皮肤全层缺损真皮修复不同阶段对表皮再生的影响

背景：当前组织工程研究多着重表皮干细胞和真皮支架材料的研究,而少有真皮新生速度和真皮修复不同时期组织结构对表皮新生和重建影响的报道。 目的：观察真皮修复过程中对表皮修复和重建的影响以及是否有促进表皮修复速度的最佳阶段。 方法：新西兰大耳白兔10只分别于第0,7,14天在背部制成3个直径约为3 cm的创面,随机分为0,7,14 d组,每组计10个创面,3组创面分别于皮肤全层损伤修复后21,14,7 d植入自体表皮细胞羊膜载体复合膜。7 d后取材,采用大体观察、常规组织学观察(苏木精-伊红染色,Mallory PTAH染色)、Ⅰ型胶原免疫组织化学观察等化学染色动态观察创面愈合情况。 结果与结论：0 d组创面与周边正常有毛皮肤齐平,与周边组织连接明显较7 d组及14 d组紧密,7 d组尚有凹面,而14 d组创面凹陷明显较7 d组大而深,与周边组织分界明显,这表明0 d组皮肤缺损的修复效果明显优于其他2组(P < 0.05)。 0 d组Ⅰ型胶原阳性的成纤维细胞、血管及胶原纤维等组成的真皮网状层和乳头层较其他2组明显(P < 0.05),创面愈合率高(P < 0.05)。真皮修复的不同时期,对表皮再生的促进作用存在不同,全层皮肤缺损处于真皮修复的增生晚期与重建初期是促进表皮新生的最佳阶段。 关键词：表皮再生;羊膜;碱性成纤维生长因子;维生素C;皮肤缺损;皮肤组织工程     

组织工程皮肤移植过程中白细胞介素10和肿瘤坏死因子α的表达

背景：白细胞介素10和肿瘤坏死因子α在异体异种皮肤移植局部免疫与排斥反应中发挥了重要作用。但在组织工程人工皮肤移植过程中局部皮肤组织内白细胞介素10和肿瘤坏死因子α的表达情况目前尚不清楚。 目的：采用表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤并移植修复兔全层皮肤缺损创面,观察创面修复效果和局部皮肤组织白介素10与肿瘤坏死因子α的表达变化。 方法：将体外培养的人表皮干细胞或角质细胞接种到脱细胞真皮支架中,构建组织工程人工皮肤;取新西兰白兔常规制作背部全层皮肤缺损创面随机分为4组,表皮干细胞组、角质细胞组用含表皮干细胞或角质细胞的组织工程皮肤移植于皮肤缺损创面;脱细胞真皮组移植单纯脱细胞真皮;对照组创面空置。观察创面修复情况,局部炎症反应,创面愈合时间。各组分别于术后7d在部分创面取材观察组织形态和白细胞介素10与肿瘤坏死因子α表达。 结果与结论：含表皮干细胞的人工皮肤移植后创面愈合良好,局部炎症反应轻微,无出血、积脓、坏死,创面愈合时间较角质细胞组明显缩短。白细胞介素10在各组均有表达,其中表皮干细胞组表达最强,角质细胞组次之,脱细胞真皮组和对照组最弱。肿瘤坏死因子α在各组也均有表达,其中角质细胞组表达最强,表皮干细胞组次之,脱细胞真皮组和对照组较弱。说明以表皮干细胞作为种子细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤可用有效促进皮肤缺损创面的修复治疗,创面修复过程中局部皮肤组织内白细胞介素10和肿瘤坏死因子的表达变化可能是其取得较好效果的主要机制之一。     

