幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜组织细胞因子变化的实验研究

目的：研究幽门螺旋杆菌（简称幽门螺杆菌）感染小鼠胃黏膜组织细胞因子变化,初步探讨幽门螺杆菌感染的免疫机制。方法选取8～10周龄BALB／c小鼠24只,雌雄各半,分为观察组和对照组,两组造模前均禁食12h,观察组以2×109CFU／mL浓度的幽门螺杆菌菌液0．5mL／d灌胃,连续7d。对照组灌胃给生理盐水,0．5mL／d,连续7d,进行幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜造模。采用实时定量荧光PCR（Real‐timePCR）检测检测感染2、4周后,小鼠血浆中γ干扰素（IFN‐γ）、重组改构人肿瘤坏死因子α（TNF‐α）、白细胞介素‐8（IL‐8）以及IL‐10mRNA的表达量,并于感染4周后,处死小鼠,无菌取各组小鼠的胃组织,采用酶联免疫吸附试验夹心法检测胃黏膜组织中IFN‐γ、TNF‐α、IL‐8及IL‐10蛋白的水平。结果两组小鼠感染2周后,观察组IL‐8高于对照组,差异有统计学意义（P＜0．05）。感染4周后,IFN‐γ、TNF‐α、IL‐8的mRNA及蛋白表达量均明显上升,但观察组上升幅度明显高于对照组,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论TH2细胞在幽门螺杆菌感染中的作用表现不明显,能促进TH1型细胞细胞因子的表达,引发TH1为主的免疫反应。     

大蒜素对贝赫切特病的治疗作用及机制探讨

目的：探讨大蒜素对实验性贝赫切特病（BD）的治疗作用及机制。方法构建BD模型鼠,将其分为实验组、阳性对照组和阴性对照组,分别鼻饲注入大蒜素、秋水仙碱和生理盐水。肉眼观察治疗前后皮损的变化,ELISA法检测治疗前后血清γ干扰素（IFN‐γ）、肿瘤坏死因子α（TNF‐α）、IL‐4和化学比色法检测总抗氧化力（T‐AOC）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷甘肽过氧化物酶（GSH‐PX）。结果模型小鼠背、腹、阴部出现溃疡,IFN‐γ、TNF‐α、IL‐4和MDA升高,T‐AOC、SOD和GSH‐PX下降。治疗20d后实验组和阳性对照组小鼠溃疡基本愈合;30d后实验组仅2只复发,阳性对照组有6只复发,差异有统计学意义（P＜0．05）。治疗后实验组IFN‐γ、TNF‐α和IL‐4较治疗前降低（P＜0．01）,与阳性对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05）;实验组T‐AOC、SOD和GSH‐PX较治疗前升高,MDA下降（P＜0．01）,与阳性对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05）。结论大蒜素是治疗实验性BD的有效药物,可能是通过抑制炎症因子、阻止氧化应激而作用。     

右美托咪定对脂多糖诱导大鼠外周血中性粒细胞TREM-1mRNA表达的影响

目的：探讨右美托咪定对脂多糖（LPS）诱导大鼠外周血中性粒细胞髓样细胞触发受体‐1（TREM‐1）mRNA表达的影响。方法健康雄性Wistar大鼠40只,取外周血分离培养中性粒细胞,采用随机数字表法,将其随机分为4组（n＝10）,A组：阴性对照;B组：中性粒细胞中加入L PS （终浓度为100μg／L ）;C组：中性粒细胞中加入L PS （终浓度为100μg／L ）加右美托咪定（终浓度为0．5 ng／mL）;D组：中性粒细胞中加入LPS（终浓度为100μg／L）加右美托咪定（终浓度为1．0 ng／mL）。孵育24 h后,收集上清液,采用ELISA法测定TNF‐α、IL‐1β和IL‐6的浓度,采用RT‐PCR法测定TREM‐1 mRNA的表达。结果与A组比较,B组TREM‐1 mRNA表达上调,TNF‐α、IL‐1β和IL‐6的浓度升高,差异有统计学意义（P＜0．05）;与B组比较,C组和D组TREM‐1 mRNA表达下调,TNF‐α、IL‐1β和IL‐6的浓度降低,差异有统计学意义（P＜0．05）;与C组比较,D组 TREM‐1 mRNA表达水平、TNF‐α、IL‐1β和IL‐6的浓度比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论右美托咪定可通过下调 TREM‐1 mRNA表达,抑制L PS诱导大鼠外周血中性粒细胞T N F‐α、IL‐1β和IL‐6的生成及分泌。     

