广州地区3个鸭种1日龄雏鸭垂直感染鸭乙肝病毒调查

鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）与人乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）同属嗜肝ＤＮＡ病毒科，ＤＨＢＶ感染的鸭，可造成为较好的ＨＢＶ动物模型和作为嗜肝病毒科分子病毒学研究的材料。为查明不同鸭种的垂直感染情况，本文采用斑点杂交方法对广州地区３个主要鸭种１日龄雏鸭携带鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）进行了调查，广州麻鸭１日龄ＤＨＢＶＤＮＡ阳性率为１４／５０（２８％），樱桃谷鸭１日龄为２／１０（２０％），野水鸭１日龄为８／１０（８０％）。提示野水鸭垂直感染率最高，对追踪ＤＨＢＶ基因同源性和基因变异提供了良好的材料。     

鸭乙型肝炎动物模型的制备——DHBV经不同途径对雏鸭的实验感染

本实验对不同日龄雏麻鸭用含鸭乙型肝炎病毒(DHBV)鸭血清,经灌胃、静脉注射、肌肉注射等途径的人工感染,通过血清斑点杂交技术(~(32)P—DHBV DNA探针)、肝组织病理切片、电镜检查等方法,作动态观察,结果如下:①1～15d龄健康雏麻鸭94只,按日龄分组予DHBV灌胃后,经每周1次的反复采血检测,未发现血清DHBV DNA阳转者。②14d龄健康雏麻鸭30只,分组予静脉注射或肌内注射接种DHBV,1周后发现血清DHBV DNA阳转率分别为35.7％(5/15)和42.9％(6/15),2周后     

疏肝健脾祛湿中药体内抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究

目的：观察由疏肝健脾祛湿中药组成的加味四逆散醇提物体内抗鸭乙型肝炎病毒（DHBV）的作用。方法：采用先天感染鸭乙型肝炎病毒的广州麻鸭为动物模型，以斑点杂交法检测用药前后鸭血清DHBV—DNAOD值的变化，并以拉米夫定作阳性对照。结果：加味四逆散大剂量组用药第5天和第10天，血清DHBV—DNAOD值明显下降，与病毒对照组比较，差异有显著性（P〈0．05，P〈0．01），与自身用药前比较，差异有显著性（P〈0．05，P〈0．01）；加味四逆散中剂量组在用药第5和第10天，血清DHBV—DNAOD值明显下降，与病毒对照组比较差异有显著性（P〈0．05，P〈0．05）；与自身用药前比较，用药第10天，血清DHBV—DNAOD值明显下降，差异有显著性（P〈0．05）。结论：加味四逆散大、中剂量在鸭体内有抗乙型肝炎病毒作用。     

复方药物ZL-1在鸭乙型肝炎病毒实验感染模型中抗病毒作用的研究

目的　研究中药复方ZL 1在鸭乙型肝炎病毒 (DHBV)持续性感染模型中抗嗜肝DNA病毒的作用。方法应用中药复方ZL 1治疗实验感染鸭 ,口服给药 ,剂量 5 0 0mg·kg-1·d-1,分 2次服用 ,连续 4周。采用斑点分子杂交和Southern印迹杂交检测治疗后感染鸭血清和肝脏中病毒的动态变化。同时以拉米夫定及安慰剂作为对照组。结果　复方药物ZL 1治疗后血清中DHBVDNA均数从 3 .6× 10 10 拷贝 /ml下降至 0 .9× 10 10 拷贝 /ml(P <0 .0 1) ,抑制病毒率为 75 % ,但尚不能清除病毒血症 ,肝组织中总DHBVDNA和DHBV超螺旋型DNA量无明显减少 ,停药观察 2周 ,病毒复制反弹不明显。拉米夫定治疗后可显著降低病毒血症 (P <0 .0 1) ,抑制病毒率达 99% ,同时肝组织中总DHBVDNA和DHBV超螺旋型DNA量减少 ,但停药观察 2周 ,病毒复制反弹明显。安慰剂组 (口服生理盐水 )治疗前后病毒水平的差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　复方药物ZL 1治疗4周可使感染鸭病毒血症降低 ,但不能清除病毒血症 ,肝脏中病毒复制水平也无显著下降     