人去表皮真皮细胞活性及组织结构特征

背景: 研究证实,去表皮的真皮可以作为真皮替代物,在其上接种角质形成细胞后形成表皮结构。但有关真皮替代物细胞生物活性、组织结构特点及基底膜成分分析的研究报道较少。 目的：观察人去表皮真皮细胞活性及组织结构特征。 方法：将健康成人皮瓣用56 ℃ PBS溶液处理以去除表皮,用液氮连续冻融处理去除真皮中细胞成分,获得去表皮真皮。以组织块培养法观察去表皮真皮细胞活性。以苏木精染色检测去表皮真皮细胞核,以波形蛋白免疫组化检测去表皮真皮成纤维细胞成分。以PAS染色及Ⅳ型胶原免疫组化检测基底膜及其成分。以VG染色检测去表皮真皮胶原纤维,Weigert染色检测弹力纤维,VG与Weigert双染色检测胶原纤维及弹力纤维,透射及扫描电镜观察去表皮真皮超微结构。 结果与结论：用组织块培养方法培养的去表皮真皮2周无细胞生长。苏木精-伊红染色显示去表皮真皮中无细胞核、波形蛋白免疫组化显示去表皮真皮中无波形蛋白表达。VG染色显示去表皮真皮胶原纤维染成玫瑰红色,Weigert染色显示去表皮真皮弹力纤维染成紫黑色,双染色进一步显示胶原纤维与弹力纤维均匀排列。去表皮真皮表面及附属器残留部位PAS反应强阳性,Ⅳ型胶原表达明显。透射及扫描电镜下观察到去表皮真皮中胶原﹑弹力纤维交错排列,间有孔隙,相互交织成网。去表皮真皮无活细胞成分,真皮基质表面及附属器管腔壁仍保留糖原﹑Ⅳ型胶原等基底膜成分,真皮基质中富含胶原及弹力纤维,是一种类似在体真皮的三维胶原基质。     

异体异种脱细胞真皮与自体刃厚皮复合移植的比较

背景：尽管真皮基质的生物模板作用可减少瘢痕形成, 改善创面愈合质量已得到共识,但不同种属脱细胞真皮基质作为真皮添充物的成活机制和重建过程等生物学性能是否有差异仍需进一步探讨。 目的：对比分析异体及异种脱细胞真皮基质与自体刃厚皮复合移植的近期效果。 设计、时间及地点：随机分组,自身对照观察实验,于2008-01/06在海南省人民医院医学动物实验中心完成。 材料：J-1 型人脱细胞异体真皮基质由北京桀亚莱福生物技术有限公司提供。小型香猪1只以低含量胰蛋白酶消化加反复冻融法制备制备猪脱细胞真皮基质。 方法：选取近交系小型香猪15 只,在每头猪脊背两侧制作6 cm×6 cm全层皮肤缺损创面各3处,共6处,按移植物的不同将创面随机分为3组：猪脱细胞真皮基质与猪刃厚自体皮复合移植组与人脱细胞真皮基质与猪刃厚皮复合移植组在脱细胞真皮基质植入后,在其表面重叠覆盖自体刃厚皮,对照组单纯行猪薄皮片移植。 主要观察指标：移植后9 d、21 d及3个月各组移植物成活情况、创面收缩率和组织学变化。 结果：移植后第9,21天各组移植皮片大部分均成活良好,局部无红肿,3个月时两复合移植组皮肤外观相似,均光滑、柔软、丰满、有弹性,与周围正常组织结合部平坦, 对照组创面收缩凹陷明显,皮片薄弱,韧性也较复合移植组差,3组移植物成活率差异无显著性意义(P > 0.05),自体刃厚皮移植创面收缩率高于其他两组(P < 0.05)。移植后8 d,2个复合移植组脱细胞真皮基质引导形成丰富的毛细血管结构, 复合皮表皮层形成且分化良好;移植后21 d,已有完整的皮肤结构, 真皮层内可见胶原纤维排列规整,表皮-真皮连接区“钉突”结构明显,移植后3个月结构更加接近正常真皮,对照组组织致密,胶原排列紊乱,与瘢痕组织结构相似。 结论：与自体皮复合移植时, 异体及异种脱细胞真皮基质具有相近的生物学性能,且效果优于单纯刃厚自体皮移植。     

