胰岛素样生长因子-1逆转录病毒表达载体的构建及其在大鼠胚胎神经干细胞中的表达

目的:构建胰岛素样生长因子-1(IGF-1)逆转录病毒表达载体,并观察转IGF-1基因的鼠胚胎神经干细胞(NSC)体内外基因表达情况.方法:通过酶切和连接的方法将IGF-1基因克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN中,感染包装细胞后收集病毒颗粒再感染从胎龄14 d的SD大鼠全脑组织中分离出的NSC,RT-PCR检测IGF-1的mRNA,免疫组织化学法检测IGF-1蛋白的表达,并用立体定向法将Brdu标记的转基因NSC移植到大鼠大脑中动脉梗死模型的纹状体缺血半暗区,免疫染色观察移植后1周转基因NSC在脑内的基因表达情况.结果:酶切及序列分析证实重组逆转录病毒载体pLXSN-IGF-1构建正确,RT-PCR能检测到转基因IGF-1的mRNA,免疫组织化学法能检测到IGF-1在转染了逆转录病毒的NSC及其子代细胞内表达,转基因NSC移植后1周在宿主脑内迁徙并表达IGF-1基因产物.结论:成功构建了携带IGF-1基因的逆转录病毒载体,转染了重组逆转录病毒载体的NSC可在体内外表达IGF-1.     

人胰岛素样生长因子-1真核表达载体的构建及在神经干细胞中的表达

目的:构建人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)真核表达载体,并在人脐血神经干细胞(NSCs)中表达。方法:采用RT-PCR法从人胎肝中克隆IGF-1基因,将其导入真核表达载体pcDNA3.1中,用脂质体转染法将重组质粒转染人脐血NSCs。分别采用RT-PCR和免疫荧光细胞化学法检测转基因NSCs中IGF-1mRNA和蛋白的表达。结果:琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出462bp的条带;重组载体pcDNA3.1-IGF-1经HindⅢ与BamHⅠ双酶切后,得到5428bp和462bp的两个条带;目的基因转染的NSCs经RT-PCR扩增出一条与目的基因一致的条带;免疫荧光细胞化学检测到IGF-1蛋白的表达。结论:成功构建了人IGF-1基因的真核表达载体,转染后IGF-1重组蛋白在人脐血NSCs中能成功表达。     

骨髓基质细胞的生长特性和转染胰岛素样生长因子-1后的凋亡研究

目的:探讨体外培养大鼠骨髓基质细胞(MSC)的生长特性,同时转染胰岛素样生长因子-1(IGF-1)观察对其凋亡的影响。方法:相差显微镜观察细胞的大体形态,亚甲蓝染色观察细胞集落,细胞计数法研究细胞的增殖能力;逆转录病毒载体pBabe-IGF-1或pBabe转染到MSC,RT-PCR检测IGF-1的表达,流式细胞仪Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡,RT-PCR检测促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2的表达。结果:骨髓基质细胞主要呈梭形,细胞呈集落性生长,细胞生长到第6代几乎生长停滞;转染IGF-1的MSC组的细胞凋亡率和Bax的表达明显低于其它转染空载体组和对照组,而Bcl-2的表达率则高于后两组(P<0.05)。结论:此方法能较容易地获得大量骨髓基质细胞,IGF-1基因转染后能够明显降低MSC的细胞凋亡,并和Bax基因的升高、Bcl-2基因的降低相关。     

转染逆转录病毒的VEGF在兔骨髓基质干细胞内的表达

目的 :检测逆转录病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF1 65)基因转染兔骨髓基质干细胞 (BMSC)后目的基因表达情况及促血管生成作用 ,为进一步将其用于血管化组织工程骨构建奠定基础 .方法 :构建含VEGF基因的逆转录病毒表达载体 ,通过感染兔BMSC 使其获得稳定表达 ,使用免疫组化的方法检测其蛋白表达 ,并通过新生血管计数观察其促血管生成作用 .结果 :成功构建VEGF逆转录病毒表达载体 ,免疫组化方法显示经感染的BMSC 胞质中有阳性棕色颗粒出现 ,且动物实验显示新生血管计数明显高于对照组 (P <0 .0 1 ) .结论 :采用逆转录病毒介导的基因转移技术可将VEGF基因转染至BMSC 中 ,可获得外源性蛋白的表达 ,且有明显的促血管生成作用 .     

