视网膜微血管内皮细胞离子通道的特性研究

目的 探讨视网膜微血管内皮细胞离子通道特性。方法 膜片钳技术的全细胞记录方式。结果 原代培养牛视网膜微血管内皮细胞的静息膜电位为(-34.711±2.196)mV(n=46),几乎每次记录都发现相似的跨膜外向电流,该电流具有电压依赖性及不失活特性,能被已知的Ca~(2+)激活K~+通道特异性阻抑剂不同程度阻断。结论 在视网膜微血管内皮细胞上存在Ca~(2+)激活K~+通道。     

H_2S抑制ATP诱导的大鼠小胶质细胞活化及IL-1β的释放

目的:观察硫化氢(H_2S)供体硫氢化钠(Na HS)对三磷酸腺苷(ATP)损伤的大鼠小胶质细胞通透性、胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)及IL-1β释放的影响,探讨H_2S对ATP-P2X嘌呤信号通路的作用及其神经保护的分子机制。方法:取对数期形态结构及生长分化良好的大鼠小胶质细胞用于实验。Fura-2/AM荧光染料检测各组[Ca~(2+)]_i,细胞内YO-PRO-1荧光强度检测以反映膜的通透性,ELISA检测ATP-细菌脂多糖(LPS)激活的大鼠小胶质细胞IL-1β的释放水平。结果:随着ATP浓度的增加,大鼠小胶质细胞内YO-PRO-1的荧光强度显著增加,而给予Na HS预处理后细胞膜通透性明显降低,对YO-PRO-1的摄取明显减少(P0.05),胞内荧光强度明显减弱(P0.05)。ATP处理大鼠小胶质细胞引起[Ca~(2+)]_i迅速升高后缓慢下降形成持续时间较长的平台期。Na HS预处理虽不能改变[Ca~(2+)]_i的峰值,但可抑制平台期的形成(P0.05)。ATP与LPS联合作用可促进大鼠小胶质细胞IL-1β的生成和分泌,而Na HS预处理可明显逆转这一效应(P0.05)。结论:Na HS可降低ATP诱导的大鼠小胶质细胞膜通透性、Ca~(2+)内流和IL-1β释放,抑制该细胞的激活,提示嘌呤信号通路可能介导H_2S的细胞保护作用。     

PAR-1对动员肺巨细胞癌PLA801D/PLA801C细胞内Ca~(2+)的作用

目的 通过研究PAR-1对肺巨细胞癌细胞高、低转移细胞株PLA801D和PLA801C[Ca~(2+)]I的影响,探讨PAR-1参与调节肺癌细胞转移相关功能的分子机制.方法 激光共聚焦显微镜检测PLA801D和PLA801C细胞[Ca~(2+)]I;将反义和正义PAR-1分别转染至PLA801D(D-)和PLA801C(C+)中;用thrombin和TRAP激活PAR-1,观察PAR-1对D-和C+的[Ca~(2+)]I影响.结果 PLA801D(荧光强度59.55,下同)和PLA801C(35.46)细胞之间的平均[Ca~(2+)]I差异有统计学意义(P<0.01).C+的[Ca~(2+)]I(45.77)明显高于其对照组CV(35.46,P<0.05),D-的[Ca~(2+)]I(48.42)明显低于对照组DV(59.55,P<0.05).C+和CV的[Ca~(2+)]I分别在加入thrombin 80 s和100 s后荧光强度分别达峰值48.19±9.84和45.64±9.87(P<0.05);二者均在加入TRAP60 s后达峰值,分别为111.31±25.00和52.93±11.21(P<0.05).D-和DV的[Ca~(2+)]I在加入thrombin 60 s后达峰值,分别为40.71±5.89和61.07±21.36(P<0.05),二者均在加入TRAP 40 s后达峰值,分别为84.98±11.23和102.58±21.48(P<0.05).结论 PLA801D和PLA801C的转移潜能可能与其细胞的[Ca~(2+)]I有关.激活PAR-1能够上调PLA801D和PLA801C的细胞内Ca~(2+)信号.PAR-1促进肺巨细胞癌转移的机制与上调细胞内Ca~(2+)有关.     