白藜芦醇对β淀粉肽1～42刺激内皮细胞炎症因子表达的影响

目的：探索白藜芦醇对β淀粉样蛋白1～42（Aβ1～42）刺激内皮细胞炎症因子IL‐1、IL‐6与TNF‐α表达影响。方法5×101μmol／LAβ1～42刺激人脐静脉内皮细胞（HUVEC）24h,同时给予白藜芦醇160、80、40、20μg／L干预,CCK‐8法检测HU‐VEC细胞活性;ELISA法检测IL‐1、IL‐6和TNF‐α水平。结果与模型组比较,白藜芦醇各浓度组可以明显提高Aβ1～42刺激后HUVEC细胞活性,抑制Aβ1～42致HUVEC的IL‐1、IL‐6与TNF‐α表达,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论20μg／L以上浓度白藜芦醇可减少Aβ1～42致HUVEC炎症因子IL‐1、IL‐6与TNF‐α的表达。     

SpA 刺激单核巨噬细胞表达早期致炎因子的实验研究

目的：探讨金黄色葡萄球菌蛋白A（SpA）对单核巨噬细胞表达早期致炎因子 TNF‐α、IL‐1和IL‐6的影响。方法用一定浓度SpA与THP‐1细胞培养不同时间,用MTT法测定SpA对THP‐1细胞增殖的影响;用ELISA测定培养液中TNF‐α、IL‐1和IL‐6的水平;用RT‐PCR检测细胞TNF‐α、IL‐1和IL‐6相应mRNA的表达,并对结果进行统计学分析。结果 SpA对THP‐1细胞增殖的影响与其作用剂量有关。SpA可促进巨噬细胞分泌 TNF‐α、IL‐1和IL‐6及表达相应mRNA ,且呈一定剂量‐效应和时间‐效应关系。SpA刺激巨噬细胞分泌TNF‐α、IL‐1、IL‐6和表达相应mRNA均在12 h达高峰。SpA刺激组TNF‐α、IL‐1和IL‐6的表达和释放均显著升高（P＜0．01）。结论 SpA可明显促进单核巨噬细胞表达和分泌早期致炎细胞因子 TNF‐α、IL‐1和IL‐6。SpA在启动金葡菌性脓毒症及促进其发展中,具有不可忽视的作用。     

减毒沙门菌介导联合基因对腺样囊性癌血管生成的抑制作用

目的:观察构建含有Tip30与人IFN-γ基因的真核表达及共表达质粒的重组减毒沙门菌对腺样囊性癌荷瘤裸鼠肿瘤血管生成的抑制作用.方法:4周龄BALB/c nu nu雄鼠25只,随机分成5组,对照组(PBS组)、单纯减毒沙门菌组(SL7207组)、携带人IFN-γ基因减毒沙门菌治疗组(SL7207/pCI-IFN组)、携带Tip30基因减毒沙门菌治疗组(SL7207/pCI-Tip30组)、携带Tip30与人IFN-γ基因的真核共表达质粒的重组减毒沙门菌治疗组(SL7207/pCI-Tip30/IFN组),均于颌下接种腺样囊性癌(ACC-2)细胞.10 d后对照组裸鼠口服PBS,其余各治疗组口服相应的减毒沙门菌,隔周1次,共3次.然后检测肿瘤生长体积、带瘤存活期、裸鼠体内肿瘤的微血管密度(MVD).结果:各治疗组比较对照组、携带基因治疗组比较SL7207组、联合基因治疗组比较单基因治疗组肿瘤生长慢、体积小,带瘤存活期长(P<0.05);携带Tip30基因治疗组MVD较其他3组低,联合基因组较携带Tip30单基因组MVD低(P<0.05).结论:减毒沙门菌载体分别介导Tip30、IFN-γ基因有抑制肿瘤生长作用,联合基因较单基因治疗效果好,有协同作用.     