转染胰岛素样生长因子-1的骨髓基质细胞对心肌梗死后心功能的影响

目的:移植转染胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的骨髓基质细胞(MSC)到心肌梗死大鼠模型中,观察心肌细胞的凋亡和心功能的变化。方法:采用结扎法制作心肌梗死大鼠模型,用含pBabe-puro/IGF-1的病毒液感染MSC,移植MSC进入梗死心肌边缘。将实验分为心肌梗死组(MI)、心梗单纯移植细胞组(MI+MSC)、心梗移植感染空质粒细胞组(MI+MSC-pBabe-puro)、心梗移植感染IGF-1质粒的细胞组(MI+MSC-pBabe-puro/hIGF-1)。免疫组化检测炎性反应的时间,决定细胞移植的时间点。术后4周,通过TUNEL法检测心肌的细胞凋亡,超声心动图检测心功能的变化。结果:免疫组化结果显示梗死后第7天的ED1细胞的阳性数比第2天明显降低(P<0.05);转染IGF-1的MSC移植到心梗的心肌中,和转染空质粒的MSC以及未作转染的MSC组比较,明显减少心肌的细胞凋亡(P<0.05);且射血分数、左室壁厚度、左室短轴缩短率明显提高(P<0.05)。结论:转染IGF-1的MSC移植到心梗大鼠心肌内,可能是通过减少心肌的细胞凋亡来改善心功能。     

hIGF-1基因修饰骨髓基质干细胞复合PLGA移植修复关节软骨缺损

目的：研究人胰岛素样生长因子-1（hIGF-1）基因修饰的骨髓基质干细胞（MSCs）复合PLGA材料移植对关节软骨缺损的修复作用.方法：从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出hIGF-1基因,亚克隆后酶切出目的片段插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,鉴定后转染兔MSCs并检测hIGF-1在其中的表达;将转染细胞复合PLGA支架材料立体培养后植入实验性兔关节软骨缺损处,不同时间取材,检测对软骨缺损修复的效果.结果：成功构建了GFP标记的真核载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,并在靶细胞中得到理想表达;hIGF1基因修饰的MSCs复合支架材料移植明显促进了缺损软骨的修复质量,组织学评分与对照组相比有统计学差异（P＜0.05）.结论：IGF-1是软骨组织工程种子细胞MSCs基因修饰的理想候选基因,以之修饰的MSCs作为种子细胞可以明显提高组织工程方法对软骨缺损的修复效果.     

EGFP逆转录病毒载体构建及在人骨髓间质干细胞中的表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)逆转录病毒载体,转染人骨髓间质干细胞(hMSCs),探讨EGFP作为组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法:构建携带EGFP基因的逆转录病毒载体,用阳离子脂质体介导法将病毒质粒导入包装细胞,取阳性包装细胞克隆的病毒上清感染hMSCs,筛选稳定表达EGFP的细胞克隆(hMSCs-EGFP),MTT法测定hMSCs-EGFP的生长曲线。结果:病毒上清转染hMSCs后,绿色荧光蛋白能稳定表达一个月以上,生长曲线显示转基因细胞增殖速度和未转染细胞无明显差别。结论:hMSCs转染EGFP后,不影响其生长,EGFP可作为组织工程种子细胞良好的示踪剂。     

人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中的高效表达

目的为了获得基因工程重组人胰岛素样生长因子1。方法采用Trizol试剂法，从人胎肝中提取，6-RNA，RT-PCR扩增得到人胰岛素样生长因子1基因，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶酶切后，将该基因片段插入表迭栽体pkk223—3，筛选得到了重组质粒pkk-hIGF1。结果加IPTG诱导该质粒转化的大肠杆菌JM109表达，hIGF1的表达水平约30mg／L。结论用肝素亲和层析的方法，获得了电泳纯基因工程重组人胰岛素样生长因子1样品。纯化样品的理化及生物活性分析与天然对照品完全一致。     

人胰岛素样生长因子-1稳定表达细胞株的构建及鉴定

目的 :建立稳定表达人胰岛素样生长因子 - 1 ( h IGF- 1 )的细胞株。方法 :用脂质体转染法将含有 h IGF- 1 c DNA的真核表达载体转染 BHK细胞 ,经 G41 8筛选 ,形成阳性细胞克隆。继续培养4周 ,进行原位杂交和免疫细胞化学检测。结果 :原位杂交检测在转染细胞的胞浆中有棕黄色颗粒样阳性杂交信号 ;免疫细胞化学检测在转染细胞的胞浆中有氯化镍蓝色阳性信号。结论 :G41 8筛选后所获得的阳性细胞克隆 ,继续培养 4周 ,原位杂交和免疫细胞化学检测表明 h IGF- 1基因得到稳定表达     

