睾酮对结核分枝杆菌感染的RAW264.7细胞自噬的影响

目的探讨睾酮对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的鼠源巨噬细胞RAW264.7细胞自噬的影响及其分子机制。方法 MTB感染RAW264.7细胞24 h后,给予10~(-8)mol/L睾酮处理24 h;采用透射电镜观察细胞自噬情况,Western blot法检测细胞自噬相关蛋白以及MAPKs信号通路蛋白。结果睾酮干预MTB感染的RAW264.7细胞后自噬体、自噬特异标志物LC3Ⅱ均明显增加(P0.01),通路蛋白JNK磷酸化水平明显上调(P0.001)。结论睾酮可能通过激活JNK信号通路诱导MTB感染的RAW264.7细胞自噬。     

谷氨酰胺酶1对卡介苗诱导的巨噬细胞自噬的调控作用

目的：探讨谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)在卡介苗(Bacille Calmette-Guérin,BCG)感染的巨噬细胞中对自噬的调控作用。方法：培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,利用小干扰RNA敲减巨噬细胞内GLS1的表达并结合BCG感染,采用免疫荧光染色、流式细胞术、ELISA和Western blot等技术检测自噬相关指标,阐明GLS1对BCG诱导的巨噬细胞自噬的调控作用,并初步探讨其机制。结果：(1)BCG感染巨噬细胞显著增加了LC3B和GLS1的蛋白表达量(P<0.01),促进了谷氨酰胺分解;(2)敲减GLS1显著增加了巨噬细胞内谷氨酰胺的含量(P<0.05),同时显著降低了巨噬细胞的自噬率以及自噬相关因子LC3B(P<0.01)、beclin-1(P<0.01)和ATG12(P<0.05)的蛋白表达量;(3)剥夺培养液中的谷氨酰胺处理细胞后,敲减GLS1对BCG感染的巨噬细胞中自噬相关因子LC3B、ATG5和ATG12的表达以及自噬流的发生无显著影响。结论：在BCG感染巨噬细胞RAW264.7过程中,敲减GLS1后可通...     

小分子抑制剂JQ1抑制小鼠乳腺癌生长及转移

目的探讨FOS相关抗原-1(Fra1)特异性小分子抑制剂JQ1对肿瘤相关巨噬细胞表型以及小鼠乳腺癌生长和转移的影响。方法 CCK8检测JQ1的细胞毒性;Western blot检测RAW264.7细胞Fra1蛋白水平;RT-q PCR和流式细胞术检测JQ1处理巨噬细胞后M1/M2相关表型分子的变化;Transwell细胞迁移实验检测JQ1处理后的RAW264.7细胞对4T1乳腺癌细胞系迁移能力的影响;小鼠荷瘤实验检测JQ1联合紫杉醇对小鼠乳腺癌的治疗效果。结果 JQ1能够抑制巨噬细胞Fra1蛋白表达和向M2型极化,降低巨噬细胞促进乳腺癌细胞迁移的能力(P0.05);JQ1联合紫杉醇治疗明显降低小鼠乳腺癌的原位生长和肺转移(P0.05)。结论 JQ1通过抑制巨噬细胞Fra1蛋白表达来抑制巨噬细胞向M2型极化,降低肿瘤细胞迁移能力,进而减少小鼠乳腺癌肿瘤原位生长和肺转移。     

小檗碱促进巨噬细胞系RAW264.7由M1促炎表型向M2抗炎表型极化

目的探讨小檗碱(BBR)对巨噬细胞系RAW264.7极化分型的影响。方法将RAW264.7细胞分为对照组、高脂和炎性反应模型组(以100μg/L脂多糖和100μg/L聚合型低密度脂蛋白刺激)和小檗碱低、中、高浓度(5、10、20μmol/L)处理组。用ELISA和流式细胞计量术检测RAW264.7两种极化分型(M1型和M2型)相关标志物TNF-α、MCP-1、CD86、IL-4、IL-13、TGF-β1和CD206的表达,以观察细胞极化。用Western blot和RT-qPCR检测载脂蛋白E(apoE)、极低密度脂蛋白受体(VLDLR)或载脂蛋白E受体2(apoER2)的表达。结果 BBR引起M1型巨噬细胞相应标志物TNF-α、MCP-1和CD86表达减少(P0.05); M2型巨噬细胞相应标志物IL-4、TGF-β1和CD206表达增加。同时也能够促进RAW264.7细胞内apoE的蛋白表达和VLDLR的mRNA表达(P0.001)。结论 BBR可能促进apoE与VLDLR的结合,进而诱导RAW264.7从M1促炎表型向M2抗炎表型极化。     