新疆维、汉族宫颈癌相关细胞因子的表达及临床意义

目的：对比新疆维、汉族 HPV16阳性的宫颈癌（CC）患者外周血中1型辅助性 T 细胞（Th1）、Th2和 Th17细胞主要分泌的细胞因子干扰素‐γ（IFN‐γ）、白细胞介素‐2（IL‐2）、IL‐4、IL‐6、IL‐10、IL‐13、IL17表达水平的差异性,并探讨维、汉族CC患者细胞因子与临床分期及肿瘤分化程度的相关性。方法采集66例（汉族22例,维吾尔族44例）经该院病理科明确诊断为CC患者治疗前的血标本,使用Luminex检测技术检测IFN‐γ、IL‐2、IL‐4、IL‐6、IL‐10、IL‐13、IL‐17的水平,对比维、汉患者细胞因子的差异;根据患者临床分期和肿瘤分化程度进行分组,在不同亚组中,比较维、汉患者细胞因子水平的差异性。结果维族CC组IFN‐γ、IL‐2、IL‐4、IL‐6、IL‐10、IL‐13、IL‐17高于汉族CC组（P＜0．05）;而维族Ⅰ～Ⅱ期CC组Th细胞分泌的IL‐2、IL‐4、IL‐10高于汉族Ⅰ～Ⅱ期CC组（P＜0．05）;维族Ⅲ～Ⅳ期CC组 Th细胞分泌的IFN‐γ、IL‐2、IL‐4、IL‐6、IL‐10、IL‐13、IL‐17高于汉族Ⅲ～Ⅳ期CC组（P＜0．05）;维族中高分化CC组Th细胞分泌的IFN‐γ、IL‐2、IL‐4、IL‐6、IL‐10、IL‐13、IL‐17高于汉族中高分化CC组（P＜0．05）。结论在HPV16阳性的CC患者中,Th细胞分泌的细胞因子水平在维、汉组之间是存在差异性的,而这种差异性在Ⅲ～Ⅳ期宫颈癌和中高分化宫颈癌中更加明显。     

SL7207/pBud-VP3-IL-24的肿瘤靶向性及其对胃癌细胞免疫作用研究

目的 探讨基于白细胞介素(IL)-24的减毒沙门菌载体SL7207/pBud-VP3-IL-24对胃癌细胞的靶向性及肿瘤免疫作用.方法 建立小鼠胃癌细胞荷瘤模型,将SL7207/pBud-VP3-IL-24(A组)、SL7207/pBud(B组)、生理盐水(C组)经口服饲喂胃癌荷瘤小鼠,分别采用组织匀浆菌落计数、RT-PCR分析及荧光蛋白定位检测减毒沙门菌株SL7207、apoptin-EGFP融合绿色荧光蛋白及IL-24基因在小鼠体内的分布,苏木精-伊红(HE)染色观察肿瘤组织病理变化,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法、乳酸脱氢酶(LDH)释放法及中性红试验检测淋巴细胞增殖反应、自然杀伤细胞(NK细胞)毒作用及腹腔巨噬细胞吞噬活性.结果 在A组治疗后7d,小鼠肿瘤组织发现有减毒沙门菌株SL7207;随着时间推移,肿瘤组织中细菌数量逐渐增多,第21天,肿瘤组织中细菌数量比其他组织明显增多(P＜0.05).病理切片提示胃癌组织细胞溶解坏死.同时,IL-24基因和apoptin-EGFP蛋白在肿瘤组织有所表达,RT-PCR定量显示IL-24基因在肿瘤组织较其他组织多(P＜0.05).MTT和LDH实验显示,A组淋巴细胞增殖(0.75±0.11)和NK细胞活性(0.38±0.06)％明显高于B、C组,差异有统计学意义(P＜0.05).中性红实验结果提示,A组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能增强(0.49±0.10),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 SL7 207/pBud-VP3-IL-24对胃癌组织具有靶向性,能在肿瘤组织优先表达其携带基因及蛋白,并通过增强机体非特异性免疫功能来调节抗肿瘤免疫.     