乙型肝炎病毒在宿主内不受核苷类药物影响的机理探讨

目的 探讨乙型肝炎病毒在宿主中不受药物影响而得以长期与宿主共存的机理。方法 以核苷类药物拉米夫定（3TC）和无环鸟苷（ACV）对鸭乙肝病毒（DHBV）感染一日龄广州麻鸭模型进行治疗，以斑点杂交法检测治疗前后和停药后鸭血清中鸭乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（DHBV－DNA）的变化，并取提鸭的肝，肾，脾，肺，心组织中的DNA，用聚合酶链反应（PCR）方法检测DHBV－DNA在各脏器组织中存在的情况。结果 以斑点杂交法检测鸭血清DHBV－DNA，3TC和ACV两个治疗组在治疗后5－10d内血清DHBV－DNA含量持续下降（与模型组比较均P＜0．05），但停药后有回升倾向；用PCR方法检测各组的肝，肾，脾，肺，心组织，显示治疗后DHBV－DNA在各脏器组织中存在的情况与模型组比无显著性差异（P＞0．05）。进一步比较了斑点杂交法和PCR法检测的结果，显示斑点杂交法检测组织中病毒远不如PCR法敏感，并提示可能组织中病毒复制量很低，以致用斑点杂交法检测出现很多假阴性。结论 乙型肝炎病毒感染宿主后，药物治疗只对宿主血清DHBV－DNA含量有影响，但未发现对肝和肝外脏器组织中DHBV－DNA有影响，乙肝病毒不受药物影响而长期在宿主中存在并低水平持续复制，可导致宿主机体对其无法识别和清除而形成慢性感染。建议使用较敏感的PCR法监控组织中DHBV－DNA含量，作为评价药物长期疗效的指标之一。     

鸭乙型肝炎病毒感染特异细胞介导免疫检测方法的建立

目的：建立简便、特异的鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染特异细胞介导免疫（CMI）检测方法。方法：分别从DHBV强阳性的血清和肝组织中纯化DHBsAg、DHBcAg,Bradford法定量后，用于急性DHBV感染重庆麻鸭CMI的检测。结果：急性感染后10d鸭外周血单个核细胞（PBMC）快速出现对DHBsAg、DHBcAg的不同程度增殖反应，5周内下降至正常水平。7份刺激细胞上清DuIFN-γ检测结果为阳性，OD540nm读数介于0．062－0．108之间，细胞因子的表达水平与PBMC增殖反应强度呈现较好的相关性。结论：DHBV感染重庆麻鸭CMI检测方法的建立，为了解感染鸭特异免疫应答状态提供了重要参考。     

茅莓提取物体内抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的：观察茅莓提取物（乙酸乙酯部位）体内抗乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）的作用。方法：采用聚合酶链反应（polymerasechain—reaction,PCR）法筛选3日龄鸭乙型肝炎病毒（duck hepatitisBvirus,DHBV）阳性麻鸭50只,将麻鸭随机分为盐水对照组、茅莓提取物高、中、低剂量组和拉米夫定组,于用药前、用药第7、14、21天及停药后第3、7天,取各组麻鸭静脉血,作鸭血清DNA斑点杂交,计算鸭血清DHBV—DNA密度,最后一次取血后取肝脏组织进行病理组织学观察。结果：体内实验显示,盐水对照组动物血清DHBV—DNA水平与用药前比较未见变化（P〉0．05）,拉米夫定组血清DHBV—DNA于用药第14天和第21天与用药前比较明显减低（P〈0．01）,与盐水对照组用药第7天、第14天和第21天血清DHBV-DNA比较明显降低（P〈0．05和0．01）。与盐水对照组比较,茅莓提取物各剂量组21d疗程各时点血清DHBV—DNA未见变化（P〉0．05）。肝脏病理检查示各组差异无显著性。结论：茅莓提取物抗HBV作用主要是通过其原形发挥作用,该原形在麻鸭体内经过代谢后,失去抗HBV的作用。     