脂肪间充质干细胞诱导巨噬细胞向M2 型极化的实验研究

目的:探究脂肪间充质干细胞体外对炎症启动细胞——巨噬细胞的极化作用。方法:脂多糖(LPS,1μg/ml)模拟局部炎症,诱导RAW264.7巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化。收集培养过脂肪间充质干细胞的培养基(ADMSCCM)诱导M1型RAW264.7细胞向M2转化。检测M1和M2极化方向的相关指标,通过对IL-10、IGF-1、Arg-1、TNF-α、FIZZ1、SPHK-1的mRNA定量,以及通过Western蛋白质印迹法和荧光标记技术观察IL-10、IL-12 p40、IL-27 Rα的表达。结果:LPS诱导后的RAW264.7细胞,在经过ADMSCCM培养后,其M1相关指标(TNF-αmRNA、IL-12 p40;P0.05)显著下降,部分M2相关指标(IGF-1、IL-10 mRNA、IL-10;P0.05)明显上升。结论:脂肪间充质干细胞分泌的可溶性细胞因子,可诱导已向M1型极化的RAW264.7细胞向M2型巨噬细胞极化。     

南蛇藤素通过调控M2型巨噬细胞极化提高A549细胞对顺铂的敏感性

目的：探讨南蛇藤素（CEL）通过调控M2型巨噬细胞极化提高肺癌细胞A549对顺铂敏感性的作用及可能机制。方法：体外培养巨噬细胞RAW264.7和肺癌细胞A549,CCK-8检测CEL对细胞活性的影响。IL-4/IL-13诱导RAW264.7细胞极化后给予CEL,qRT-PCR和免疫荧光实验检测M2型巨噬细胞相关标志物表达。Western blot检测RAW264.7细胞p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT表达。将A549细胞分为对照组、CEL组、M2组（A549细胞与M2型巨噬细胞共培养）、M2+CEL组（A549细胞与CEL处理的M2型巨噬细胞共培养）和M2+LY-294002组（A549细胞与LY-294002处理的M2型巨噬细胞共培养）,给予顺铂处理后,CCK-8检测细胞活性,Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白表达。结果：80 nmol/L CEL抑制RAW264.7细胞活性但对A549细胞活性无影响。40 nmol/L CEL处理RAW264.7细胞后,IL-4/IL-13诱导的M2型巨噬细胞标志物MRC1、Arg1和CD163表达明显降低,p-PI3K和...     

Aire 对巨噬细胞极化影响的研究

目的:研究自身免疫调节因子(Aire)对巨噬细胞极化的影响。方法:分别用LPS、IL-4 以及LPS 联合免疫复合物刺激小鼠单核巨噬细胞系RAW264郾7 细胞、稳定表达GFP-Aire 的RAW264.7 细胞(A33-3) 细胞和稳定表达GFP 的RAW264.7 细胞(C1-6),使其向M1(LPS)、M2a(IL-4)和M2b(LPS 联合免疫复合物)型巨噬细胞极化。通过Real-time PCR 检测各组细胞中M1 型巨噬细胞特征分子IL-1、iNOS 和IL-6,M2a 型特征分子Arg-1 和M2b 型特征分子IL-10 的表达水平,研究Aire 对各种类型巨噬细胞极化的影响。结果:LPS 在0.5 g/ ml 浓度时,RAW264.7 细胞中M1 型巨噬细胞产物IL-1 、iNOS和IL-6 基因表达量最高;而IL-4 以及LPS 联合免疫复合物的刺激作用有显著的剂量依赖性,都在浓度最高时RAW264.7 细胞中Arg1(M2a)和IL-10(M2b)基因表达量最高。LPS 刺激后,A33-3 细胞中IL-1 和iNOS 表达水平明显高于C1-6 细胞,IL-6 则相反;IL-4 及LPS 联合免疫复合物刺激后,A33-3 细胞中Arg1 和IL-10 的表达水平明显低于C1-6 细胞。结论:Aire 可能促进巨噬细胞向M1 极化,同时抑制其向M2a 和M2b 极化。     

结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白影响小鼠巨噬细胞自噬形成的实验研究

目的:观察热休克蛋白Hsp16.3对感染结核分枝杆菌(MTB)的巨噬细胞自噬体形成的作用.方法:以50 ng/μL雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体形成后,用结核分枝杆菌毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用Hsp16.3蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,抗酸染色观察胞内细菌形态,计数MTB的菌落数.提取巨噬细胞总蛋白,Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3表达水平的变化.结果:雷帕霉素诱导巨噬细胞形成自噬后感染结核分枝杆菌可使胞内细菌局限化,加入Hsp16.3蛋白可明显抑制了自噬体的形成,影响了结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存,显著增加了细菌的菌落形成单位,降低了自噬相关蛋白LC3的表达(P＜0.05).结论:Hsp16.3蛋白可能通过调节Atg8的表达水平抑制自噬体的形成.     

