逆转录PCR检测丙型肝炎病毒RNA

逆转录ＰＣＲ检测丙型肝炎病毒ＲＮＡ王捷，杨太成，江悦华，王晓怀（广州军区总医院医学实验科，５１００１０）丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）是单股正链ＲＮＡ病毒，流行病学研究表明，大约９０％的输血后肝炎均由ＨＣＶ引起，原发性肝癌的发生也与ＨＣＶ感染相关［１］。目前...     

逆转录PCR检测急性白血病患者血清中丙型肝炎病毒的研究

应用逆转录多聚酶链反应和酶联免疫吸附试验方法检测１８例经多次输血并有肝功能改变的急性白血病患者血清中丙型肝炎毒基因和抗丙型肝炎病毒抗体。ＨＣＶ ＲＮＡ阳性率７７．８；抗－ＨＣＶ阳性６６．１％；单项或两项阳性者１６例，联合判定ＨＣＶ感染率８８．９％。ＲＴ ＰＣＲ检出ＨＣＶ ＲＮＡ时间早于抗－ＨＣＶ阳转时间，而且敏感性高于后者，是一种早期，灵敏及特异的ＨＣＶ感染诊断方法。     

逆转录PCR检测丙型肝炎病毒RNA

丙型肝炎病毒(HCV)是单股正链RNA病毒，流行病学研究表明大约90％的输血后肝炎均由HCV引起，原发性肝癌的发生也与HCV感染相关。目前HCV的实验室诊断主要依靠抗HCVIgG检测，但急性期抗体检出率仅能达到60％，部分病例可呈阴性反应。由于HCV在血液及肝组织中的感染滴度很低，因此采用一般的核酸分子杂交技术难于检出HCVRNA。目前开展HCV基因扩增方法直接检测HCVRNA，以期达到早期．灵敏．特异性诊断目的。     

逆转灵—套式聚合酶链反应检测丙型肝炎病毒RNA

采用逆转录－套式聚合酶链反应检测２８０例疑为ＨＣＶ感染的病人血清，并同时做抗－ＨＣＶ－ＩｇＧ检测。结果５１例ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性，其中２６例抗ＨＣＶ－ＩｇＧ阳性；在２５４例抗ＨＣＶ－ＩｇＧ阴性血清中有２５例ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性。     

丙型肝炎病毒RNA非结构区套式聚合酶链反应

目的探讨不同引物对ＨＣＶＲＮＡ检出率的影响，建立敏感的ＮＳ５区基因扩增技术。方法选择不同引物，采用非结构５（ＮＳ５）区套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）及联合式「ＨＣＶ非编码区（５ＮＣＲ）与ＮＳ５联合」技术检测１０例抗ＨＣＶ阳性献赠及３７例输血后丙型肝炎患 血清ＨＣＸＶＲＮＡ。结果 １０例抗ＨＣＶ阳性一献血员应用联合式ＰＣＲ，以ＮＳ５－３＋ＮＳ５－４、ＳＦ２＋ＮＳ５－４、Ｋ１＋ＮＳ５－４、ＮＳ５－１＋ＮＳ     

逆转录-半套式-聚合酶链反应单管法检测血清中HCV RNA

目的探讨建立一种更简便,更特异灵敏的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)单管法.方法采用蜡隔将RT和PCR扩增2个独立的反应体系在1个Eppendoff(Ep)管中分隔开来,设计内外引物,优化反应体系及条件,使整个检测反应经高温启动继而连续封闭地完成.结果在60例血透析患者血清中,33例(55%)抗-HCV-IgG阳性和27例抗-HCV-IgG阴性血清用单管RT-PCR分别检出28例(85%)和3例(9%)HCV RNA阳性,并对3份阳性PCR产物作核酸序列测定.本方法的检测灵敏度为102拷贝/ml.结论 RT-PCR单管法在保持高灵敏度的前提下,提高了特异性,具有简单高效,杜绝外源性污染等优点.     

