、HMGB1和IL-6的水平。 结果 与空白对照组相比,UVB诱导的HaCaT细胞LDH释放增多,细胞活力下降,自噬蛋白LC3和Beclin1表达增加,炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6释放增加（均P < 0.05）。与UVB组相比,氢气可减少LDH释放,提高细胞活力,自噬蛋白LC3和Beclin1表达进一步增加,炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表达减少（均P < 0.05）。与50 mJ/cm2 UVB组相比,50 mJ/cm2 UVB + 3MA组炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表达进一步增加（P < 0.05）,而50 mJ/cm2 UVB + 雷帕霉素组炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表达减少（P < 0.05）。与50 mJ/cm2 UVB + 氢气组相比,50 mJ/cm2 UVB + 氢气 + 3MA组炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表达增加（P < 0.05）。 结论 UVB照射可以诱发自噬蛋白表达增加 ;富氢液可以下调UVB诱导的HaCaT细胞炎症因子的表达,而这一过程是通过激活自噬途径实现的。     

自噬在富氢液减轻UVB致皮肤成纤维细胞损伤中的作用

目的探讨自噬对富氢液减轻UVB照射导致的人皮肤成纤维细胞氧化损伤的调控作用。方法取健康男童包皮环切术后包皮,进行人真皮成纤维细胞的原代培养,将细胞分组:正常对照组(Con组);氢气对照组(Con+H_2);UVB照射组(UV组);UVB照射+富氢培养液组(UV+H_2组);UVB照射+富氢培养液+自噬抑制剂3-MA组(UV+H_2+3-MA组),各组培养6h、12h和24h,电镜观察自噬体和LC3的表达变化,根据上述结果,各组在UVB照射后培养6h后,进行相MTT、LDH、ROS、MDA和自噬蛋白Beclin-1、ATG5和P62的检测。结果与Con组和Con+H_2组比较,UV组MTT值和P62表达减少(P0.05),自噬体、LDH、ROS、MDA、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和ATG5表达增加(P0.05);与UV组比较,UV+H_2组自噬体、MTT、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和ATG5表达增加(P0.05),LDH、ROS、MDA和P62表达减少(P0.05);与UV+H_2组比较,UV+H_2+3-MA组自噬体、MTT、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和ATG5表达减少(P0.05),LDH、ROS、MDA和P62表达增加(P0.05)。结论富氢液通过激活自噬途径减轻UVB照射导致的人皮肤成纤维细胞损伤。     

沉默miR-23a对中波紫外线诱导成纤维细胞自噬的作用研究

目的探讨沉默mi R-23a对中波紫外线(UVB)诱导成纤维细胞自噬的作用。方法将成纤维细胞分为空白对照组、UVB光老化组、mi R-23a沉默组、UVB光老化+mi R-23a沉默组。吖啶橙染色检测细胞自噬,Western印迹检测自噬相关蛋白LC3-B及p62的表达水平。结果空白对照组与UVB光老化组吖啶橙染色荧光定量分别为(39.34±1.15)%、(32.22±1.40)%,2组间差异有统计学意义(P0.05);UVB光老化+mi R-23a沉默组吖啶橙染色荧光定量为(43.72±0.95)%,与UVB光老化组相比,差异有统计学意义(P0.05)。与空白对照组相比,UVB光老化组自噬相关蛋白p62表达量升高,LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ减少,2组间差异有统计学意义(P0.05);与UVB光老化组相比,UVB光老化+mi R-23a沉默组p62表达量下降,LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ增多,2组间差异有统计学意义(P0.05)。结论 UVB辐射可致成纤维细胞自噬水平下降,而沉默mi R-23a可抑制UVB诱导所致的自噬水平下降。     