Klotho蛋白减轻低氧/复氧诱导的心肌细胞系H9C2损伤

目的研究Klotho蛋白对低氧-复氧诱导的心肌H9C2细胞系损伤的保护作用及其机制。方法将H9C2心肌细胞分为对照组、低氧/复氧组(1%O_2低氧6 h, 5%CO_2以及95%空气培养箱中复氧2 h)和Klotho蛋白(10μg/mL)干预组。通过酶标仪间接测定细胞内钙离子([Ca~(2+)]_i)水平;CCK8法和TUNEL法分别检测细胞活性及细胞凋亡;分光光度法检测细胞中钠ATP酶(Na~+/K~+-ATPase,NKA)和反向模式钠/钙交换体(Na~+/Ca~(2+)-exchange,NCX)的活性。结果体外培养的H9C2细胞低氧/复氧(6 h/2 h)处理后可明显降低H9C2细胞活性(P0.05);增加细胞内Ca~(2+)水平和凋亡率(P0.05);降低细胞中Na~+/K~+-ATPase的活性(P0.05);增加反向模式Na~+/Ca~(2+)交换体的活性(P0.05);10μg/mL Klotho蛋白处理可明显减轻上述损伤。结论 Klotho蛋白可减轻低氧/复氧诱导下的H9C2细胞内钙超载,最终减少该细胞系细胞的凋亡。     

细胞钠／钙交换可能参与高血压的发病机制

当前不论从组织水平,细胞水平还是亚细胞水平均证实血管平滑肌(VSM)细胞膜上存在着Na/Ca交换这一胞内Ca~(2+)调节机制。它可以利用Na~+的跨膜电化学梯度(g_(Na~+)来逆向转运Ca~(2+)。视Na~(2+)与Ca~(2+)电化学梯度的不同,它既可以介导Ca~(2+)进入细胞也可以将Ca~(2+)转运出细胞。 VSM细胞Ca~(2+)代谢的异常是高血压发病的一个重要原因。那么这一异常是否与Na/Ca交换有关呢?答案似乎是肯定的。在高血压病人的红细胞,自发性高血压大鼠(SHR)的红细胞或VSM细胞中Na~+与Ca~(2+)的含量均比正常对照明显增高。后者看来与Na~+,K~+-ATPase的抑制有关,因为不少证据显示高血压病人或动物血液中一种可以抑制Na~+,K~+-ATPase的内源性洋地黄类物质(endogenous digitalis)的水平升高。用高血压患者去蛋白     

巴豆醛抑制小鼠心肌收缩功能

目的研究香烟烟雾中α,β-不饱和醛-巴豆醛对小鼠心肌细胞收缩功能和心肌细胞内Ca~(2+)功能的影响。方法经Langendorff装置灌注消化分离出C57BL/6小鼠心肌细胞,与不同浓度(1、10、25和50μmol/L)巴豆醛孵育6 h,对照组不经巴豆醛处理,然后分别检测心肌细胞收缩峰值(PS)、最大收缩和舒张速率(±dL/dt)、心肌细胞收缩峰值时间(TPS)、心肌细胞舒张90%时间(TR_(90))、fura-2荧光强度(FFI)、细胞内Ca~(2+)衰退和SERCA~(45)Ca~(2+)摄取,Western blot分析Na~+-Ca~(2+)交换体的表达。结果与对照组相比,较高浓度(25和50μmol/L)的巴豆醛组能明显降低心肌细胞PS、±dL/dt、ΔFFI、SERCA活性及Ca~(2+)衰退速度(P0.05),并能延长TR_(90)(P0.05);而不同浓度巴豆醛对小鼠心肌细胞Na~+-Ca~(2+)交换体的表达无明显影响。结论巴豆醛可能是通过抑制小鼠心肌细胞内SERCA活性来影响心肌细胞内Ca~(2+)功能,从而抑制心肌细胞的收缩功能。     