羊膜负载表皮干细胞促进糖尿病大鼠创面的愈合

背景：表皮干细胞作为皮肤组织的特异性干细胞,具有强大增殖及多向分化潜能,与创面修复紧密相关。近期研究表明糖尿病皮肤创面愈合过程中表皮干细胞数量减少、活性降低是导致其创面难愈的重要原因。 目的：观察表皮干细胞在糖尿病大鼠创面愈合中的作用。 方法：分离培养及鉴定SD大鼠表皮干细胞,并以BrdU标记。建立糖尿病SD大鼠创面模型,抽签法随机分为3组：表皮干细胞组创面移植羊膜负载BrdU标记的表皮干细胞;羊膜组创面移植羊膜;空白对照组创面未给予干预。 观察创面愈合情况、计算创面愈合率,苏木精-伊红及免疫组织化学SP法检测创面愈合组织中BrdU及增殖细胞核抗原表达。用图像分析软件测量阳性细胞积分吸光度平均值。 结果与结论：表皮干细胞组治疗后7d创面缩小明显,治疗后14 d创面基本愈合,创面愈合率明显高于羊膜组、空白对照组 (P < 0.01)。表皮干细胞组创面及新生表皮中可见BrdU阳性细胞,而另两组皮肤创面组织中始终未见BrdU阳性细胞。各组创面组织中可见增殖细胞核抗原阳性细胞表达,但表皮干细胞组的阳性细胞积分吸光度平均值与羊膜组、空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)。结果证实糖尿病大鼠创面愈合过程中表皮干细胞与创缘表皮移行、创面的上皮化有直接关联,可有效促进其创面愈合。     

组织工程皮肤的构建及组织形态学观察

背景：应用于临床的组织工程皮肤具有血管化速度慢、力学强度差以及无法永久性保留等局限,因此,需要对相关技术环节进行改进以制备一种合适的永久性皮肤替代物。 目的：建立一种构建有活性的双层组织工程皮肤的方法,并对其组织形态学进行观察。 方法：以Ⅳ型胶原和成纤维细胞联合修饰的同种脱细胞真皮基质为支架,与表皮干细胞复合后依次经浸没式培养和气液分离界面培养构建组织工程皮肤,利用光镜和扫描电镜对其组织学特点进行观察和分析。 结果与结论：以表皮干细胞和同种脱细胞真皮基质制备的组织工程皮肤具有表、真皮双层结构,其中表皮由多层不同分化程度的表皮细胞组成,真皮为天然三维孔隙结构,胶原纤维完整,且表皮层与真皮层紧密连接,形成整体结构,可满足全层皮肤替代物的基本组织学要求。     

肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞异体移植修复烧伤创面

背景：经携带人肝细胞生长因子的重组腺病毒（adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor，Ad-HGF）修饰的骨髓间充质干细胞创面移植后，可分化为“修复细胞”，并能够在创面持续释放肝细胞生长因子。 目的：观察Ad-HGF基因转染的骨髓间充质干细胞异体移植对大鼠烧伤创面愈合的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物观察，于2006-02/2007-03在解放军兰州军区兰州总医院临床实验科和烧伤整形科实验室完成。 材料：Wistar大鼠40只，由解放军兰州军区兰州总医院动物实验科提供。Ad-HGF与携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒（adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor，Ad-GFP）颗粒均由哈小琴博士惠赠。 方法：取雄鼠10只，Percoll密度梯度离心法体外分离培养骨髓间充质干细胞，并行Ad-HGF转染。取雌鼠30只，随机分为未转染细胞组、Ad-HGF转染细胞组、Ad-GFP转染细胞组、Ad-HGF对照组、假伤组，6只/组。前4组大鼠复制背部深Ⅱ度烧伤模型，并分别于创面真皮层下方多点注射对应的细胞悬液或病毒悬液1 mL；假伤组大鼠背部剃毛后浸入37 ℃温水12 s模拟烧伤，同法注射等量生理盐水。 主要观察指标：对采集的创面标本行组织学观察和羟脯氨酸含量测定，采用免疫组化分析创面肝细胞生长因子的表达。 结果：苏木精-伊红染色结果显示，Ad-HGF转染细胞组移植后7 d创面表皮化优于其他组，至21 d再生表皮明显厚于其他组，并可见真皮钉脚下伸。胶原特殊染色结果显示，Ad-HGF转染细胞组移植后7，21 d创面中的胶原排列较其他组整齐。移植后7 d，Ad-HGF转染细胞组羟脯氨酸含量显著低于其他组（F=3.216，P < 0.01）。移植后21 d，Ad-HGF转染细胞组愈合创面中肝细胞生长因子的阳性表达位于真皮层，表达强度明显强于其他组。 结论：Ad-HGF基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞异体移植后，对烧伤创面愈合存在一定的促进作用。     