S100A4 siRNA 对佐剂性关节炎大鼠炎症及细胞因子的影响

目的：研究S100A4 siRNA对关节炎大鼠炎症及细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF‐α）、IL‐1β和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法建立大鼠佐剂性关节炎模型,造模后第11天给模型干扰组大鼠关节腔内注射 S100A4 siRNA 片段。观察各组大鼠关节炎指数（AI）的变化及踝关节的病理变化;ELISA 检测血清 TNF‐α、IL‐1β和 VEGF 的表达变化。结果模型干扰组大鼠 TNF‐α、IL‐1β和 VEGF 表达水平均比模型组降低（P＜0．05）;AI 值及踝关节病理积分与模型组比较显著下降,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论抑制 S100A4基因表达,能显著降低致炎细胞因子 TNF‐α、IL‐1β及促血管生成因子 VEGF 的表达,减轻关节滑膜的病理损伤。     

氢饱和生理盐水对大鼠重症急性胰腺炎肺损伤的保护作用

目的：探讨静脉注射氢饱和生理盐水（HRS）对牛磺胆酸钠诱导的大鼠重症急性胰腺炎相关性肺损伤（APALI）是否具有保护作用及其可能的机制。方法将54只健康SD雄性大鼠分成假手术组（Sham组）、模型组（SAP＋ NS组）和 HRS处理组（S A P＋ H RS组）,各组再按时间点每个亚组分成6、12、24 h 3个亚组,每个时间点处死6只大鼠。收集血清、肺组织及胰腺组织。检测血清TNF‐α、IL‐1β水平;肺组织湿干质量比;测定肺组织中 TNF‐α、IL‐1βmRNA的表达;并对胰腺组织、肺组织损伤进行病理学评价。结果（1）SAP＋ NS组和SAP＋ HRS组血清中 TNF‐α、IL‐1β水平、胰腺和肺组织病理评分、肺组织 TNF‐α、IL‐1βmRNA的表达,肺组织湿干质量比在6、12、24 h各个时间点均高于Sham组（P＜0．05）。（2）SAP＋ HRS组与SAP＋ NS组比较,SAP＋ HRS组血清TNF‐α水平、肺组织TNF‐αmRNA的表达、肺组织湿干质量比在各个时间点均低于SAP＋ NS组（均P＜0．05）。血清IL‐1β水平、胰腺和肺组织病理评分、肺组织中IL‐1βmRNA表达在6 h时两组间差异无统计学意义（P＞0．05）,但在12、24 h时SAP＋ HRS组低于SAP＋NS组（均 P＜0．05）。结论 HRS可能是通过其选择性抗氧化作用抑制了氧化应激损伤相关细胞因子表达来实现对APALI的保护。     

荷瘤小鼠口服重组减毒鼠伤寒沙门菌后瘤体内富集效果的观察

目的观察重组减毒鼠伤寒沙门菌作为基因载体在人涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤中的富集情况和对外源基因的呈递能力。方法以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,以减毒鼠伤寒沙门菌SL7207为转基因载体,分别构建原核启动GFP表达的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207-pUC-GFP和真核启动GFP表达的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207-pEG-FP-N1。原核菌SL7207-pUC-GFP在体外连续传代,观察GFP基因表达的稳定性;同时,对荷人涎腺腺样囊性癌皮下移植瘤裸鼠模型口服给予原核菌SL7207-pUC-GFP(0.1mL,1×109cfu/mL),在口服后24h、48h、5d、10d、20d、30d处死荷瘤裸鼠,获取肝、脾及肿瘤组织并制成匀浆液进行重组菌培养及GFP表达检测,观察重组菌在瘤体细胞内富集情况。对荷瘤裸鼠模型口服给予真核菌SL7207-pEGFP-N1,5d后取肝、脾及肿瘤组织进行冰冻组织切片,荧光显微镜下观察GFP的表达,了解重组菌携带外源基因在肿瘤细胞内的表达。结果携带GFP原核表达的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207-pUC-GFP在体外连续传代10次未见表达减少或缺失。荷瘤裸鼠口服原核表达GFP基因重组菌SL7207-pUC-GFP菌液实验表明,重组菌SL7207-pUC-GFP在肝、脾及肿瘤组织中能长期存活,以肿瘤组织中聚集明显(P<0.05)且维持时间较长。荷瘤裸鼠口服真核表达GFP基因重组菌SL7207-pEGFP-N1菌液实验表明,相对肝脏和脾脏组织,外源基因在肿瘤细胞内表达量最高。结论重组减毒鼠伤寒沙门菌可以在瘤体细胞内富集存活,并且携带的外源基因可以释放到肿瘤细胞内表达,具有作为基因治疗载体的双重优势。     