CaMK Ⅱ活性对H_2O_2所致SK-N-SH细胞氧化应激损伤的影响

目的:评价钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)活性对过氧化氢所致人源性神经母细胞瘤细胞氧化应激损伤的影响。方法:SK-N-SH细胞生长至对数期时,接种于96孔培养板或6孔培养板,采用随机数字表法,将其分为4组:正常对照组,培养基中添加H_2O_2组(H_2O_2组),培养基中只添加CaMKⅡ活性抑制剂KN93组(KN93组),培养基中同时添加H_2O_2和KN93组(H_2O_2+KN93组),倒置显微镜观察细胞形态学,采用CCK-8法测定细胞活力,采用Fura-2/AM荧光法检测细胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i),采用免疫印迹测定CaMKⅡ和磷酸化CaMKⅡ的表达,采用RT-PCR法检测CaMK mRNA表达。结果:与正常对照组比较,H202组细胞体呈圆形的细胞和脱落细胞增加,细胞突起长度缩短,细胞存活率降低,[Ca~(2+)]_i升高,磷酸化CaMKⅡ表达上调,CaMKⅡmRNA表达下调。与H_2O_2组比较,H_2O_2+KN93组脱落细胞明显减少,突起变长,细胞存活率增加,[Ca~(2+)]_i降低,磷酸化CaMKⅡ表达下调,CaMKⅡmRNA表达水平上调。结论:CaMKⅡ增强了H_2O_2诱导的人源性神经母细胞瘤细胞氧化应激损伤。     

室旁核内花生四烯酰乙醇胺对心衰大鼠的心脏功能和交感神经活动的影响

目的:探究慢性心衰大鼠下丘脑室旁核(PVN)内花生四烯酰乙醇胺(AEA)对心脏功能和交感神经活动的影响。方法:采用冠状动脉结扎法构建大鼠心衰模型,超声心动图检测心功能;PVN内连续4周分别灌注AEA、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)选择性抑制剂KN-93、瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)通道特异性阻断剂辣椒平(CPZ)、Ca~(2+)螯合剂BAPTA-AM和小电导钙激活钾通道(SK通道)阻断剂apamin后,检测交感驱动及心功能指标;同时采用不同浓度AEA孵育NG108细胞,荧光测定法检测细胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]_i);Western blot检测CaMKII、SK_2及磷酸化TRPV1蛋白水平。结果:与假手术组相比,心衰组左心室舒张末期压(LVEDP)明显升高,左室压力最大上升、下降速率(±dp/dt_(max))和射血分数(EF)明显下降;PVN内AEA含量、[Ca~(2+)]_i及CaMKII、SK_2和磷酸化TRPV1蛋白水平均显著降低;与溶剂组相比,心衰组PVN内灌注AEA可显著降低心衰大鼠死亡率和交感驱动指标,并改善心功能;然而,PVN内分别灌注KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin均显著增强交感驱动指标并恶化心功能;AEA可剂量依赖性增加NG108细胞内[Ca~(2+)]_i及CaMKII、SK_2和磷酸化TRPV1蛋白水平。结论:室旁核内CaMKII/TRPV1/Ca~(2+)/SK_2信号通路可能参与了AEA对心衰大鼠心脏功能和交感神经活动的影响。     

红细胞抗高血压因子对大鼠红细胞膜Ca~(2+)·Mg~(2+)-ATP酶活性的影响

近年来本实验室从大鼠和人的红细胞中提取并基本上纯化了一种降压物质—抗高血压因子(Antihypertensive factor,AHF),对其理化特性、生理功能和作用机制进行了较深入和系统的研究。结果表明AHF的降压机制与抑制血管平滑肌(VSM)Ca~(2+)内流、降低胞内Ca~(2+)浓度和呈内皮依赖性的舒张VSM有密切关系。本文观察AHF对自发性高血压     

羟基氨酮强心作用机制的进一步研究

前巳报道羟苯氨酮(BAK_3)及其衍生物具有较强的强心和扩血管作用,且有不增加心率的优点, BAK_3在有效浓度范围内不抑制Na~+K~+-ATP和磷酸二酯酶(PDE),显著提高心肌收缩蛋白对Ca~(2+)的敏感性,提示增强收缩蛋白对Ca~(2+)的敏感性,可能是其强心作用的主要机制,可能为一种非甙和非PDE抑制剂的新型强心药物——钙增敏剂(Calcium Sensitiger).     

心喘灵舒血管作用的研究

心喘灵(XC-1)抑制异丙肾上腺素加快大鼠有心房自发性频率的作用,能使量—效反应曲线右移,XC-1也能抑制大鼠主动脉螺旋条由高K~+去极化和去甲肾上腺素诱发收缩张力增加的作用。XC-1与沛心达(perhexiline)作用相似,都有钙拮抗作用,能拮抗受体控制性钙通道(ROC)和电位依赖性钙通道(PDC);并证明XC-1与沛心达对内Ca~(2+)释放和外源性Ca~(2+)诱发主动脉螺旋条的收缩都有抑制作用。     