巨噬细胞Coronin-1的表达与非Mtb源性自噬相关性的实验研究

目的:研究巨噬细胞Coronin-1与非Mtb源性细胞自噬的相关性及其可能信号通路。方法:分别构建过表达Coronin-1的p EGFP-C1-Coronin-1质粒和干扰Coronin-1表达的p Genesil-1-Coronin-1质粒,通过G418加压筛选其RAW264.7细胞稳定转染株,即Coronin-1高表达细胞株(RAW264.7-Cor.Plus)和Coronin-1低表达细胞株(RAW264.7-Cor.Minus)。将RAW264.7-Cor.Plus组、RAW264.7组和RAW264.7-Cor.Minus组细胞分别采取完全培养基(空白处理对照)、饥饿、雷帕霉素、环孢素A等因素处理后,通过RT-PCR法检测Beclin-1的基因转录水平,Western blot法检测Coronin-1、LC3BⅡ/LC3BⅠ及Beclin-1的蛋白表达水平。结果:Coronin-1过表达质粒和siRNA质粒均构建成功,其细胞稳定筛选株具有过表达或抑制表达Coronin-1特性。1空白处理三组细胞,Western blot法检测LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值:RAW264.7-Cor.Minus组RAW264.7组RAW264.7-Cor.Plus组;Western blot法检测Beclin-1:RAW264.7-Cor.Minus组RAW264.7组RAW264.7-Cor.Plus组;RTPCR法检测Beclin-1转录水平,趋势同Western blot;2饥饿处理三组细胞,LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值:RAW264.7-Cor.Minus组RAW264.7组RAW264.7-Cor.Plus组;3雷帕霉素处理RAW264.7细胞,其Coronin-1蛋白被显著抑制;雷帕霉素和环孢素A分别处理RAW264.7-Cor.Plus细胞,其LC3BⅡ/LC3BⅠ比值明显较空白处理组高。结论:巨噬细胞Coronin-1与非Mtb源性细胞自噬具有相关性。在营养充足状态下,Coronin-1可抑制细胞自噬;在饥饿状态下,Coronin-1可促进细胞自噬。Coronin-1对自噬的调控可能与m TOR和钙离子信号通路有关。     

川续断皂苷Ⅵ对M1/M2型巨噬细胞极化的调节作用及机制

目的：研究川续断皂苷Ⅵ对M1/M2型巨噬细胞极化的调节作用及机制。方法：MTT法检测川续断皂苷Ⅵ对RAW264.7细胞活力的影响。ELISA检测脂多糖（LPS）诱导状态下RAW264.7细胞上清中TNF-α和IL-6的分泌量；Griess法检测LPS诱导状态下RAW264.7细胞上清中一氧化氮（NO）含量；荧光定量PCR检测TNF-α、IL-6、精氨酸酶-1(Arg-1)、血红素加氧酶1(HO-1)和细胞因子信号转导抑制蛋白-2(SOCS2)基因表达水平。Western blot检测一氧化氮合酶（iNOS）和p-p65蛋白表达。结果：在LPS诱导的RAW264.7细胞中，川续断皂苷Ⅵ抑制TNF-α、IL-6、iNOS和p-p65蛋白或基因表达水平，同时增加HO-1基因表达。川续断皂苷Ⅵ能抑制LPS诱导下RAW264.7细胞分泌的NO。川续断皂苷Ⅵ增加IL-4诱导下M2型巨噬细胞标志物Arg1和SOCS2基因表达。结论：川续断皂苷Ⅵ可以抑制RAW264.7巨噬细胞向M1型极化，同时促进其向M2型极化，可通过调节M1/M2型巨噬细胞极化发挥其抗炎免疫调节作用。     

雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤对RAW264.7细胞中8种miRNAs表达的影响

目的探究雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)处理对RAW264.7细胞中miR-181c,miR-101b和miR-1192等8种自噬相关miRNAs的表达水平,为研究miRNAs在细胞自噬中的功能提供理论基础。方法生物信息学预测分析与细胞自噬相关的miRNAs并构建miRNAs调控细胞自噬的网络图;分别用Rapa和3-MA对RAW264.7细胞做不同条件处理,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测不同条件处理后RAW264.7细胞中miR-181b、miR-181c、miR-101b、miR-1192、miR-362-3p、miR-590-3p、miR-875-5p和miR-335-5p的相对表达量。结果生物信息学预测结果显示8种miRNAs可能分别靶向作用于细胞自噬通路中多个关键蛋白,对细胞自噬起到促进或抑制作用;与正常对照组相比,miR-181c、miR-101b、miR-1192、miR-362-3p、miR-335-5p、miR-875-5p在Rapa处理RAW264.7细胞组中表达显著下调(P0.05),而在3-MA处理组则都显著上调(P0.05);miR-181b在Rapa组表达显著上调,在3-MA组表达下调(P0.05);miR-590-3p在Rapa组和3-MA组都无显著性变化(P0.05)。结论 miR-181c、miR-101b等7种miRNAs可能在RAW264.7巨噬细胞自噬过程中发挥重要调控作用。     

炙甘草多糖对小鼠巨噬细胞再极化的影响

目的:建立探讨炙甘草中等分子量多糖(MPRR)诱导巨噬细胞极化的情况,阐明肿瘤微环境中极化后巨噬细胞对小鼠4T1乳腺癌细胞生长的影响。方法:培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,采用IL-4诱导并建立M2型极化模型,将培养细胞分为未诱导细胞(M0)组、M2极化(IL-4诱导)组、MPRR诱导组和Rp组(IL-4诱导12 h后MPRR再极化诱导组),流式细胞术分析巨噬细胞极化标志(CD86和CD206)的表达。免疫印迹技术分析转录因子STAT-6表达和磷酸化。收集不同条件下巨噬细胞培养上清液,ELISA法检测其IFN-γ和TGF-β浓度。结果:与对照组比较,IL-4诱导后细胞发生M2极化,可检测到RAW264.7细胞表面CD86表达下降(P0.05),CD206表达增加(P0.05)。而MPRR促进细胞向M1极化,可观察到其促进CD86表达而降低CD206表达(P0.05)。M2极化后STAT-6磷酸化增加,IFN-γ分泌减少而TGF-β分泌增加(P0.05);经MPRR处理减弱STAT-6磷酸化和TGF-β的分泌,促进IFN-γ分泌(P0.05)。结论:炙甘草水溶性多糖促进巨噬细胞的M1极化,可拮抗IL-4诱导其M2极化效应,炙甘草多糖可调节小鼠巨噬细胞再极化。     

丙泊酚调节脂多糖诱导的RAW264.7单核巨噬细胞M1/M2型极化的研究

目的 研究丙泊酚对脂多糖诱导的RAW264.7单核巨噬细胞M1/M2型极化的影响.方法 不同剂量的丙泊酚处理脂多糖诱导的RAW264.7单核巨噬细胞,CCK8检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位的变化,Western印迹检测Bax/Bcl-2、iNOS和Arg-1蛋白质水平,RT-PCR检测iNOS、I...     

小鼠ACADL对巨噬细胞表达炎症因子的影响

目的探讨长链酰基辅酶A脱氢酶(Acyl-CoA dehydrogenase,long chain,ACADL)对巨噬细胞分泌炎症因子的影响。方法在体外诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞中加入脂多糖(LPS)以及白细胞介素4(IL-4)分别诱导M1和M2极化,在极化0、12、24、36、48 h时用Western blot检测ACADL在M1和M2极化中的蛋白表达量。构建ACADL-pEGFP-N1质粒,使用G418筛选和鉴定过表达ACADL的RAW264.7细胞稳定株。LPS刺激过表达ACADL稳定株和对照组细胞4 h后,通过ELISA和qRTPCR检测TNF-α、IL-6、IL-10的表达情况。在RAW264.7细胞中加入beta氧化抑制因子etomoxir预处理,ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-10的表达情况。结果在巨噬细胞极化过程中ACADL蛋白量先减少再增加;过表达ACADL的细胞中,IL-6和IL-10分泌量及mRNA水平均显著高于对照组(P0.001):beta氧化抑制因子etomoxir能够减少RAW264.7细胞分泌炎症因子。结论 ACADL能增强巨噬细胞IL-6和IL-10的分泌,其作用机制可能是通过beta氧化影响炎性细胞因子的表达。     