α-2b干扰素对乙型肝炎模型鸭肝组织炎症和肝纤维化的治疗作用

目的：通过鸭乙型肝炎病毒（DHBV）阳性血清注射建立鸭乙型肝炎模型,探讨α-2b干扰素治疗DHBV所致鸭肝炎症及肝纤维化的作用,为干扰素的临床应用提供依据。方法：10日龄北京麻鸭40只随机分为对照组（6只）和感染组（34只）,感染组使用DHBV阳性血清1周内3次注射的方法,制备鸭乙型肝炎模型。2周后,采用斑点杂交法检测DHBV-DNA水平确认感染鸭共32只,随机将感染动物分为模型对照组（10只）、低剂量及高剂量α-2b干扰素组（各11只）,α-2b干扰素组鸭分别肌肉注射低剂量（1×10⁵ U·100 g^-1）和高剂量（5×10⁵ U·100 g^-1）α-2b干扰素治疗。30 d治疗结束后,采用斑点杂交法检测各组鸭血清DHBV-DNA水平,检测天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷氨酸氨基转移酶（ALT）和肝纤维化指标层黏蛋白（LN）及Ⅲ型前胶原肽（PCⅢ）水平,取肝组织检测白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素12（IL-12）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平,观察组织病理形态表现。结果：与造模前比较,造模后鸭血清DHBV-DNA水平明显升高,表明造模成功。α-2b干扰素治疗结束后,与模型组比较,低和高剂量α-2b干扰素组鸭血清DHBV-DNA水平明显下降（P<0.05）,血清中AST和ALT水平降低（P<0.05）,其中高剂量α-2b干扰素组LN及PCⅢ型水平明显降低（P<0.05）,肝组织中IL-6和TNF-α水平明显降低（P<0.05）,IL-12水平无明显变化（P>0.05）。组织病理形态表现,与模型组比较,低和高剂量α-2b干扰素组鸭肝组织中纤维化明显减轻。结论：α-2b干扰素可以减轻DHBV所致的鸭肝组织炎症和肝纤维化,本研究为干扰素的进一步开发和临床应用提供了理论依据。     

广东省绿头鸭场鸭乙肝病毒自然携带状况调查

目的　调查两个鸭场携带乙肝病毒(DHBV)状况。方法　在对广东省家养绿头鸭分布状况进行系统调查的基础上,对南海市和顺镇、里水镇两个绿头鸭场作了随机抽样调查,采集了雏鸭、青年鸭和种鸭的血标本共519份,应用斑点分子杂交(DotBlot)测定法观察绿头鸭乙型肝炎病毒(DHBV)自然携带率。结果　两鸭场绿头鸭的DHBV自然携带率为36.0%(187/519),其95%可信限为31.0%～44.0%。不同鸭龄组绿头鸭DHBV自然携带比较,两鸭场同日龄绿头鸭DHBV自然携带率比较,绿头鸭DHBV自然携带率的性别比较,差异均无显著意义。不同鸭龄的绿头鸭DHBV-DNA含量定量分析(A值),差异有非常显著性(P＜0.01),其含量由高到低顺序为雏鸭＞种鸭＞青年鸭,和顺鸭场的绿头鸭DHBV-DNA含量高于里水鸭场。结论　两鸭场绿头鸭携带的DHBV可能源于不同的亚株。     