丙型肝炎病毒RNA非结构区套式聚合酶链反应

目的探讨不同引物对ＨＣＶＲＮＡ检出率的影响，立敏感的ＮＳ５区基因扩增技术。方法选择不同引物，采用非结构５（ＮＳ５）区套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）及联合式［ＨＣ非编码区（５′ＮＣＲ）与ＮＳ５联合］ＰＣＲ技术检测１０例抗ＨＣＶ阳性献血员及３７例输血后丙型肝患者的血清ＨＣＶＲＮＡ。结果１０例抗ＨＣＶ阳性献血员应用联合式ＰＣＲ，以ＮＳ５－３＋ＮＳ５－４、ＳＦ２＋ＮＳ５－４、Ｋ１＋ＮＳ５－４、ＮＳ５－１＋ＮＳ５－４引物及套式ＮＳ５－１＋ＮＳ５－４引物扩增时，其ＲＮＡ检出率分别为５／１０、６／１０、７／１０、８／１０和９／１０；而３７例输血后丙型肝炎患者中３５例ＲＮＡ阳性，检出率为９５％，其中１８例１ｂ型和１９例２ａ型样品的检出率分别为１００％和８９％。结论ＨＣＶＮＳ５区的ＲＮＡ检出率与引物的选择有关     

逆转录－套式PCR检测血清中丙肝病毒RNA

利用与丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因组５＇非编码区保守序列同源的套式引物，建立了检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，由于在引物设计中选择了最保守的区域且避开了与黄病毒属的同源序列，保证了ＰＣＲ检测的灵敏度和特异性。经逆转录和两轮ＰＣＲ扩增，可检出１×１０－３ｕｌ血清中的ＨＣＶＲＮＡ。研究了影响ＨＣＶＲＮＡＰＣＲ检测的各种因素，并对ＲＮＡ分离及ＲＴ－ＰＣＲ反应体系进行了优化，在此基础上研制了ＨＣＶ的ＰＣＲ检测试剂盒。     

酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物

建立一灵敏，快速的检测丙型肝炎病毒逆转录－套式聚合酶链反应产物的酶免疫法。方法，对第２次ＰＣＲ所用的引物进行双标记，使扩增产物同时被修饰有生物一不和荧光素成分，再经过固相的链亲合素进行捕获，辣根过氧化酶记的抗－ｆｌｕｏｒｅｓ－ｃｅｉｎ反应后显色测定     

逆转录—半套式—聚合酶链反应单管法检测血清中HCV RNA

目的 探讨建立一种更简便，更特异灵敏的逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）单管法。方法 采用蜡隔将RT和PCR扩增2个独立的反应体系在1个Eppendoff(Ep)管中分隔开来，设计内外引物，优化反应体系及条件，使整个检测反应经高温启动继而连续封闭地完成。结果 在60例血透析患者血清中，33例（55％）抗－HCV－IgG阳性和27例抗－HCV－IgG阴性血清用单管RT－PCR分别检出28例（85％）和3例（9％）HCV RNA阳性，并对3份阳性PCR产物作核酸序列测定。本方法的检测灵敏度为10^2拷贝／ml。结论 RT－PCR单管法在保持高灵敏度的前提下，提高了特异性，具有简单高效，杜绝外源性污染等优点。     

TthDNA聚合酶在丙型肝炎病毒RNA检测中的应用

用ＴｔｈＤＮＡ聚合酶行逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增丙型肝炎病毒（ＨＶＣ）５′端非编码序列，对２６２例肝炎患者血清进行ＨＣＶＲＮＡ测定，结果ＨＣＶＲＮＡ阳性者５３例，阳性率２０．２％，凡阳性者用酶联免疫吸附法测其抗ＨＣＶＩｇＧ，其中３０例测到抗ＨＣＶ，阳性重叠率５６％（３０／５３）；ＨＣＶ ＲＮＡ阳性中的１５例同时用成髓细胞瘤病毒酶行传统逆转录－套式聚合酶链反应检测对照，１４例阳性，符合率     

逆转录聚合酶链反应检测血清中丙型肝炎病毒RNA

本文用本所自己合成的引物，对３０份怀疑ＨＣＶ感染血清进行ＨＣＶＲＮＡＲＴ－ＰＣＲ检测。该３０份血清中，２２份抗－ＨＣＶ阳性，其中１８份ＨＣＶＲＮＡ为阳性，８份抗－ＨＣＶ阴性血清及怀疑阳性血清中，２份ＨＶＣＲＮＡ为阳性。结果提示，抗－ＨＣＶ抗体试剂盒用于检测急性ＨＣＶ感染有其不足之处，结合ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ的方法可提高急性ＨＣＶ感染的检出率。     