miR-146a对小鼠巨噬细胞IL-18表达的影响

目的:探讨miR-146a对小鼠单核-巨噬细胞株RAW264.7以及小鼠原代腹腔巨噬细胞Thl/Th2类细胞因子表达的影响。方法:体外培养的小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7细胞和腹腔新鲜分离的巨噬细胞分别瞬时转染miR-146a mimics、阴性对照mimics(NC mimics)、抑制性miR-146a(miR-146a inhibitor)和抑制性miR-146a阴性对照(NC in-hibitor)。转染后,利用real time PCR定量检测IL-18、IL-5和IL-10的表达情况。结果:RAW264.7细胞和原代腹腔巨噬细胞在转染miR-146a mimics后IL-18的表达水平明显降低(P<0.05),转染miR-146a inhibitor后IL-18的表达水平明显升高(P<0.05),但对IL-5和IL-10的表达,两种转染形式均没有影响。结论:巨噬细胞RAW264.7及原代巨噬细胞表达的miR-146a能够负向调控Thl类细胞因子IL-18的表达,但是不能调控Th2类细胞因子IL-5及IL-10的表达。     

小鼠巨噬细胞功能极化可塑性的初步探讨

目的通过鉴定小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)的功能表型,从而研究巨噬细胞功能极化的可塑性及其内在机制。方法采用流式细胞术检测体外诱导分化的小鼠骨髓来源巨噬细胞纯度;采用荧光定量PCR技术检测由RAW264.7极化的M1、M2巨噬细胞中M1、M2特定标记基因的表达来鉴定RAW264.7的功能状态;小鼠BMDM极化为M1、M2巨噬细胞时,荧光定量PCR技术检测M1、M2中特定标记基因TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1 mRNA水平的表达,组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A(TSA)、DNA去甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞(Aza)刺激M1、M2巨噬细胞后,检测TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1 mRNA水平表达的变化。结果 RAW264.7细胞经LPS刺激8 h极化为M1巨噬细胞;RAW264.7细胞经IL-4体外刺激24 h极化为M2巨噬细胞。小鼠BMDM在LPS、IL-4刺激下,分别极化为M1、M2巨噬细胞,改变体外刺激条件,M1巨噬细胞可重分化为M2样巨噬细胞,M2巨噬细胞可重分化为M1样巨噬细胞,M1样巨噬细胞和M2巨噬细胞是介于M1、M2中间状态的2种巨噬细胞;药物TSA、Aza的加入使M1、M2中特定标记基因TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1 mRNA水平表达增加。结论巨噬细胞的功能极化具有可塑性,巨噬细胞的极化可能与染色质状态的改变有关。     

原头蚴体外刺激巨噬细胞高表达PPARα/γ并调节其极化

目的:探讨原头蚴与RAW264.7 共培养后PPARα/γ的表达水平以及对巨噬细胞极化的作用。方法:原头蚴与RAW264.7 共培养12、24、36、48、72 h 取细胞。用Qrt-PCR 的方法检测RAW264.7 细胞PPARα/γ的表达水平,用qRT-PCR 的方法检测巨噬细胞M1 型相关因子TNF-α、MCP-1、IL-1β和M2 型相关因子Arg-1、TGF-α、Fizz-1 的水平,ELISA 的方法检测Arg-1 和MR 的表达量。结果:RAW264.7 细胞PPARα/γ的表达水平和M2 型相关因子Arg-1、TGF 、Fizz-1 和MR 均逐渐升高,72 h 表达最高(P<0.05);巨噬细胞M1 型相关因子TNF 、MCP-1、IL-1茁先升高后降低(P<0.05),Arg-1 和MR 的蛋白水平也逐渐增高。结论:原头蚴与RAW264.7 共培养后PPARα/γ的表达逐渐升高,可能促进巨噬细胞由M1 型向M2 型极化,从而在虫体免疫逃逸中发挥一定作用。     