重组人脂联素基因在减毒沙门氏菌中的表达

目的：构建携带人脂联素（AdipoQ）基因真核表达载体并在减毒沙门氏菌中表达,为AdipoQ对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的基因治疗提供依据.方法：从人脂肪组织中提取总RNA,通过实时荧光定量PCR（rRT-PCR）方法获得Adi-poQ基因并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,构建pEG-FP-N1-AdipoQ重组载体.重组质粒经鉴定后再电转入减毒沙门氏菌SL7207中表达.结果：克隆的人AdipoQ基因744bp测序结果显示：1个碱基发生突变,654位：A→T,突变率为0.1%,氨基酸Glu→Asp.经SDS-PAGE,Western Blot检测融合蛋白Mr约为55×10^3（绿色荧光蛋白Mr约为27×10^3）,能够被AdipoQ抗体识别.结论：成功构建携带AdipoQ基因真核表达载体的减毒沙门氏菌株,AdipoQ基因能够在减毒沙门氏菌中表达并与绿色荧光蛋白融合.为进一步研究其在NAFLD中的作用机制奠定了基础.     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白DNA疫苗的构建及其免疫保护作用

目的:构建携带幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(Hp neutrophil-activating protein,Hp-NAP)基因(napA)活减毒鼠伤寒沙门菌重组DNA疫苗,初步观察其对慢性Hp感染的免疫保护作用.方法:应用基因工程技术扩增全长napA,测序并经同源性分析后,将其亚克隆入真核表达载体pIRES,鉴定正确后将重组质粒转化活减毒鼠伤寒沙门菌构建Hp-NAP口服DNA疫苗.口服Hp-SS1建立SS1长期感染小鼠模型,30周后随机均分为3组,每组各5只.治疗组予109cfu/0.4 ml疫苗菌灌胃,1次/周×3周;2个对照组分别予等体积生理盐水或空白质粒.末次免疫4周后行快速尿素酶检测,ELISA测定血清抗体效价.结果:重组真核表达质粒pIRES-napA成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207;所克隆napA与GenBank中SS1-na-pA核苷酸和蛋白质的同源性均＞98%.免疫后4周治疗组75%(3/4)小鼠快速尿素酶检测阴性,对照组均阳性,差异显著(P＜0.05);治疗组血清抗Hp-NAP抗体效价明显升高.结论:成功构建了具有较好免疫保护作用的Hp-NAP口服重组DNA疫苗,为进一步研制多价抗Hp核酸疫苗奠定了基础.     

携带ePNP基因的减毒伤寒沙门菌的构建及目的基因在胰腺癌细胞中的表达

目的构建含有pEGFP-C1-PNP质粒的减毒鼠伤寒沙门菌SL3261菌株,检测其在胰腺癌细胞BxPc-3中的表达。方法 PCR扩增得到PNP基因,构建真核表达载体pEGFP-C1-PNP,并进行酶切、PCR和测序鉴定。利用电转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261,进行形态学和表面抗原稳定性检测。含质粒SL3261菌株与BxPc-3细胞体外共培养,利用荧光显微镜观察和RT-PCR检测绿色荧光蛋白的表达和PNP基因的转录。结果目的基因正确连接pEGFP-C1中,并成功转入减毒鼠伤寒沙门菌,感染细胞亦检测到目的基因的表达。结论成功构建了能携带ePNP基因真核表达质粒的SL3261菌株,且该基因能在胰腺癌细胞中正确表达。     

