胚胎后肾间充质干细胞的分离和生物学特性研究

目的探讨建立一种简便有效的体外分离纯化大鼠胚胎后肾问充质干细胞（MMSCs）的方法,并研究MMSCs的生物学特性。方法孕14天清洁级SD大鼠,脱颈处死后取其胚胎,分离胚胎肾,剪碎后置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养;于倒置显微镜下观察培养细胞形态变化,利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定MMSCs的生长曲线,经流式细胞仪检测CD45、CD90及CD133的表达。结果培养细胞呈现梭形或类纤维样,贴壁生长,增殖对数期始于接种后2～3人,5～6天后增殖能力减慢,渐进入平台期。CD45、CD90和CD133表达率分别为1．94％、95．43％和95．31％。结论培养细胞为胚胎后肾问充质十细胞,符合间充质干细胞特性。     

大鼠骨髓间质干细胞培养扩增及表面标志

目的 建立体外分离培养大鼠骨髓间质干细胞(MSC)方法．探讨MSC的扩增与鼠龄的关系及其部分细胞表面标志的动态改变。方法 分别取2月龄和5月龄鼠骨髓，经密度梯度离心后取单核细胞层接种．待细胞长满后进行传代．隔日行细胞计数。对2月龄鼠的4代MSC分别进行表面标志抗原动态观察。结果2月龄鼠MSC的扩增率明显高于5月龄鼠MSC。流式细胞仪鉴定显示随着传代次数增多，CD29阳性率趋向升高；CD90阳性率趋于降低；CD34与CD45阴性率趋于升高。结论 进行大鼠MSC培养扩增时MSC的取材可能要考虑大鼠月龄。在MSC培养扩增的过程中其表面抗原标志会发生变化．这些变化可能表示了细胞纯度的变化。     

成人骨髓间充质干细胞体外培养方法的建立及生长特性分析

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MMSCs)体外分离培养和扩增方法,观察MMSCs在体外培养的生物学特性,为MMSCs的临床应用奠定技术基础.方法 采集成人骨髓,密度梯度法分离单个核细胞,利用DMEM/F12培养基添加自体血清进行黏附培养和扩增MMSCs,光镜观察MMSCs生长和形态变化,计数和MTT法观察原代和传代培养的增殖及生长特征,免疫组化法分析MMSCs纯度.结果 MMSCs贴壁生长,呈典型MMSCs形态和生长特征,原代及传代5代内的MMSCs均有活跃的增殖能力,其中CD105阳性细胞＞98%.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法可获得高纯度和高增殖活性的MMSCs,成人MMSCs至少在传代培养5代内生长旺盛并维持其生物特性,可满足临床治疗和人体生物组织研究要求.     

SD大鼠胚胎后肾间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的 对SD大鼠胚胎后肾间充质细胞(MMSCs)进行分离培养,并检测其生物学特性.方法 采用胚胎后肾微组织块接种培养法,检测其生长曲线和生长周期,并进行细胞表面抗原和成骨能力的鉴定.结果 MMSCs体外培养生长状况良好,具有活跃的增殖能力.细胞周期显示90%以上细胞处于G0/G1期.表面抗原检测绝大多数细胞阳性表达波形蛋白(vimentin)和纤维连接蛋白(fibronectin),几乎不表达CD34.在体外能够向成骨细胞分化.结论 原代分离、培养的细胞为MMSCs,细胞纯度高、扩增迅速、生物学性状稳定,可为组织工程提供比较理想的种子细胞.     