经垂直传播自然感染DHBV幼鸭的肝组织病理学研究

本文选择血清DHBV阳性的雄鸭、雌鸭交配产卵,人工孵育的幼鸭经1年单独人工饲养后进行血清检测和肝活体组织检查。结果亲代双方均为带毒者经垂直传播子代的自然感染率高达45.5％。在10只血清DHBV阳性幼鸭中,全部肝组织均见点灶状坏死,而12只DHBV阴性幼鸭中仅3只肝组织可见坏死灶,两组相比差异有显著性。表明鸭肝组织病变与DHBV感染有十分密切的关系。     

外周血中鸭肝炎病毒动态与肝病理变化关系的研究

从山东地区产的成年鸭中分离出鸭乙肝病毒,人工感染当地1日龄雏麻鸭。用斑点酶法、斑点杂交法及用电子显微镜观察外周血中被感染鸭乙肝病毒不同时期的动态,并对不同感染阶段的肝组织病理变化进行了分析。结果表明,感染3周时鸭体内病毒复制较为活跃,此时肝组织病理损害也较严重。本实验为研究人类乙肝病毒的早期感染尤其是母婴传播过程外周血中乙肝病毒的动态与肝组织病理变化的关系提供了动物模型,为防治乙肝病毒早期感染提供了实验基础。     

Experimental study on pathogenicity of precore mutants in Hepadnaviridae

OBJECTIVE: To study the replicative competency and pathogenicity of precore gene mutants of duck hepatitis B virus (DHBV) in the duck model. METHODS: Three site-directed point mutations in the precore region of cloned DHBV were constructed. Head-to-tail dimers were formed. The three plasmids were named: pEDM1-2 (initiation codon ATG mutated to TTG), pEDM2-2 (an "A" was inserted down stream of codon 12, leading to frame shift in the distal end of precore region), pEDM3-2 (codon 38 was changed from TAT to TAA, leading to a stop codon at the 3'-end). Mutants and wild-type cloned DNA dimers were first separately used to transfect LMH cells (a chicken hepatoma cell line) and viruses were collected from supernatant and used to infect 6 one-day-old ducklings per group. Serum duck hepatitis B surface antigen (DHBsAg) and DHBV DNA were assayed. Six weeks after infection, ducks were killed and liver tissues were studied for histopathological changes. RESULTS: After transfection, pEDM1-2, pEDM2-2 and pEDM3-2 expressed similar level of DHBsAg. Replication of pEDM1-2 and pEDM3-2 was similar to that of the wild type clone, while pEDM2-2 replicated at a significantly decreased level. Infection study employing the supernatant of transfected cells was as follows: pEDM1-2 infected 5/6 ducklings, pEDM2-2 non infected, pEDM3-2 infected 2/6 ducklings, wild type virus infected 6/6 ducklings. Positive serum samples from both pEDM1-2 and pEDM3-2 were at a lower serum DHBV level compared to that of the wild type virus. Pathological changes were more significant in pEDM3-2 infected duck livers, with numerous inflammatory cells in portal tract and infiltration into parenchyma. CONCLUSIONS: Mutations in the initiating codon or generation of a stop codon at the 3'-end of the precore region resulted in decreased replication competency of DHBV, while frame-shift mutation of the precore region, covering the epsilon encapsidation signal abolished the replication of DHBV. When the mutants replicated in hosts, more severe pathological changes were observed in ducks infected with mutant harboring a stop codon at the 3'-end. Data suggest that replicative-competent DHBV precore mutant can be more pathogenic than wild-type DHBV.     