mtHSP70/HSV-tk重组沙门菌抗小鼠黑色素瘤的作用

目的研究携带结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)、人单纯疱疹病毒一胸苷激酶(HSV-TK)双基因的重组沙门菌瘤内注射抗小鼠黑色素瘤的抑瘤效应。方法构建重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK,建立小鼠黑色素瘤动物模型,瘤内注射重组沙门菌观察其抑瘤效应、荷瘤鼠的生存期并进行安全性评估。结果瘤内注射重组沙门菌,实验组抑瘤率显著高于对照组,延长荷瘤鼠生存期,重组菌治疗后荷瘤小鼠的生存状态良好,无腹泻,治疗期间体质量无明显改变。结论减毒沙门菌携带的mtHSP70/HSV-TK双基因真核共表达质粒瘤内注射对B16肿瘤细胞具有显著抑制作用。     

携带flk-l的减毒沙门疫苗菌抗胶质瘤血管生成的研究

目的观察表达鼠血管内皮生长因子受体2(VEGFR2,flk-1)的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌对胶质瘤荷瘤小鼠的抗肿瘤血管及肿瘤生长抑制作用。方法构建真核表达载体pcDNA3 1.-flk-l,通过电转化法将pcDNA3 1.-flk-1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中,经由胃管饲于C57BL/6J小鼠,对胶质瘤荷瘤小鼠进行免疫预防及治疗。通过观察免疫动物的生存期,免疫荧光法检测肿瘤血管密度,评价重组疫苗菌的抗血管及肿瘤生长抑制作用。分离免疫小鼠的脾细胞,分析重组疫苗菌免疫后小鼠体内的特异性细胞毒性T细胞(CTL)应答。结果重组疫苗菌免疫能够明显减少肿瘤血管密度,延缓胶质瘤的生长,延长小鼠生存期,获得明显的抗肿瘤效果。重组疫苗菌免疫后可诱导小鼠脾淋巴细胞产生针对flk-l的CTL活性。结论表达鼠flk-l的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌经口服免疫,可打破小鼠对于自身抗原flk-1的免疫耐受,诱导小鼠产生抗flk-1的特异性免疫反应,特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞,预防和治疗小鼠胶质瘤。     

Anti-angiogenesis Effect on Glioma of Attenuated Salmonella Typhimurium Vaccine Strain with flk-1 Gene

To investigate the anti-vasculature effects and the anti-glioma effects of attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing VEGFR2 (flk-1) gene, plasmid pcDNA3, 1-flk1 was constructed and electro-transfected into live attenuated Salmonella typhimurium strain SL7207. Mouse models of intracranial G1261 glioblastoma were treated with an orally administered attenuated Salmonella typhimurium expressing flk-1 gene. The survival period was recorded and vessel density was observed by immunofluorescence. CTLs activity was measured by MTT assay. Our results showed that attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing flk-1 gene could significantly inhibit glioblastoma growth, reduce vessel density, prolong the survival period and improve the survival rate in these mice. The flk-1 specific CTLs activity was increased obviously after the vaccination. Our study showed that attenuated Salmonella typhlmurium vaccine strain expressing flk-1 gene could break peripheral immune tolerance a in glioma gainst this self-antigen and kill endothelial cells by the orally administered vaccine and can be used for both prophylactic and therapeutic purposes.     

Oral immunization of mice with vaccine of attenuated Salmonella typhimurium expressing Helicobacter pylori urease B subunit