调节性T细胞与老年性骨质疏松的关系

目的检测不同年龄组雄性SD大鼠血调节性T细胞(Treg)数量占CD4+T细胞百分比,了解Treg细胞对老年性骨质疏松症的影响.方法选取6~8周龄、6月龄、12月龄、24月龄雄性SD大鼠每组各10只作为研究对象,采用双能X线吸收仪(DEXA)检测大鼠股骨、脊柱、骨盆、全身的骨密度;大鼠心脏采血,采用CD25+联合Fox P3+表达来描述Treg细胞,流式细胞仪测定血Treg数量占CD4+T细胞的百分比.结果 (1)6~8周龄组、6月龄组、12月龄组、24月龄组Treg数量不同,差异有统计学意义(P<0.01).6~8周龄组Treg数量百分比低于6月龄组、12月龄组、24月龄组,差异有统计学意义(P<0.01);6月龄组Treg数量百分比低于12月龄组、24月龄组(P<0.05);24月龄组Treg数量百分比低于12月龄组比较,但差异无统计学意义(P>0.05).(2)Treg数量占CD4+T细胞百分比与股骨、脊柱、骨盆、全身骨密度值均成正相关,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 (1)6~8周龄组、6月龄组、12月龄组、24月龄组Treg数量占CD4+T细胞百分比不同,6~8周龄时最低,6月龄时开始升高,12月龄时达到最高值,24月龄时出现下降,提示不同年龄组大鼠Treg数量占CD4+T细胞有明显差异(P<0.05).(2)Treg数量占CD4+T细胞百分比与检测部位骨密度值呈正相关性,提示随着Treg数量百分比的增高,骨吸收减少,骨密度值升高,随着Treg数量百分比的降低,骨密度降低,鉴于随着年龄的增长,Treg数量出现下降,推测外源性注射Treg可抑制破骨细胞性骨吸收,可成为治疗老年性骨质疏松的新方向.     

鼠龄对大鼠骨髓干细胞生长情况的影响

目的研究鼠龄对骨髓间充质干细胞(MSCs)生长情况的影响。方法用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化不同鼠龄的MSCs,传代扩增,测定生长曲线,进行形态学观察。结果 3d鼠和1月龄鼠MSCs的增殖能力显著高于6月龄和12月龄鼠,而3 d鼠与1月鼠MSCs的增殖能力无明显差异。结论 3 d鼠和1月龄鼠比6月龄鼠、12月龄鼠,更适于MSCs的提取、移植。     

大鼠主动脉超微结构增龄性变化研究

目的 对不同月龄大鼠主动脉超微结构进行研究以期发现其老化特征.方法 采用三组Wistar大鼠(分别为1月、6月、20月龄,各10只)主动脉组织制成电镜标本,观察其超微结构.结果 主动脉组织超微结构:6月龄大鼠与1月龄相比基本相似,而胶原纤维增多,平滑肌细胞器增多.20月龄大鼠与6月龄相比,主动脉内弹性膜出现断裂,弹性纤维相对减少,胶原纤维相对增多,平滑肌细胞突起增多,细胞核形状不规则,细胞器体积增大,数目增多.结论 大鼠血管平滑肌细胞及其它成分的超微结构显示大鼠发育性改变和老化性改变的特点.     

体外培养甲状腺细胞IGF-1mRNA在大鼠增龄的表达

【目的】探讨体外培养F344大鼠甲状腺细胞胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因表达不同鼠龄改变规律,以及观察IGF-1在衰老中的意义。【方法】选择大鼠10周、45周、65周、100周、150周5个鼠龄组的甲状腺,用原代培养法的改良方法进行培养。45周、100周、150周的大鼠甲状腺细胞培养至14d抽提细胞内总的RNA。应用RT-PCR方法检测甲状腺细胞IGF-1mRNA表达情况,并进行各鼠龄组比较。【结果】各鼠龄组体外培养至14d的甲状腺细胞所抽提细胞内总的RNA量随着鼠龄增加而降低,各组比较差异有统计学意义;各鼠龄组甲状腺细胞均检测到IGF-1的mRNA表达。IGF-1mRNA的表达量于10周的大鼠组较低,45周的大鼠组最高,之后随着鼠龄增加而逐步降低,其表达量与鼠龄明显相关。【结论】体外培养大鼠甲状腺细胞的总RNA量随着鼠龄增加而降低,各鼠龄组甲状腺细胞均表达IGF-1mRNA,其表达量随鼠龄增加而改变。     