Nrf2信号通路调控自噬对UVA诱导人真皮成纤维细胞凋亡的作用

目的 探讨Nrf2信号通路介导的细胞自噬在UVA诱导人皮肤成纤维细胞凋亡过程中的作用。方法 体外培养正常人皮肤成纤维细胞，分为对照组、UVA组、自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin, RAPA)组、自噬抑制3-甲基嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)组、核因子E2相关因子2(Nrf2)抑制剂(ML385)组及干涉(siRNA)组；各实验组经8 J/cm²的UVA照射；采用流式细胞术检测成纤维细胞凋亡；CCK-8检测细胞活性变化；Western blot检测细胞自噬及凋亡关键分子、p62及Nrf2蛋白表达水平。结果 经8 J/cm²的UVA照射后成纤维细胞凋亡比例增加、胞内自噬水平显著升高；自噬抑制剂3-MA处理后可显著促进UVA照射引起的成纤维细胞凋亡；而自噬促进剂RAPA处理细胞后，细胞凋亡率较UVA组相比显著降低(P<0.01);与对照组相比，UVA照射后胞核Nrf2表达显著增高；ML385阻断Nrf2入核及使用siRNA干涉Nrf2表达后，自噬关键蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ降低(P<0.01),p62表达显著减少(P&...     

非节段型白癜风患者外周血Th17细胞亚群及其自噬相关标记分子表达

目的探讨非节段型白癜风患者(non-segmental vitiligo,NSV)外周血Th17细胞亚群比例及其细胞自噬水平是否存在异常。方法分离人外周血单个核细胞(PBMC),应用流式细胞术检测40例NSV患者及20例正常人外周血Th17细胞亚群比例及其自噬相关标记分子的水平。结果 NSV快速进展期、稳定期至健康对照组外周血Th17细胞亚群比例逐渐降低,各组间差异有统计学意义(P0.05);Th17细胞自噬相关标记分子LC3B和Beclin1的水平自NSV快速进展组、稳定期组至健康对照组依次降低,而Bcl-2蛋白的水平自NSV快速进展期组、稳定期至健康对照组依次升高,各组间差异均有统计学意义(P均0.05)。结论 NSV患者外周血Th17细胞亚群计数及其自噬水平均升高,可能参与了NSV病情的发生、发展机制。     

Rap1b在子宫内膜癌组织中的表达及介导自噬调控人子宫内膜癌细胞化疗敏感性的研究

目的检测子宫内膜癌(EC)组织中Ras相关蛋白1b(Rap1b)表达,观察其对EC细胞Ishikawa化疗敏感性的影响及机制。方法选取2016年9月至2019年1月江门市中心医院诊治的60例EC患者作为研究对象。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EC组织与癌旁组织中Rap1b mRNA表达,免疫组化染色检测组织中Rap1b与自噬相关蛋白Beclin1、LC3表达。建立Ishikawa/DDP耐药细胞株,脂质体介导细胞转染法构建Rap1b低表达的Ishikawa/DDP细胞,以转染NC-siRNA的Ishikawa/DDP细胞作为阴性转染组,未转染的Ishikawa/DDP细胞作为对照组;qRT-PCR和Western blot检测细胞中Rap1b的表达;CCK-8实验检测DDP处理后细胞存活率,并计算IC50值;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫荧光染色检测LC3表达;Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1及P62蛋白表达。结果与癌旁组织比较,EC组织中Rap1b mRNA与蛋白表达均升高,Beclin1、LC3表达也升高(P0.05);与对照组和NC-siRNA组相比,Rap1b-siRNA组细胞中Rap1b mRNA和蛋白相对表达量均下降,25、50、100μmol/L DDP处理后细胞存活率下降,IC50值降低,细胞凋亡率升高,LC3荧光染色强度减弱,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率下降,Beclin1蛋白表达水平下降而P62蛋白表达水平升高(P0.05)。结论 Rap1b在EC组织中表达水平较高,降低Rap1b表达可提高Ishikawa细胞的化疗敏感性,其机制可能与抑制自噬相关。     