Objective To prepare the live recombinant vaccine of attenuated Salmonella typhimurium SL3261 expressing Helicobacterpylori （H. pylori） B subunit （UreB） and to determine whether it could be used as an oral vaccine against H. pylori infection. Methods Using genomic DNA of H. pylori Sydney strain （SS1） as template, the H. pylori UreB gene fragment was amplified by PCR and subcloned into the expression vector pTC01. The recombinant plasmid pTC01-UreB was then transferred into LBS000 to obtain modified forms, and further conversed into the attenuated Salmonella typhimurium SL3261 to obtain recombinant SL3261/pCT01-UreB as an oral immunization reagent, which was then used to orally immunize Balb/c mice twice at a three-week interval. Twelve weeks later, anti-UreB IgA antibodies in intestinal fluid and IgG antibodies in sera were determined by ELISA. The relating data in control groups （including body weight, gastric inflammation, etc.） were also collected. Results The sequencing analysis showed that the UreB gene fragment amplified by PCR was consistent with the sequence of the H. pylori UreB gene. The restriction enzyme digestion revealed that the correct pTC01-UreB was obtained. SDS-PAGE and Western blot showed that a 61KD protein was expressed in SL3261/pTC01-UreB, which could be recognized by anti-H, pylori UreB antiserum and was absent in the control containing only Salmonella typhimurium SL3261 strain. The multiple oral immunization with SL3261/pTC01-UreB could significantly induce H. pylori specific mucosal IgA response as well as serum IgG responses. IFN-T and IL-10 levels were significantly increased in SL3261/pTC01-UreB group, and no obvious side effect and change in gastric inflammation were observed. Conclusion The attenuated vaccine of Salmonella typhimurium expressing H. pylori UreB can be used as an oral vaccine against H. pylori infection.     

Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimurium expressing Helicobacter pylori urease B subunit

Objective To establish attenuated Salmonella typhimurium producing Helicobacter pylori (H. pylori) urease subunit B （UreB） and determine whether it could be used as an oral vaccine against H. pylori. Methods H. pylori (SS1 strain) UreB gene fragment amplified by PCR was cloned into the prokaryotic expression vector pTC01 after sequencing, and then transformed into attenuated Salmonella typhimurium SL3261 to acquire SL3261/pTC01- UreB. The expression of H. pylori UreB in SL3261 was detected by Western blot. Twelve weeks after oral immunization of mice,antibody responses were evaluated using serum and intestinal fluid by ELISA assay. Interferon- γ （IFN- γ） and interleukin- 10 （IL- 10） in the supernatant of spleen cells culture were also assessed by ELISA. In vitro stability of pTC01- UreB plasmid in SL3261 was confirmed by growing in Luria Broth (LB) medium to 80 generations.Results The UreB gene fragment amplified by PCR was consistent with the sequence of the H. pylori UreB as evidenced by sequence analysis. Enzyme digestion revealed that the correct pTC01- UreB was obtained. Western blot showed that a 61kDa protein was expressed in SL3261/pTC01- UreB, which could be recognized by anti- H. pylori UreB antiserum. After 80 generations of continuous culture, the recombinant plasmid pTC01- UreB was stable in SL3261 and had no obvious toxicity. Multiple oral immunizations with SL3261/pTC01- UreB could significantly induce H. pylori- specific mucosal IgA response as well as serum IgG response. Moreover, there were significant increases of IFN- γand IL- 10 in the SL3261/pTC01- UreB group. Finally, no obvious side effects for mice and no change in gastric inflammation were observed.Conclusion Attenuated Salmonella typhimurium expressing H. pylori UreB may be used as oral vaccine against H. pylori infection.     

幽门螺杆菌尿素酶减毒鼠伤寒杆菌疫苗诱导小鼠粘膜免疫应答的研究

目的:观察口服减毒鼠伤寒杆菌活菌重组疫苗后小鼠的粘膜免疫应答状况。方法:将已构建成功的表达幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B亚单位(UreB)的重组减毒鼠伤寒杆菌SL3261/pTC01-UreB口服免疫Balb/c小鼠,12周后检测肠液和血清中的特异性抗体反应。结果:疫苗组小鼠的肠液和血清中可分别检测到针对UreB的特异性抗体IgA和IgG,病理学检查显示疫苗组小鼠较对照组小鼠胃粘膜炎症程度差异无统计学意义。结论:表达H.pyloriUreB的减毒鼠伤寒杆菌SL3261/pTC01-UreB能够诱导小鼠产生抗H.pylori的粘膜免疫,可用作抗H.pylori感染的口服疫苗。