豚鼠骨髓间充质干细胞分离培养及形态学观察

目的：分离和培养豚鼠骨髓间充质干细胞（MMSCs）,并通过观察了解其细胞生物学特性。方法：利用MMSCs和其它细胞不同的生长特性,采用细胞差速贴壁法,以含10%（体积分数）标准胎牛血清的L-DMEM培养基培养;用2.5%胰蛋白酶、37℃条件下消化,按1∶2的比例传代;倒置相差荧光显微镜下逐日观察各代MMSCs形态及生长情况。结果：经数次换液和连续传代培养,红细胞等杂质逐渐减少,可得到形态较均一的MMSCs,其增殖速度和细胞活性良好。结论：细胞差速贴壁法经济可靠、操作简单、易于掌握,是体外分离培养MMSCs的可行的实验方法;以此法获得的豚鼠MMMSCs生长旺盛,活性好,增殖能力强。     

TNFα导致肝星状细胞激活的观察

目的：通过电镜观察，探讨TNFα和肝星状细胞激活的关系。方法：采用体外培养大鼠HSC，将细胞分为对照组和TNFα组，收集细胞制作电镜标本，在透射电镜下观察HSC的形态学的改变。结果：电镜下见TNFα组细胞体积增大，可见粗面内质网数量明显增多，线粒体、内质网呈轻度扩张，呈明显激活样改变。结论：TNFα对HSC有增殖激活的作用。     

复方甘草酸苷辅助治疗艾滋病临床研究

目的:探讨复方甘草酸苷治疗艾滋病的疗效.方法:40例艾滋病病例分为两组,在抗病毒药物治疗基础上,治疗组加用复方甘草酸苷,两组均6个月为1疗程.观察CD4 T细胞计数、外周血淋巴细胞表面CD38的表达情况及服药后的副反应.结果:治疗6月后,治疗组CD38下降较对照组明显,CD4升高更显著,HAART后服药的副反应更少.结论:在抗病毒治疗基础上,加用复方甘草酸苷,对艾滋病的治疗有益.     

CD3AK细胞和LAK细胞的表型测定

用抗ＣＤ＿３抗体和低剂量ＩＬ－２以及单独用高剂量ＩＬ－２分别诱生正常鼠、免疫鼠脾细胞为ＣＤ＿３ＡＫ细胞和ＬＡＫ细胞。用间接免疫荧光法和微云细胞毒实验两种方法测定培养４ｄ和９ｄ的细胞表型。结果：正常鼠ＣＤ＿３ＡＫ和ＬＡＫ细胞中ＣＤ＿３与ＣＤ＿８阳性细胞率均高于诱生前正常鼠脾细胞（Ｐ＜０．０１）。正常鼠ＣＤ＿３ＡＫ细胞中，ＣＤ＿３与ＣＤ＿８阳性细胞率明显高于正常鼠ＬＡＫ细胞（Ｐ＜０．０１）。免疫鼠ＣＤ＿３ＡＫ与正常鼠ＣＤ＿３ＡＫ的表型相似，而免疫鼠ＬＡＫ细胞的ＣＤ＿８阳性细胞率显著增加，明显高于正常鼠ＬＡＫ细胞（Ｐ＜０．０１）。     

肝硬化患者外周血T细胞亚群检测及意义

应用 OKT 系列单克隆抗体,通过间接免疫荧光法,对25例肝硬化失代偿期患者及30例正常人外周血 T 细胞亚群进行检测。结果表明肝硬化患者 CD_8细胞阳性率高于正常组(P<0.01),CD_4/CD_(?)比值较正常组为低(P<0.01),提示肝硬化患者机体存在免疫功能紊乱。     

狼疮性肾炎不同中医证型Fas表达与凋亡的关系

目的探讨狼疮性肾炎（LN）不同中医证型肾组织、外周血淋巴细胞Fas表达与凋亡的关系。方法选择LN患者86例，行Fas、Bax、PCNA免疫组化检查，根据肾组织病变程度分为LNI～Ⅱ型和Ⅲ～Ⅳ型2组，ELISA检测sFas，流式细胞仪检测PBMC凋亡率、CD3^＋CD4^＋Fas等指标。结果①2组间PCNA、Fas在肾小球中表达有显著性差异，但Bax表达无显著差异；（多LN患者热毒炽盛型外周血PBMC凋亡率增高（P〈0．01）；2个证型组外周血CD3^＋CD4^＋，表达较正常组显著增多（P〈0．01）。结论LN患者热毒炽盛型肾小球内系膜细胞同时存在增生与凋亡2种状态,由于热毒炽盛型外周血sFas表达增多，抑制了Fas／sFas介导的凋亡，使肾小球内系膜细胞增生大于凋亡。     