中波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞自噬对凋亡影响的初步研究

[目的]探讨不同剂量中波紫外线(UVB)照射人皮肤成纤维细胞诱导的自噬对细胞凋亡活性的影响.[方法]人皮肤成纤维细胞来自于23岁健康男性环切术后包皮的原代培养,连续传代培养后取第3～ 10代的细胞进行实验.通过单丹酰戊二胺(MDC)染色和免疫荧光标记微管相关蛋白1轻链3(LC3)的方法,确定不同剂量3-甲基腺嘌呤(3-MA)对自噬的抑制作用.UVB照射后立即加入0.5 mmol/L 3-MA孵育细胞4h作为自噬的抑制方法.Hoechst和碘化丙啶(PI)染色结合Annexin V-异硫氰酸荧光索(FITC)和PI标记细胞后流式细胞仪检测作为细胞凋亡的定性和定量方法.[结果]0.5 mmol/L 3-MA能明显抑制人皮肤成纤维细胞自噬活性(饥饿诱导组自噬细胞阳性百分数为63.037％±5.876％,3-MA孵育后下降至34.425％±5.183％).空白对照组、30、50、100mJ/cm2UVB照射组标记LC3绿色荧光信号逐渐增强,照射后立即对上述4组加入3-MA孵育4h则LC3蛋白表达差异不明显.0.5 mmol/L 3-MA对细胞活性影响最小.50 mJ/cm2 UVB照射下加入3-MA孵育较未加3-MA孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞增多;100 mJ/cm2 UVB照射后加3-MA孵育较未加3-MA孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞减少.Annexin V -FITC和PI标记细胞后流式细胞仪分析显示,在50 mJ/cm2 UVB照射下,抑制自噬的细胞中晚期凋亡水平[( 10.933±0.839)％]较未抑制细胞[(7.267±0.473)％]上升,两者之间差异具有统计学意义(t=5.20,P＜ 0.05);而在100mJ/cm2UVB照射下,抑制自噬的细胞中晚期凋亡水平[(7.100±0.781)％]较未抑制细胞[( 10.133±0.681)％]下降,两者之间差异具有统计学意义(t=6.29,P＜ 0.05).[结论]50 mJ/cm2 UVB照射诱导人皮肤成纤维细胞自噬通过抑制凋亡对细胞起到保护作用,而在100 mJ/cm2 UVB照射下发生的较高水平自噬可能诱导了自噬性细胞死亡.     

窄谱中波紫外线对体外培养人黑素细胞自噬水平的影响

目的 观察窄谱中波紫外线（NB?UVB）照射对黑素细胞自噬水平的影响,探讨NB?UVB治疗白癜风的可能机制。方法 体外培养正常人黑素细胞给予单次0（对照组）、50、100和200 mJ/cm2 NB?UVB照射,照射后24 h收集细胞,单丹酰戊二胺染色法（MDC）检测细胞自噬体变化,免疫印迹法检测自噬信号磷酸化磷酸腺苷蛋白激酶（p?AMPK）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p?mTOR）、微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ/Ⅰ）及P62表达变化,透射电镜观察自噬体与黑素小体超微结构变化。免疫印迹结果采用单因素方差分析进行比较,黑素小体、自噬体与自噬溶酶体数量采用Kruskal?Wallis H检验进行统计分析。结果 MDC染色显示,对照组、50、100和200 mJ/cm2 NB?UVB组自噬体染色阳性率分别为（21.83 ± 3.50）、（23.66 ± 4.12）、（38.08 ± 4.10）、（40.23 ± 1.45）%,100、200 mJ/cm2组显著高于对照组和50 mJ/cm2 NB?UVB组（均P < 0.05）。免疫印迹法显示,与对照组相比,100、200 mJ/cm2组p?AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ表达均显著上调（均P < 0.05）,而p?mTOR及P62表达均显著下降（均P < 0.05）。透射电镜结果显示,与对照组自噬体与自噬溶酶体数量（1.88 ± 1.18）相比,100、200 mJ/cm2组（5.12 ± 1.13、5.25 ± 1.04）均显著增多（P < 0.05）。50、100、200 mJ/cm2组黑素小体数量（39.12 ± 9.42、57.38 ± 7.11、59.75 ± 15.15）均较对照组（18.50 ± 4.18）显著增多（均P < 0.05）。结论 NB?UVB照射不仅可以促进黑素小体生成,还可以激活黑素细胞的自噬信号通路,促进自噬体及自噬溶酶体的形成,推测其为白癜风的治疗机制之一。     