钙离子通道研究进展

<正> 70年代初期,细胞内透析技术的进展及其在神经细胞体的应用使人们首次得以在全细胞水平将Ca~(2+)电流与其它跨膜电流区别开进行研究。这些研究表明:(1),Ca~(2+)离子通道的活动是按m~2 Hodgkin-Huxley模式进行的;(2),首次指出细胞内Ca~(2+)对Ca~(2+)离子通道的功能是至关重要的;(3),Ca_2~+离子通道的一个基本特性是在细胞外有Ca~(2+)螯合剂存在的情况下,它转变为单价离子可透过的形式[Kostyuk and Krishtal, J.Physiol. (London)270:545(1977);ibid,P.569]。对后一现象的进一步研究发现Ca~(2+)本身可调节Ca_2~+离子通道的选择性,这一调节可能是通过将Ca~(2+)与Ca~(2+)离子通道的外口附近的高亲合     

酸敏感离子通道1a介导细胞内钙离子内流调节椎间盘终板软骨细胞凋亡

目的:观察酸敏感离子通道1a(ASIC1a)介导的钙离子内流在酸诱导的终板软骨细胞凋亡的作用。方法:SD培养大鼠终板软骨细胞,慢病毒为载体转染终板软骨细胞沉默ASIC1a,钙离子成像分析细胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]i)变化,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验分析酸诱导的细胞活力;ELISA测定凋亡率;荧光染料Hoechst 33342检测细胞凋亡。免疫印迹检测活化型半胱天冬酶-9(cleaved caspase-9)、活化型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)等凋亡相关蛋白的表达。结果:阻断ASIC1a可以抑制酸诱导的[Ca~(2+)]i升高;用ASIC1a-siRNA或PcTX1特异性阻断ASIC1a,明显抑制酸诱导的终板软骨细胞凋亡;胞外钙离子浓度降低抑制酸诱导的终板软骨细胞凋亡,与阻断ASIC1a结果一致,提示ASIC1a介导的钙离子内流在酸诱导凋亡中的作用。阻断ASIC1a,抑制酸诱导的cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白的表达。结论:酸激活的ASIC1a可能通过钙超载促使大鼠椎间盘终板软骨细胞凋亡。     

钙对心肌ATP酶的损害及镁的保护作用

本工作在大鼠心肌肌膜观察到,Mg~(2+)为心肌Na~+-K~+-ATP酶激活所不可缺少的因素,当Mg~(2+)浓度在0～6mM时,Na~+-K~+-ATP酶及Mg~(2+)-ATP酶活性与其密切相关;当超过8 mM时,ATP酶总活性不变,但Na~+-K~+-ATP酶/Mg~(2+)-ATP酶之比值增高。高浓度Ca~(2+)对于Na~+-K~+-ATP酶及Mg~(2+)-ATP酶均具有抑制作用,而提高Mg~(2+)浓度可部分地拮抗高Ca~(2+)的损伤作用。     

高钙对烧伤早期豚鼠离体心脏固有收缩性的影响

为了探讨烧伤早期心肌固有收缩力降低的机制,本实验观察了35％体表面积Ⅲ度烧伤后8小时,灌流豚鼠离体心脏对高钙溶液(含Cacl_2 3.2mmol/L台氏液)的反应及对Ca~(2+)的消耗量。结果表明,烧伤组在高钙液灌流情况下,左心室内压的±dp/dtmax、心室肌细胞动作电位幅度,最大去极化速率.复极化50％的时程缩短程度均低于对照组(P<0.05);对常钙或高钙灌流液中Ca~(2+)的交换量,烧伤组也显著低于对照组(P<0.01)。提示烧伤早期心肌细胞对Ca~(2+)的摄取、利用,心肌细胞电位对Ca~(2+)的反应均低于正常,这可能是此期心肌固有收缩性和舒张功能显著降低的重要原因之一。     

肌质网囊泡中钙的转运与一价阳离子和质子的释放

作者通过膜电位和离子释放实验研究了在ATP调节下兔骨骼肌肌质网囊泡对Ca~(2+)的摄取。当pH由小变大。或K~+由高变低时,肌质网囊泡的H~+和K,Na通过就产生H~+和K~+扩散电势,用di O-C_5-(3)萤光染料就可测定出膜电位。存在pH梯度和     