结构脂肪乳对消化道肿瘤患者术后蛋白质代谢和免疫功能的影响

目的:探讨结构脂肪乳对消化道肿瘤患者术后蛋白质代谢和免疫功能的影响。方法:将消化道肿瘤患者80例双盲、随机分为结构脂肪乳(ST)组和物理混合的中/长链脂肪乳(MCT/LCT)组。于术后第1-6天接受等氮等热量肠外营养。对比观察术后两组患者一般情况、血浆蛋白质水平、氮平衡、免疫功能状况。结果:在进行6 d的肠外营养以后,两组患者生命体征、血常规、肝肾功能、血脂和全身副反应均无显著性差异;术后第5天,ST组蛋白质水平恢复至术前水平,IgG、IgA、IgM和CD3、CD4下降不明显(P>0.05);MCT/LCT组术后第7天蛋白质水平才恢复至术前水平,IgG、IgM、CD3和CD4下降明显(P<0.05);术后第5天、第7天,MCT/LCT组前清蛋白、转铁蛋白、纤维连接蛋白浓度、IgG、IgM、CD3和CD4均显著低于受试组;ST组氮平衡明显优于MCT/LCT组。结论:结构脂肪乳由于具有很好的节氮效果,能有效地改善手术创伤病人的蛋白质代谢,将有利于消化道肿瘤患者术后免疫功能的恢复。     

Graves病患者外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞变化的临床意义

对４４例Ｇｒａｖｅｓ病初治患者于治疗前检测外周血Ｔ淋巴细胞亚群及ＮＫ细胞活性，结果显示ＣＤ＿３细胞与正常对照组差异无显著性（Ｐ＞０．０５），ＣＤ４细胞低于正常对照组（Ｐ＜０．０５），ＣＤ＿细胞显著低于正常对照组（Ｐ＜０．０１），ＣＤ＿４／ＣＤ＿８值及ＮＫ细胞则显著高于正常对照组（Ｐ＜０．０１），并发现这些变化与Ｔ３、Ｔ４无显著相关性。对Ｇｒａｖｅｓ病的细胞免疫改变作了初步讨论。     

血栓闭塞性脉管炎患者血管壁的免疫病理学研究

目的:对血栓闭塞性脉管炎(Thrombaogiitis obliterans,TAO)患者的病变血管进行免疫病理学研究,以探讨血管壁的免疫损伤与TAO发病之间的关系.方法:以我院2005～2007年29例因TAO导致肢体坏死行截肢术的患肢血管为病例组,以我院同期32例因其他病因行截肢术的患肢血管为对照组,均以免疫组化SP法进行CD_3、CD_(20)染色,对阳性细胞数进行定量分析并与临床资料进行相关探讨.结果:TAO组中CD_3(+)、CD_(20)(+)细胞平均数较对照组均明显增高,两组间有显著差异(P<0.01).TAO组中CD_3(+)细胞平均数高于CD_(20)(+)细胞平均数,两者间有较显著差异(P<0.05).结论:TAO的发病与患者血管壁的免疫损伤关系密切,CD_3(+)细胞直接引起的免疫损伤在血管壁的免疫损伤中起更重要的作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞的优化获取及生物学鉴定

目的 优化骨髓间充质干细胞的体外获取方法并鉴定。方法 取幼年SD大鼠骨髓，分离骨髓间充质干细胞，观察细胞形态特征、生长状况及表面抗原表达。结果 分离培养的细胞有两种不同的形态，一种为小梭形细胞，一种为大扁平细胞。第9代以前生长性状稳定，增殖能力强，细胞倍增时间为48．2h；超微结构显示为早期幼稚细胞形态；免疫细胞化学检测细胞表达CD44、CD54、CD71，但不表达CD34、CD68、层粘连蛋白；在有限的传代数内，抗原表达无改变；与传统方法相比，细胞纯度高。结论 分离培养的细胞成分单一，具有干细胞特性，适用于干细胞生物学和组织工程学的研究。