自噬促进剂西罗莫司对中波紫外线诱导成纤维细胞提早衰老的影响

【摘要】 目的 研究自噬促进剂西罗莫司对反复亚毒性中波紫外线诱导提早衰老（UVB-SIPS）的影响。方法 人皮肤成纤维细胞分为6组,对照组、10 mg/L西罗莫司组、UVB组、UVB + 0.1 mg/L西罗莫司组、UVB + 1.0 mg/L西罗莫司组、UVB + 10.0 mg/L西罗莫司组。UVB照射剂量10 mJ/cm2每日1次共5次,对照组用含1%小牛血清的DMEM培养基培养5 d;西罗莫司组在每次换液后加入西罗莫司;西罗莫司 + UVB组在每次照射UVB后加入西罗莫司过夜。CCK-8检测细胞活性,β半乳糖苷酶化学染色法检测衰老细胞,吖啶橙染色检测细胞自噬,Western印迹检测衰老相关分子信号p53及自噬相关蛋白LC3-B及beclin 1的表达水平。数据用SPSS 16.0软件分析,多组间均数行单因素方差分析,结合t检验和LSD法。 结果 UVB + 0.1、1.0、10 mg/L西罗莫司组的细胞活性（A450值）分别为0.27 ± 0.02、0.36 ± 0.04、0.39 ± 0.04,呈浓度依赖性升高,与UVB组（0.26 ± 0.01）比较,差异均有统计学意义（均P ＜ 0．05）;3个组β半乳糖苷酶染色阳性细胞分别为92.50% ± 0.34%、42.40% ± 0.53%、6.20% ± 0.39%,与UVB组（95.10% ± 0.32%）比较,差异均有统计学意义（P ＜ 0．05）;3组吖啶橙染色荧光定量分别为36.43 ± 0.24、45.25 ± 0.33、48.69 ± 0.37,与UVB组（33.99 ± 0.32）比较,差异均有统计学意义（P ＜ 0．05 ）;3组p53、LC3-B及 beclin 1的表达与UVB组比较,差异均有统计学意义（P ＜ 0．05）。 结论 自噬促进剂西罗莫司在提高细胞自噬率的同时,可抑制UVB诱导的成纤维细胞提早衰老。 【关键词】 成纤维细胞; 细胞衰老; 紫外线; 西罗莫司; 自噬     

UVB诱导人皮肤成纤维细胞的氧化应激损伤研究

目的 观察人皮肤成纤维细胞被UVB照射后的光损伤、凋亡、周期阻滞和氧化应激损伤状态,并检测氧化应激的相关信号蛋白p66Shc的表达情况。方法 用小剂量UVB多次照射培养的人皮肤成纤维细胞,以细胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）化学染色法观察细胞衰老状态,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,ELISA法检测细胞内超氧化物歧化酶活性和丙二醛的含量,并以Western印迹法检测p66Shc蛋白的表达。结果 SA-β-Gal染色显示,培养的人皮肤成纤维细胞在UVB照射后呈强阳性染色;细胞凋亡率在未照射的对照组为0.96％,UVB照射组为37％;而细胞周期检测显示,经UVB照射的人皮肤成纤维细胞大部分阻滞于G0/G1期（80.07%）。细胞内超氧化物歧化酶水平对照组为（52.35 ± 4.97） ng/g蛋白,UVB照射组为（7.81 ± 0.68） ng/g蛋白（两组比较,P < 0.01）;而丙二醛水平两组分别为（3.52 ± 0.34） ng/g蛋白和（33.91 ± 3.20） ng/g蛋白（两组比较,P < 0.05）。人皮肤成纤维细胞经UVB照射诱导后24 h,p66Shc呈弱阳性表达,48 h后表达进一步增强。结论 培养的人皮肤成纤维细胞经UVB照射后进入氧化应激增强状态。p66Shc蛋白在此过程中表达逐渐增强。     