不同种雏鸭建立鸭乙肝病毒感染模型及抗病毒效果的实验研究

目的：探讨不同种雏鸭建立鸭乙肝病毒感染模型的影响因素,观察应用该模型抗病毒的效果。方法：采集鸭血清,应用PCR方法定性检测鸭血清中病毒DNA;定量PCR方法检测鸭血清中病毒DNA载量变化;用抗病毒药物处理,观察其在鸭DHBV感染模型中的抗病毒效果。结果：不同种鸭DHBV自然感染率不同,樱桃谷鸭为8.75%,湖北麻鸭两个批次分别为17.80%和10.68%;静脉注射和腹腔注射两途径均能致雏鸭感染DHBV,静脉注射感染率80%,腹腔注射感染率65%;鸭感染DHBV后,体内病毒载量维持在106~108拷贝/mL,可持续20天以上;抗病毒药物处理后,在不同DHBV模型中其抗病毒效果变化趋势一致。结论：鸭的种类和人工感染途径可影响DHBV感染率;雏鸭感染DHBV后其体内有持续性的病毒血症;DHBV感染模型是药物抗病毒研究较好模型。     

THE ROLE OF RECOMBINANT HUMAN FUSION PROTEIN IL－6／IL－2（CH925） IN HEPADNA VIRUS INFECTION TREATMENT

ＴＨＥＲＯＬＥＯＦＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴＨＵＭＡＮＦＵＳＩＯＮＰＲＯＴＥＩＮＩＬ－６／ＩＬ－２（ＣＨ９２５）ＩＮＨＥＰＡＤＮＡＶＩＲＵＳＩＮＦＥＣＴＩＯＮＴＲＥＡＴＭＥＮＴＭｉＺｈｉｂａｏ（米志宝），ＺｈａｏＣｈｕｎｈｕａ（赵春华），ＺｈａｎｇＸｉｔ...     

Duck hepatitis B virus infection and duck hepatocellular carcinoma.

To study the relationship between duck hepatitis B virus (DHBV) infection and duck hepatocellular carcinoma (DHCC), histological examination and DHBV DNA hybridization were performed in 875 ducks from three flocks in Qidong County. Among them, 34 suffered from hepatoma, including 23 hepatocellular carcinoma, 8 cholangiocarcinoma and 3 hepatocellular-cholangiocarcinoma. Of the 34 ducks with hepatoma 27 were positive for DHBV DNA in the liver and/or serum. DHBV DNA was demonstrated in neoplastic nodules of 22 ducks. Southern blot analysis showed that 13 cases were of the integrated pattern of DHBV DNA in neoplastic nodules. The paratumor tissues of 14 ducks with massive tumor were analysed at the same time. Five cases showed integrated pattern, 4 cases free pattern and the other 4 cases both integration and free pattern of DHBV DNA. The hybridization pattern of DHBV DNA in tumor nodule was different from that in paratumor regions in 11 cases and identical in 3 cases. DHBV antigen was positive in 13 tumor nodules and 21 paratumor tissues in the 34 ducks with hepatic tumor by both victoria blue and orcein stain methods. Advanced liver diseases were found in 30 out of the 34 ducks with hepatoma, including 12 cirrhosis and 18 chronic active hepatitis. In southern blot analysis of 122 DHBV DNA positive Qidong ducks without hepatoma, only free pattern of DHBV was seen, while 44 control ducks from Changchun were negative for DHBV DNA. Neither hepatic tumor nor liver diseases were seen in the control ducks. The results suggest that hepatocellular carcinoma in ducks is similar to that in human HCC. They have a high frequency of viral DNA integrated into the host genome and a liver disease background.

     

Elimination of immune tolerance to hepatitis virus in an animal model.

Four-day old ducklings were infected with duck hepatitis B virus to simulate perinatal transmission of hepatitis B virus. Immune tolerance was characterized as persistent viremia, antigenemia, without detection of anti-DHBs or anti-DHBc. A synthetic peptide, P125-146, mimicking one of the epitopes of the native DHBV Pre-S protein was used to cross-link to tetanus toxoid or phytohemagglutinin. These 'novel' antigens were used to immunize immune tolerant ducks, aimed at bypassing T cell tolerance. After 5 injections, though no anti-DHBV Pre-S was detected, around 50% of the immunized ducks showed seroconversion to DHBV DNA negative.