含hIGF-1基因腺病毒的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,然后转染兔骨髓间充质干细胞并检测其表达.方法根据GenBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T载体,鉴定后酶切出目的基因插入pAdtrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-hIGF-1,经Pme Ⅰ线性化后采用电穿孔法转化至已包含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌中,挑选同源重组质粒线性化后转染HEK293细胞收获腺病毒,然后转染靶细胞兔骨髓间充质干细胞,通过绿色荧光蛋白表达情况以及流式细胞仪、免疫细胞化学等方法检测hIGF-1的表达.结果成功构建了绿色荧光蛋白基因标记的腺病毒Ad-hIGF-1,并在兔骨髓间充质干细胞得以高效表达.结论Adeasy腺病毒系统是基因转染的高效载体系统.腺病毒Ad-hIGF-1转染的骨髓间充质干细胞可作为基因修饰的软骨组织工程种子细胞.     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨对大鼠骨髓基质细胞进行重组人血管内皮细胞生长因子(VEGF)165基因修饰的可行性。方法采用全骨髓细胞贴壁培养法获得稳定的大鼠骨髓基质细胞,分别在脂质体LipofectamineTM2000和新型的阳离子聚合物Sofast介导下行pcDNA3.1-VEGF165转染骨髓基质细胞,在倒置显微镜下观察转染后细胞形态和生长情况的变化,通过免疫细胞化学鉴定VEGF在细胞中的表达情况。结果脂质体LipofectaminTM和新型阳离子聚合物Sofast介导转染的阳性细胞率分别为11.34%和11.42%,两者无明显差异。而细胞存活率分别为74.60%和85.88%,后者稍高于前者(P<0.05)。结论真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165可以成功地在骨髓基质细胞中表达,新型阳离子聚合物Sofast的转染效率与传统的脂质体无明显差异,而细胞毒性略小于传统的脂质体。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子(VECF)基因修饰的免骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法 制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VFGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VECF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性。结论 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

骨形态发生蛋白-7基因转染骨髓基质细胞后的表达

为了观察重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因转染骨髓基质细胞（BMSCs）后的表达及表达产物对BM-SCs增殖的影响，用脂质体介导法将rhBMP-7基因转染BMSCs，用逆转录PCR技术和免疫组化SABC法分别检测其瞬时表达和稳定表达；再用^3H-TdR掺入法检测基因表达产物对正常培养的BMSCs增殖的影响。结果表明：转基因细胞能高效表达外源基因，且表达时间长达4周；基因表达产物能明显促进BMSCs的增殖。该结果为基因增强的组织工程技术用于关节软骨缺损的修复提供了理论依据。     

微管在骨髓基质细胞向肌细胞分化过程中的表达

目的 探索微管在骨髓基质细胞（BMSCs）向肌细胞分化过程中的动态变化，为研究BMSCs向肌细胞分化的信号传导途径提供思路。方法 实验分3组，A组：单纯培养BMSCs；B组：将BMSCs与心肌细胞共同培养．但两种细胞不相互接触；C组：将BMSCs与心肌细胞共同培养，使细胞间相互接触，以模拟其所处的心脏微环境。使用4，6-二胺基苯吲哚（DAPI）标记BMSCs并追踪微管组装的动态过程，分析各组BMSCs的形态结构和表型的变化。结果 A、B组BMSCs无明显改变。C组BMSCs在共同培养7d后，与相邻的心肌细胞形成同步收缩的细胞团块，邻近心肌细胞的BMSCs首先表现出微管的组装明显增加，随后才表达出肌细胞特异性蛋白。结论 BMSCs与心肌细胞相互作用过程中，微管可能起信号传导作用，心肌细胞对邻近BMSCs的周期性机械牵拉作用是促进微管的组装及细胞分化的关键因素。     

人胚胎骨髓基质干细胞的长期培养及体外成骨特性

研究了人胚胎骨髓基质干细胞(hBMSCs)在体外长期培养时的基本特性和向成骨细胞的分化能力。结果表明：前三代hBMSCs多数呈长梭形,生长快速,增殖能力强;而后几代细胞变得比较扁平,生长缓慢,增殖能力下降;至第六代,细胞已失去增殖能力。每一代细胞生长均分为延滞期、对数生长期和稳定期,延滞期一般为6～7d,对数生长期为4～5d,最后是稳定期。前三代细胞对数生长期的群体倍增时间(PD71)基本相同,而第四代细胞的PDT略有上升,第五代细胞的PDT最大。在体外扩增能力方面,前三代细胞均可以扩增18倍左右,而第四、第五代细胞则下降至11倍、5倍。实验结果表明扩增后的细胞经过诱导可以形成钙化小结,与未诱导细胞相比碱性磷酸脂酶(ALP)活性显著提高。     