黑色素瘤缺乏因子2在宫颈癌组织中的表达及其通过调节自噬对宫颈癌组织转移的影响

目的探讨黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)在宫颈癌组织中的表达及机制。方法选取2017年3月至2018年5月在山东省立第三医院行宫颈癌切除术的26例患者的宫颈癌组织及癌旁组织作为研究对象,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫组化法检测宫颈癌及其癌旁组织中AIM2表达;采用RT-PCR和Western blot检测人宫颈癌细胞株Hela和正常宫颈细胞株Ect1/E6E7中AIM2 mRNA和蛋白表达;Hela细胞转染AIM2 si-RNA (si-AIM2组)和阴性对照(si-NC组),设空白对照组和3-MA干扰组(si-AIM2+3-MA组)。Western blot检测细胞中AIM2、 LC3、Beclin1和p62的蛋白表达,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。结果与癌旁组织比较,宫颈癌组织中AIM2的mRNA表达和IHC评分升高(P0.001);与Ect1/E6E7组比较,Hela组中AIM2的mRNA和蛋白表达升高(P0.001);与si-NC组比较,si-AIM2组细胞中LC3Ⅱ/LCⅠ和Beclin1蛋白表达升高(P0.001),细胞在24h、48h和72h增殖能力(P0.05)以及细胞迁移数和侵袭数(P0.001)降低,AIM2和p62蛋白表达降低(P0.001);与si-AIM2组比较,si-AIM2+3-MA组中LC3Ⅱ/LCⅠ和Beclin1蛋白表达降低(P0.001),细胞在24h、48h和72h增殖能力(P0.05)以及细胞迁移和侵袭数(P0.001)升高,p62蛋白表达升高(P0.001)。结论敲低AIM2通过诱导细胞自噬抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。     

氧化苦参碱对皮肤鳞状细胞癌Colo-16细胞株凋亡及自噬影响的研究

目的:探讨氧化苦参碱对皮肤鳞状细胞癌(c SCC)Colo-16细胞株凋亡及自噬的影响。方法:用不同浓度的氧化苦参碱处理Colo-16细胞株24 h后,用流式细胞仪测定不同浓度氧化苦参碱组Colo-16细胞株凋亡率,用免疫印迹(western blot)法测定不同浓度组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表达及LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化率。同时用western blot法检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、m TOR调节相关蛋白(Raptor)及其m TORser2448、ser2481位点磷酸化产物和Raptor ser792位点磷酸化产物的表达。结果:1.000 g/L、2.000 g/L、4.000 g/L氧化苦参碱浓度组凋亡率明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(F=355.12,P0.05),不同浓度组之间凋亡率差异也有统计学意义(P0.05)。western blot法发现,阴性对照组、溶剂对照组及氧化苦参碱分别为0.025 g/L、0.050 g/L、0.100 g/L、0.500 g/L、1.000 g/L、2.000 g/L各组之间LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表达及LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化率比较,差异无统计学意义(F值分别为0.86,0.63,0.33,P0.05),各组别之间m TOR、Raptor蛋白及其m TORser2448、ser2481位点磷酸化产物和Raptor ser792位点磷酸化产物的表达,差异均无统计学意义(F值分别为1.33、1.42、1.12、0.95及0.47,P0.05)。结论:氧化苦参碱可上调Colo-16细胞株的凋亡,且与其浓度正相关。氧化苦参碱对细胞自噬的水平无影响,对自噬相关调控蛋白的表达也无影响。因此,氧化苦参碱可能通过上调Colo-16细胞株的凋亡而非自噬来实现其抗肿瘤效应。     