     

鸭肝损伤模型血清中鸭乙肝病毒cccDNA的动态检测

目的 探讨在不同程度肝损伤的DHBV感染麻鸭外周血中能否检测出DHBVcccDNA.方法 选择持续感染DHBV的2月龄上海麻鸭24只随机分均分为4组,分别以(1)A组:D-氨基半乳糖(D-GalN)2.2 g/kg+脂多糖(LPS)100 μg/kg;(2)B组:D-GalN+LPS+10 ml/kg的CCl4灌胃2次;(3)C组:D-GalN+LPS+15 ml/kg的CCl4灌胃2次;(4)NC组:生理盐水处理作为正常对照组(NC组).在处理后0、24、36和48 h进行血清ALT、DHBV载量和DHBV cccDNA检测,最后处死动物取肝组织评价肝损伤程度,并检测肝组织中的总DHBV DNA和DHBV cccDNA.结果 NC组鸭肝脏无明显病理改变,A组、B组和C组鸭则分别出现点状坏死至大片肝坏死的肝损伤,3组之间的肝损伤程度分级差异有统计学意义(P＜0.01).B组和C组在处理后48 h分别有1只和4只鸭死亡.NC组和A组各检测时点血清中均未检测到DHBV cccDNA;B组和C组在处理后36 h分别有2只和3只鸭血清中检测到DHBV cccDNA,含量在(0.32～1.72)×104拷贝/ml之间,在处理后48 h两组各有1只鸭血清中仍可以检测出DHBV cccDNA.Logistic逐步回归分析显示血清中DHBVcccDNA的检出率与肝损伤程度评分有关(P=0.0029),而与血清DHBV载量、ALT水平以及肝组织中的总HBV DNA和DHBV cccDNA 含量无关.结论 在肝组织发生严重损伤时,血清中可以出现DHBV cccDNA,血清中DHBV cccDNA的检出与肝组织损伤程度显著相关.     

清肝排毒饮抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究

目的观察清肝排毒饮抗鸭乙型肝炎（DHBV）作用。方法用Dot—BLOT法筛选出DHBsAg强阳性1d龄华南麻鸭。随机分为5组，分别为模型组、拉米夫定（ACV）组和清肝排毒饮大、中、小剂量组。除模型组外，其他各组均灌胃口服治疗10d，于用药前（T0）、用药第5d（T5）、第10d（T10）厦停药后第3d（P3）分别采血，采用斑点杂交方法检测用药前后鸭血清乙肝病毒脱氧核糖核酸（DHBV DNA）的动态变化。结果清肝排毒饮中剂量治疗组第5、10d鸭血清DHBV DNA OD值明显低于培药前，差异有显著性（P〈0．05），但与拉米夫定组比较，差异无显著性意义（P〉0．05）。停药3d后无反跳。结论清肝排毒饮有一定的抑制DHBV DNA复制作用。     

鸭乙型肝炎病毒在天然宿主中的特异性体液及细胞免疫应答

用灭活的鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）免疫健康成年鸭，观察鸭外周血淋巴细胞的增殖，同时用间接ＥＬＩＳＡ法检测免疫鸭血清中抗ＤＨＢｓ／ｐｒｅｓ和抗ＤＨＢｃ。结果发现，在２次免疫后，４只鸭均产生低滴度的抗ＤＨＢｓ／ｐｒｅｓ，抗ＤＨＢｃ仅在１只鸭中一过性地出现，４只鸭中３只于第三次免疫后出现对ＤＨＢｓ／ｐｒｅｓＡｇ的淋巴细胞增殖反应，２只出现对ＤＨＢｃＡｇ的增殖反应。表明鸭对ＤＨＢｓ／ｐｒｅｓＡｇ的免疫应答性校对ＤＨＢｃＡｇ强，动态观察细胞和体液免疫出现的时相，多数鸭先测及抗体，用抗ＤＨＢｓ／ｐｒｅｓ被动免疫幼鸭可部分阻断ＤＨＢＶ的实验感染。