逆转录套式ＰＣＲ检测丙型肝炎病毒感染者ＨＣＶ ＲＮＡ

目的　探讨人血清和外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ与血清ＩｇＧ和ＩｇＭ抗体联合检测对丙型肝炎的诊断价值。方法对以ＥＬＩＳＡ方法检测所得的４６例ＨＣＶ—ＩｇＧ阳性的标本用逆转录套式聚合酶锭反应（ＲＴ—ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ）检测血清和ＰＢＭＣ中ＨＣＶＲＮＡ，同时用ＥＬＩＳＡ方法检测血清中ＨＣＶ—ＩｇＭ。结果血清中有１７例ＨＣＶ　ＲＮＡ阳性和６例ＨＣＶ—ＩｇＭ阳性，而ＰＢＭＣ中有１９例ＨＣＶＲＮＡ阳性。结论血清中ＨＣＶ—ＩｇＭ可作为丙型肝炎的初筛诊断，ＨＣＶ—ＩｇＭ可作为ＨＣＶ近期感染的指标，但二者均不能准确反映病毒在体内的存在情况，而套式ＰＣＲ方法检测ＨＣＶＲＮＡ可直接反映ＨＣＶ在体内的活动情况，其中ＰＢＭＣ中检测ＨＣＶＲＮＡ的阳性率高于血清，提示ＨＣＶ可能在ＰＢＭＣ中潜伏乃至复制。     

血清HCV RNA检测在慢性丙型肝炎诊断中的意义

目的探讨血清HCVRNA检测在慢性丙型肝炎临床诊断中的意义。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光定量PCR（FQ-PCR）检测146例慢性丙型肝炎患者抗-HCV和HCVRNA。结果抗-HCV及HCV RNA检出率分别为73．9％（108／146）和52．1％（76／146）；抗-HCV（＋）组和抗-HCV（-）组HCVRNA的检出率分别为75．9％（82／108）和10．5％（4／38）。结论血清HCVRNA荧光定量是临床诊断丙型肝炎的直接证据，且可以弥补抗-HCV对丙型肝炎的漏诊等不足。     

标本因素对实时荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒RNA的影响

目的：探讨血红蛋白、脂质和胆红素对实时荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒（HCV）RNA的影响。方法：根据不同要求收集特定的临床标本,采用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）测定标本中HCV RNA的含量。结果：溶血组、高血脂组和高胆红素组的检测结果与对照组比较均差异无显著性（P〉0.05）。结论：使用核酸提取柱法处理标本,可避免样本中血红蛋白、脂质和胆红素等干扰物质对实验结果的影响。     

聚合酶链反应检测献血者血清中的丙型肝炎病毒

聚合酶链反应检测献血者血清中的丙型肝炎病毒３６２０００福建省泉州市中心血站陈惠民泉州市皮肤病性病防治院吴丽惠目前主要用ＥＬＩＳＡ法检测献血者的抗－ＨＣＶ，作为其是否感染上丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的指标，但这不能完全反映献血者的ＨＣＶ感染情况。笔者选用Ｈ...     

酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物

目的建立一灵敏、快速的检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ逆转录－套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物的酶免疫法。方法对第２次ＰＣＲ所用的引物进行双标记，使扩增产物同时被修饰有生物素和荧光素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）成分，再经过固相的链亲合素进行捕获、辣根过氧化物酶标记的抗－ｆｌｕｏｒｅｓ－ｃｅｉｎ反应后显色测定。结果所建立的方法与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳法相比灵敏、快速、准确，结果判断客观，重复性也较好；所测结果可反映ＰＣＲ产物量的多少，但不能准确表示模板量的大小。结论建立的方法可取代电泳法而成为ＨＣＶＲＮＡ常规ＰＣＲ反应产物的检测技术。     

应用PCR检测丙型肝炎病毒PNA的影响因素

丙型肝炎病毒ＲＮＡ的血中浓度非常低，大约为每毫升血液中１０＾３个拷贝数。ＲＮＡ酶的降解作用在血液标本中ＨＣＶ ＲＮＡ往往迅速被破坏。此外，ＨＣＶ基因序列高度变异的特性直接影响逆转录多聚酶锭反应ＨＣＶ ＲＮＡ的阳性检出率。     

TthDNA聚合酶在丙型肝炎病毒RNA检测中的应用

用ＴｔｈＤＮＡ聚合酶行逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增丙型肝炎病毒（ＨＶＣ）５’端非编码序列，对２６２例肝炎患者血清进行ＨＣＶＲＮＡ测定，结果ＨＣＶＲＮＡ阳性者５３例，阳性率２０．２％。凡阳性者用酶联免疫吸附法测其抗ＨＣＶＩｇＧ，其中３０例测到抗ＨＣＶ，阳性重叠率５６％（３０／５３）；ＨＣＶＲＮＡ阳性中的１５例同时用成髓细胞瘤病毒酶行传统逆转录。套式聚合酶链反应检测对照，１４例阳性，符合率达９３．３％（１４／１５）。ＴｔｈＤＮＡ聚合酶用于ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ５’端非编码序列片段具有敏感性高、特异性强、稳定性好的优点。