基质黏附强度调控血小板生长因子诱导的大鼠气道平滑肌细胞中Fyn激酶活性

气道平滑肌(airway smooth muscle,ASM)有收缩和舒张的功能,而哮喘的气道高反应中,ASM保持高收缩状态的表型,引起支气管痉挛和呼吸功能受损,但其生物力学机制尚不清楚。Fyn作为非受体酪氨酸激酶Src家族成员,在多个生理、病理过程中起作用。炎症因子如血小板生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)能刺激ASM细胞的增殖和诱导收缩延长效应,利用荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET),本研究发现PDGF能快速高效地激活ASM细胞中Fyn的活性(约110%FRET变化)。通过改变表面Fibronectin的包被浓度(1.25～40μg/mL)调节细胞-基质黏附强度,证实PDGF诱导Fyn的激活水平与黏附强度有正相关性,显示力学微环境影响ASM细胞中化学信号的可能性。研究中,减弱细胞内部收缩力对Fyn激活水平无明显影响。此初步性工作对理解哮喘条件下力学微环境改变对ASM细胞内的生化信号影响提供了一些思路。     

TRPC1/ORAI1复合体调节HUVECs SOC和ROC介导的Ca~(2+)内流和NO生成

目的研究瞬时受体电位通道1(TRPC1)/钙释放激活钙通道调节分子1(ORAI1)复合体在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)介导Ca~(2+)内流和NO生成中的作用。方法取2~3代HUVECs,将构建的TRPC1和ORAI1干扰质粒分别转染入HUVECs。用激光共聚焦显微镜观察细胞转染效果,real-time PCR和Western blot检测TRPC1、ORAI1 mRNA和蛋白的表达及抑制效率。细胞随机分组:特异性质粒转染组即实验组,未转染组即空白对照组及空质粒组(vehicle组),将上述3组细胞分别与CaR激动剂、ROC模拟剂TPA+CaR负性变构调节剂Calhex231、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220、经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967孵育,用荧光探针Fura-2/AM及DAF-FM负载方法同步检测[Ca~(2+)]i和NO。随后将构建的TRPC1和ORAI1干扰质粒同时转染入HUVEC,与CaR激动剂孵育后检测[Ca~(2+)]i和NO,用免疫共沉淀法检测TRPC1和ORAI1的相互作用。结果 1)与对照组相比,TRPC1及ORAI1组,mRNA和蛋白表达均明显降低(P0.05);2)在4种不同处理作用下,TRPC1及ORAI1转染组中细胞内Ca~(2+)浓度变化值和NO净荧光强度值均明显降低(P0.05);3)与对照组及单转染TRPC1及ORAI1组比,共转染组细胞内Ca~(2+)浓度变化值和NO净荧光强度值均明显降低(P0.05);4)TRPC1与ORAI1相互作用形成复合体,且在CaR激动剂的剌激下相互作用增强。结论 TRPC1与ORAI1复合体共同调节CaR经SOC和ROC激活介导的Ca~(2+)内流和NO生成。     

氯通道ClC-3对脑血管平滑肌细胞Ca2+池操纵性Ca2+内流的影响

目的 :研究ClC - 3Cl-通道在培养的牛脑血管平滑肌细胞 (CSMC)Ca2 + 池操纵性Ca2 + 内流中的作用。方法 :采用培养的CSMC ,用硫代磷酸修饰的ClC - 3反义寡核苷酸与脂质体一起转染入平滑肌细胞 4 8h ,以正义和随机序列寡核苷酸作为对照 ,在生物荧光双波长影像分析系统用Fura- 2 /Am荧光探针测定单个细胞内游离Ca2 + 浓度。结果 :(1)采用Ca2 + ImageSystem测定脑血管平滑肌细胞静息 [Ca2 + ]i ,以 340 / 380nm波长的比值表示为 0 6 84± 0 0 0 2 ,内皮素 - 1(ET - 1) 10 -7mol·L-1刺激细胞引起 [Ca2 + ]i呈双相升高反应 ,先是快…     

ATP门控离子通道P2X_7受体在中枢系统的表达与功能

正P2X受体是由ATP激发的离子通道,从中可渗透Na~+、K~+和Ca~(2+),这些蛋白参与一系列生理过程,包括调节突触传输、平滑肌收缩、化学递质分泌和免疫反应调控。P2X_7受体作为P2X受体家族最独特的成员,其与其它成员在结构和功能上有显著差异,属于低分子溶质转运的非选择性离子通道~([1-3])。P2X_7受体作为嘌呤能受体,与其它P2受体有明显