烫伤创面愈合后的瘢痕形成与神经支配*★

背景：既往研究表明神经因素在创面愈合中具有重要调控作用，但有关神经调节与创面愈合后瘢痕形成之间的关系鲜有报道。 目的：观察烧伤创面愈合过程中神经支配与创面愈合质量之间的关系。 方法：将30只大鼠右侧T9~L1阶段脊神经根切断，制作失神经支配皮肤模型；然后在大鼠背部右侧失神经支配皮肤区域制作直径4 cm的深Ⅱ度烫伤创面，设为模型组，左侧对称正常皮肤制作同样的创面，设为对照组，伤后连续观察创面变化，于7，14，21 d采用免疫组织化学法观察Ⅰ和Ⅲ胶原分泌情况，并计算Ⅰ/Ⅲ型胶原比例的变化，探讨创面愈合速度及愈合质量。 结果与结论：模型组Ⅰ，Ⅲ型胶原分泌和Ⅰ/Ⅲ型胶原比值于伤后各时间点均显著低于对照组(P < 0.05)。模型组Ⅰ型胶原分泌与伤后7，14，21 d逐渐增加(P < 0.05)，Ⅲ型胶原于伤后21 d时分泌明显增高(P < 0.05)，Ⅰ/Ⅲ型胶原比值与伤后21 d时明显降低(P < 0.05)。结果证实，创面早期神经支配可以促进创面愈合，创面重塑期减轻神经支配可能会改善创面重塑质量。     

组织工程同种异体脱细胞真皮复合自体刃厚皮微粒皮移植

为观察组织工程同种异体脱细胞真皮复合自体刃厚皮、微粒皮移植的临床应用效果，选择2005-04/2008-06海南省农垦三亚医院烧伤整形科严重烧伤和瘢痕患者8例12个创面，采用脱细胞真皮复合自体刃厚皮片、脱细胞真皮复合自体微粒皮移植修复创面。12创面中，10个创面复合皮完全成活，1个创面出现散在点状坏死,经换药8 d愈合。1例植皮部分成活，经补充游离植皮后创面愈合。随访6~12个月，复合移植皮肤质地柔软，弹性良好，无瘢痕增生，类似全厚皮片。提示采用脱细胞真皮复合自体刃厚皮、微粒皮移植修复严重烧伤创面，疗效满意，没有排斥反应，是理想的治疗方法。     

糖尿病大鼠表皮干细胞的分离培养及特性

背景：表皮干细胞作为皮肤组织特异性干细胞,在创面修复中发挥关键作用。但有关糖尿病皮肤来源的表皮干细胞体外分离培养及生物特性研究较少。 目的：探索糖尿病大鼠表皮干细胞体外分离培养的方法及其生物特性,为糖尿病难愈创面的防治及机制研究提供实验依据。 方法：SD大鼠随机分成糖尿病组和正常对照组。糖尿病组采用一次性腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型,正常对照组不作处理。分别取成模糖尿病和正常大鼠背部全层皮肤,采用酶消化联合Ⅳ型胶原黏附法分离培养大鼠表皮干细胞。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和细胞克隆形成,细胞计数绘制生长曲线,计算克隆形成率,免疫细胞化学染色和图像分析软件鉴定K19、β1-integrin阳性表达和测定阳性细胞的积分吸光度(IA)值。 结果与结论：糖尿病组大鼠表皮干细胞原代贴壁数量较少,其克隆形成率明显低于正常对照组(P < 0.01)。表皮干细胞的K19、β1-integrin均呈阳性表达,糖尿病组阳性细胞的IA值均低于正常对照组(P < 0.01)。结果提示,运用酶消化联合Ⅳ型胶原黏附法可以实现糖尿病大鼠表皮干细胞的体外分离培养;糖尿病大鼠表皮干细胞体外增殖能力较正常皮肤增殖能力弱,这可能是导致糖尿病创面难愈合的重要因素之一。