卵巢滤泡激素在干扰素γ介导的黑素细胞凋亡以及趋化因子分泌中的作用研究

【摘要】 目的 研究卵巢滤泡激素（FLCN）在干扰素γ（IFN-γ）介导的黑素细胞凋亡及趋化因子分泌中发挥的作用。方法 从正常人包皮环切组织及白癜风移植患者正常部位的吸疱表皮分离正常原代黑素细胞及白癜风原代黑素细胞。采用Western印迹检测正常原代黑素细胞、白癜风原代黑素细胞及人原代黑素细胞系PIG1细胞中FLCN蛋白的表达。以10 ng/ml IFN-γ刺激48 h的PIG1细胞为诱导组,未经处理的PIG1细胞为对照组,采用qRT-PCR检测两组细胞FLCN及自噬相关微管相关蛋白1轻链3（LC3）Ⅱ、Beclin基因mRNA表达,Western印迹检测FLCN、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平及腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的磷酸化水平。进一步对采用10 ng/ml IFN-γ刺激的黑素细胞感染FLCN抑制病毒进行不同的处理,分为阴性对照组、FLCN抑制组、抑制FLCN及添加mTOR抑制剂的自噬增强组和抑制FLCN及添加AMPK抑制剂的自噬抑制组。采用流式细胞仪检测各组PIG1细胞凋亡,酶联免疫吸附实验检测各组细胞上清液中趋化因子CXCL10和CCL20的浓度。多组间计量资料比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD-t检验。结果 正常原代黑素细胞（0.850 ± 0.120）、白癜风原代黑素细胞（1.507 ± 0.170）和PIG1细胞（0.697 ± 0.130）FLCN蛋白的相对表达差异有统计学意义（F = 50.09,P < 0.001）,白癜风原代黑素细胞高于正常原代黑素细胞和PIG1细胞（t = 4.06、5.89,均P < 0.01）。诱导组FLCN mRNA及蛋白相对表达均高于对照组（均P < 0.01）,LC3Ⅱ、Beclin mRNA及蛋白相对表达均低于对照组（均P < 0.01）;诱导组PIG1细胞LC3Ⅱ/Ⅰ水平（0.72 ± 0.02）、AMPK磷酸化水平（0.714 ± 0.023）低于对照组（1.13 ± 0.02、1.176 ± 0.002,t = 7.34、6.67,均P < 0.01）,mTOR磷酸化水平（1.051 ± 0.023）高于对照组（0.451 ± 0.016,t = 3.81,P = 0.009）。对照组、诱导组及各处理组PIG1细胞凋亡率及CXCL10、CCL20浓度差异均有统计学意义（均P < 0.001）,诱导组高于对照组,FLCN抑制组低于阴性对照组,自噬增强组低于FLCN抑制组,自噬抑制组高于FLCN抑制组（均P < 0.05）。结论 白癜风黑素细胞中高表达FLCN,FLCN表达以及下游信号通路受IFN-γ调控,FLCN可通过调节自噬参与IFN-γ介导的黑素细胞凋亡和趋化因子分泌。     

PM2.5对人皮肤角质形成细胞自噬水平的影响

目的研究空气细颗粒物(PM2.5)对人皮肤角质形成细胞自噬水平的影响。方法收集武汉市区空气中的PM2.5,分离并提取其水溶性及非水溶性成分,以不同的终浓度处理人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)。利用细胞免疫荧光染色和Western印迹法检测人角质形成细胞中自噬相关蛋白LC3的表达。结果细胞免疫荧光结果表明,经PM2.5染毒液诱导的细胞LC3表达量均高于对照组,且呈浓度依赖性升高。Western印迹检测结果显示,实验组细胞LC3-II/I比值明显高于对照组(P0.05,除B1组);相同浓度下,PM2.5水溶性成分与非水溶性成分比较作用强度差异无统计学意义(P0.05)。结论 PM2.5可诱导人皮肤角质形成细胞发生自噬,并与浓度有明显相关性,其诱导的机制可能是细胞对抗氧化应激损伤及细胞凋亡的一种自我保护反应。     