洛美利嗪调控小鼠巨噬细胞极化的机制研究

目的:探究洛美利嗪对小鼠巨噬细胞M1型和M2型极化的调控作用及分子机制。方法:采用RTqPCR及Western blot实验检测洛美利嗪对小鼠骨髓来源的巨噬细胞和Raw 264.7小鼠巨噬细胞M1和M2型极化的影响;Western blot实验检测洛美利嗪对调控巨噬细胞极化的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子κB(NF-κB)和信号转导及转录激活因子6(STAT6)信号通路的影响。结果:洛美利嗪能够显著抑制脂多糖(LPS)诱导的M1型巨噬细胞炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和IL-1β的产生(P0.01),且剂量依赖性地降低M1型极化标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达(P0.05),同时促进IL-4诱导的M2型巨噬细胞标志物几丁质酶3样蛋白3(CHI3L3/Ym-1)、Fizz-1(found in inflammatory zone-1)和精氨酸酶1(Arg-1)的mRNA和蛋白表达(P0.05)。洛美利嗪能够剂量依赖性地抑制MAPK信号通路中p38 MAPK、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶1/2(JNK1/2)的磷酸化以及NF-κB信号通路中NF-κB p65的磷酸化,并促进核因子κB抑制因子α(IκBα)的表达(P0.05),进而介导巨噬细胞极化。结论:洛美利嗪可以通过调控MAPK和NF-κB信号通路进而剂量依赖性地抑制小鼠巨噬细胞M1型极化,同时洛美利嗪还可以显著促进M2型极化。     

青藤碱对LPS、IL-4诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞极化的影响

目的:探讨青藤碱(Sinomenine,SIN)对脂多糖(LPS)以及白细胞介素4(IL-4)诱导的RAW264.7细胞向M1、M2型极化的影响。方法:以LPS刺激RAW264.7细胞诱导M1型极化,IL-4刺激RAW264.7细胞诱导M2型极化;青藤碱作用于LPS或IL-4诱导的巨噬细胞后:用酶联免疫法(ELISA)检测不同诱导状态下RAW264.7细胞TNF-α和IL-10的分泌量;荧光定量PCR检测与巨噬细胞极化相关的精氨酸酶-1(Arg-1)、一氧化氮合酶(i NOS)、细胞因子信号转导抑制蛋白-2(SOCS2)和细胞因子信号转导抑制蛋白-3(SOCS3)的mRNA表达水平。结果:青藤碱能抑制LPS诱导下细胞TNF-α的分泌量,抑制细胞i NOS和SOCS3的mRNA表达水平的升高。青藤碱能抑制IL-4诱导下细胞IL-10的分泌量和Arg1的mRNA表达水平的升高,对IL-4诱导下细胞SOCS2的mRNA表达水平的升高没有明显影响。结论:青藤碱对LPS诱导下巨噬细胞向M1型极化具有抑制作用;对IL-4诱导下巨噬细胞向M2型极化具有抑制作用。青藤碱对M1/M2亚型的失衡具有调节作用,有利于维持其动态平衡。     

嗜肺军团菌激活Nrf2-Keap1通路抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞自噬

目的观察嗜肺军团菌(LP)对RAW264.7巨噬细胞自噬流及其自噬相关因子表达水平的影响并探讨其作用机制。方法活的LP和灭活的LP[感染复数(MOI)=10, 50, 100]分别处理RAW264.7巨噬细胞1、 2、 3 h,通过筛选得出MOI=50,处理2 h为其最佳作用条件。用雷帕霉素(RAPA)处理RAW264.7巨噬细胞12 h后,再加入活的和灭活的LP共培养2 h,并设正常对照组、 RAPA处理组、活LP组、 RAPA处理的活LP组、灭活LP组和RAPA处理的灭活LP组。用携带双荧光标记蛋白基因和微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)基因的真核过表达质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B转染巨噬细胞,监测巨噬细胞自噬流的变化;用基因芯片在处理的最佳时间点筛选出LP影响巨噬细胞自噬的相关因子溶酶体/内体膜跨膜蛋白封闭蛋白(CLN3)、组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)、 G蛋白信号传导调节蛋白19(RGS19)、肿瘤坏死因子(TNF)、组织蛋白酶B (CTSB)、 GABA A型受体相关蛋白类似物2(GABARAPL2)、 P62、微管相关蛋白1轻链3(LC3);实时荧光定量PCR验证基因芯片结果并检测相关信号通路因子核因子E2相关因子2(Nrf2)、 beclin1和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)的mRNA水平; Western blot法验证基因芯片结果并检测Nrf2、 beclin1和Keap1的蛋白水平。结果与对照组相比,活LP组和灭活LP组的自噬流受到抑制;与RAPA处理组相比,活LP组和灭活LP组自噬流受到抑制。基因芯片检测显示活LP组和灭活LP组LC3的表达下调, P62的表达上调。实时定量PCR、 Western blot验证结果与基因芯片一致。Keap1、 beclin1的mRNA和蛋白水平明显下降, Nrf2 mRNA和蛋白的水平明显增加。结论 LP可抑制巨噬细胞自噬,可能与激活Nrf2-Keap1信号通路有关。