血清浓度对小鼠骨髓干细胞生物特征的影响

目的：研究不同血清浓度处理对小鼠骨髓干细胞生物特性的影响。方法小鼠全骨髓培养法培养细胞,原代细胞用10%、15%、20%血清体积分数的培养基,观察细胞形态及增殖情况。结果细胞在血清浓度为10%的培养基中增殖速度快,细胞形态以梭型为主;血清浓度为20%时细胞胞体面积增大,且增殖速度减慢。结论体外培养小鼠骨髓干细胞的最佳血清体积分数为10%。     

人骨形成蛋白-7真核表达质粒的构建及其在骨髓基质细胞的表达

目的 利用基因工程原理构建pIRES2-EGFP-hBMP-7真核表达质粒并检测其在Beagle犬骨髓基质细胞(BMSC)的表达.方法 利用DNA重组技术,将hBMP-7片段克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,EcoRⅠ单酶切、PCR及序列分析鉴定获得的重组质粒;脂质体介导的方法转染Beagle犬BMSC;免疫组织化学染色检测hBMP-7基因的表达.结果 hBMP-7被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP中,转染BMSC 24h后可观察到转染的BMSC表达绿色荧光蛋白,48h后转染效率达到31%.免疫组织化学染色证实重组pIRES2-EGFP-hBMP-7在BMSC中的表达.结论 利用基因工程原理成功构建真核表达质粒pIRES2-EGFP-hBMP-7,并可在BMSC中表达.     

60Co-γ射线对小鼠骨髓基质细胞表达血管内皮生长因子的影响

目的 探讨辐射对培养小鼠骨髓基质细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响及凋亡率变化。方法 采用流式细胞术和RT—PCR法。结果 经8．oGy射线照射后1h，骨髓基质细胞VEGF mRNA水平即较正常对照显著升高，12h达到高峰，24h恢复至正常水平；照射后不同时间，骨髓基质细胞凋亡率与正常对照无显著差异。结论 8．oGy^60Co—γ射线照射后骨髓基质细胞中VEGF mRNA表达增强，这可能与骨髓基质纫胞的辐射抵抗能力有关。     

绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶在骨髓基质细胞中的表达

目的研究反转录病毒介导的绿色荧光蛋白(EGFP)基因和酪氨酸羟化酶(TH)基因在原代培养的骨髓基质细胞(bMSCs)中的表达情况。方法体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs,原代培养8~10 d后,同时利用含EGFP和TH基因的反转录病毒上清依次转染bMSCs并进行抗性筛选,7~10 d可得到稳定表达EGFP的bMSCs,在稳定转染EGFP后10 d进行TH病毒上清的转染,7~10 d可得到稳定表达TH和EGFP的bMSCs。结果原代培养bMSCs 3~4 d后生长至70%~80%汇合,病毒转染EGFP后第2天,细胞呈现弱荧光,经G418筛选2~3 d后出现阳性细胞,约8~10 d生长融合,阳性率60%~70%,第2~5代阳性细胞比率无明显变化。TH阳性率也达60%以上。结论利用反转录病毒载体可有效地将EGFP和TH基因转至bMSCs中,并能在体外稳定表达传代。这种表达EGFP和TH的bMSCs对于研究bMSCs的体内迁移分化及帕金森病(PD)的基因治疗具有重要意义。     

二甲亚砜诱导人骨髓基质干细胞心肌分化中的基因表达

目的 研究二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)诱导人骨髓基质细胞(hurman bone marrow stromal cells，hBMSC)心肌分化过程中心肌特异转录因子和心肌基因的表达变化。方法 取第8代hBMSC，以DMSO诱导24h。在诱导后21天，通过免疫荧光染色检测干细胞标志C1390和肌性标志Dmmm表达变化，并在诱导后1、2、3周提取RNA。以RT-PCR方法检测细胞心肌特异转录因子(Nkx2．5和CATA4)和特异基因(connexin43、ANP等)的表达变化。结果 经DMSO诱导后，MSC体积变大，细胞排列趋于一致，连接紧密，并逐渐形成肌节样结构，CD90阳性细胞减少，Desmin阳性细胞增加。在DMSO诱导hBMSC后1周，开始可检测到细胞发生转录水平变化(Nkx2．5、GATA-4表达和connexin43、ANP表达)，并均可持续至诱导后3周；前三者的表达量有随诱导后时问延长而增加的趋势。结论 DMSO在体外可诱导hBMSC向心肌前体细胞分化，DMSO可能通过诱导心肌特异转录因子的表达而启动hBMSC心肌化的过程。