3-甲基腺嘌呤增强ALA-PDT对皮肤鳞状细胞癌A431细胞的杀伤作用

目的探讨5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)联合3-甲基腺嘌呤(3-MA)对皮肤鳞状细胞癌A431细胞的杀伤作用及其机制研究。方法体外培养人皮肤鳞状细胞癌A431细胞,设置不同的ALA浓度(0、0.20、0.40、0.80、1.60 mmol/L)及不同的培养时间(12、24、48 h),对A431细胞进行ALA-PDT处理,采用MTT法检测细胞增殖活性并计算半抑制浓度(IC_(50))值。根据实验需要将A431细胞分为空白对照组、ALA-PDT组、3-MA组和ALA-PDT+3-MA组。分组处理后,MTT法检测细胞增殖;流式细胞术分别检测细胞凋亡(Annexin V-FITC/PI双染法)以及细胞线粒体膜电位变化(JC-1染色法);单丹磺酰尸胺(MDC)染色法观察细胞自噬情况;Western blot检测凋亡和自噬相关蛋白的表达水平。结果 ALA-PDT对A431细胞的增殖活性有明显的抑制作用,且呈剂量和时间依赖性。与对照组比较,ALA-PDT组细胞增殖活性、线粒体膜电位均显著降低(P0.05),而细胞凋亡与自噬水平显著提高(P0.05),Cleaved-caspase-3、Bax、胞质Cyt C、LC-3Ⅱ、Beclin1等蛋白表达显著上调(P0.05),Bcl-2表达显著下调(P0.05)。与ALA-PDT组比较,ALA-PDT+3-MA组细胞增殖活性、线粒体膜电位以及细胞自噬水平显著降低(P0.05),细胞凋亡水平显著提高(P0.05),Cleaved-caspase-3、Bax、胞质Cyt C等蛋白表达显著上调(P0.05),而Bcl-2、LC-3Ⅱ、Beclin1等蛋白表达显著下调(P0.05)。结论 3-MA可通过抑制细胞自噬增强ALA-PDT对A431细胞产生的杀伤作用。     

白念珠菌菌丝调控小鼠巨噬细胞自噬关键分子微管相关蛋白1轻链3的实验研究

【摘要】 目的 探讨白念珠菌菌丝对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）自噬流的影响。方法 白念珠菌菌丝分别体外诱导BMDM细胞0.5、4、12 h,以不加菌丝处理的0 h组作为对照,Western印迹法检测各时间点自噬关键蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换及磷酸化雷帕霉素机制性靶蛋白（p-mTOR）的表达。白念珠菌菌丝分别联合4种溶酶体阻断剂,包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64d + 胃蛋白酶抑制剂pepstatin、巴弗洛霉素-A1（BAF-A1）、氯化铵及氯喹,体外诱导小鼠BMDM细胞4、12 h,观察白念珠菌菌丝对BMDM细胞基础自噬流的影响。统计分析采用非配对t检验、析因设计的方差分析及LSD-t检验。结果 白念珠菌菌丝体外处理小鼠BMDM 0.5、4和12 h后,与0 h组（0.983 ± 0.030）相比,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换均增加（1.254 ± 0.118、1.629 ± 0.391、1.598 ± 0.379）,差异有统计学意义（t值分别为3.875、2.856、2.804,均P < 0.05）,但各组p-mTOR的蛋白表达无明显差异。白念珠菌菌丝联合E-64d + pepstatin体外处理BMDM细胞4和12 h后,LC3-Ⅱ的蓄积水平较E-64d + pepstatin单独处理组明显增高,差异均有统计学意义（t值分别3.691、6.648,均P < 0.05）。与相应溶酶体阻断剂组相比,白念珠菌菌丝联合BAF-A1、氯化铵或氯喹4和12 h后,LC3-Ⅱ的蓄积水平均显著升高（均P < 0.05）。结论 白念珠菌菌丝体外诱导可增加小鼠BMDM细胞基础自噬流中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换。     

miRNA-7在中波紫外线诱导HaCaT细胞氧化应激损伤中的作用

目的探讨微小RNA-7(microRNA-7,miRNA-7)对中波紫外线(UVB)照射诱导的皮肤氧化应激损伤的保护性作用及其作用机制。方法建立UVB照射诱导的人永生化表皮角质形成细胞(HaCaT)氧化应激损伤模型,脂质体转染法过表达miR-7,并设立阴性对照组(miR-NC)和空白对照组。CKK-8法测定细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,比色法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,荧光法检测细胞内活性氧自由基(ROS)的含量,Real-time PCR和Western blot检测细胞中miR-7、Keap1及Nrf2 mRNA表达。结果与空白对照组相比,UVB模型组HaCaT细胞活性、SOD和GSH-Px活性显著下降(P均0.05),ROS含量显著上升(P0.05)。miR-7过表达能显著增加HaCaT细胞活性、SOD和GSH-Px活性,同时抑制Keap1蛋白的表达,增加Nrf2蛋白表达(P均0.05),siRNA-Nrf2转染后能显著抑制Nrf2表达(P0.05),进而逆转miR-7对细胞的保护作用。结论 miR-7能削弱UVB作用下HaCaT细胞的氧化应激损伤,其机制可能与Keap1-Nrf2信号通路的活化有关。     

柴达木枸杞多糖对UVB诱导人HaCaT细胞氧化损伤及凋亡相关蛋白的影响

目的观察枸杞多糖对中波紫外线(UVB)辐射后人角质形成(HaCaT)细胞的氧化损伤及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)表达的影响。方法超声辅助水提法制备枸杞多糖(LBP)粉末,体外培养HaCaT细胞,随机分为空白对照组、UVB照射组(UVB 30m J/cm~2辐射40min)、UVB+LBP组(UVB 30m J/cm~2辐射40min+LBP 1mg/m L),照射前12h加入LBP,照射结束后继续培养20h,倒置显微镜观察细胞形态;MTS法检测各组细胞吸光度值(A值);酶生化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶(CAT)活力和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量和丙二醛(MDA)含量;Western blot法测定各组细胞p38MAPK,caspase-8,caspase-3和Bcl-2的表达水平。结果与对照组相比,UVB照射组细胞形态明显异常,漂浮的死细胞明显增多;与UVB照射组相比,UVB+LBP组细胞的形态趋于正常,漂浮的死细胞明显减少。UVB照射组较对照组细胞吸光度(A值)明显降低(P0.05);UVB+LBP组细胞吸光度较UVB照射组明显升高(P0.05)。UVB照射组SOD活力、CAT活力、GSH-Px含量较对照组降低,MDA含量较对照组升高(P0.05);UVB+LBP组细胞SOD活力、CAT活力、GSH-Px含量较UVB照射组升高,MDA含量较UVB照射组降低(P0.05)。UVB照射组p38MAPK,caspase-8,caspase-3蛋白表达量明显高于对照组,Bcl-2表达量明显低于对照组(P0.05);与UVB照射组相比,UVB+LBP组HaCaT细胞p38MAPK,caspase-8,caspase-3表达水平降低,Bcl-2表达水平升高(P0.05)。结论枸杞多糖可抑制UVB辐射后HaCaT细胞的氧化损伤,并下调p38MAPK,caspase-8,caspase-3及上调Bcl-2的表达水平。