Skp2 shRNA表达质粒的构建及其对肺癌细胞生长的影响

目的 构建Skp2基因的RNAi真核表达质粒,观察其对SIC-A-1肺癌细胞内Skp2基因表达及细胞生长的影响.方法 根据GenBank中Skp2cDNA序列设计针对Skp2基因的shRNA序列,合成序列并克隆人pGenSil-1质粒中,构建skp2 pshRNA重组质粒.脂质体介导重组质粒转染SPC-A-1肺癌细胞.RT-PCR检测肺癌细胞Skp2 mRNA的表达,Western blot检测Skp2蛋白表达.MTT检测各纽细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期改变.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功.转染重组质粒的肺癌细胞Skp2 mRNA和蛋白的表达明显下降(P<0.05),细胞生长增殖受到抑制,阻滞在G0/G1期的细胞比例增加,而进入S期的细胞比例明显下降(P<0.05).结论 构建的Skp2 shRNA表达质粒能有效下调Skp2基因的mRNA及蛋白的表达、抑制细胞的生长增殖.     

转染针对黑色素瘤抗原编码基因的短发夹RNA真核表达载体对SGC7901细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察转染针对黑色素瘤抗原编码基因(NRAGE)的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对SGC7901细胞增殖及凋亡的影响.方法:用特异性shRNA 真核表达载体pSuper-EGFP-NRG转染SGC7901胃癌细胞,经G418筛选, 应用RT-PCR方法检测转染细胞NRAGE mRNA的表达,应用流式细胞术检测转染细胞增殖与凋亡.结果:体外培养的pSuper-EGFP-NRG转染的SGC7901胃癌细胞中NRAGE基因被沉默,G0～G1期、G2期细胞百分率降低,S期细胞百分率增多(P<0.05).结论:NRAGE基因参与了SGC 7901细胞周期和细胞凋亡的调控.     

Skp2基因沉默对大肠癌细胞SW480生物学特性的影响

目的:观察Skp2基因沉默对人大肠癌SW480细胞增殖与凋亡的影响。方法:通过细菌内同源重组法,构建含有H1启动子驱动、表达绿色荧光蛋白(GFP)标志和Skp2基因干扰片段的腺病毒骨架载体。通过测序鉴定后在HEK293细胞中包装成腺病毒,并扩增纯化。体外感染人大肠癌SW480细胞,在荧光显微镜下观察GFP表达,以确定转染效率;用蛋白免疫印迹技术检测基因沉默效率。用MTT比色法检测细胞生长率,流式细胞技术检测细胞周期和凋亡。结果:琼脂糖电泳和测序鉴定表明针对Skp2基因干扰片断的碱基序列及插入位点完全正确;Skp2基因沉默后影响大肠癌SW480细胞的周期进程,使其发生G0/G1期阻滞,抑制了细胞的增殖,使其生长速度减缓;并促使大肠癌SW480细胞凋亡。结论:Skp2基因沉默后影响大肠癌SW480细胞的细胞周期,发生G0/G1期阻滞,抑制了细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。     

UbcH10基因沉默对肺癌NCI-H226细胞增殖及细胞周期的影响

目的：通过脂质体转染siRNA方法沉默人肺鳞癌细胞NCI-H226中UbcH10基因,观察基因沉默后细胞增殖活性的变化及其对细胞周期的影响。方法：设计3条针对UbcH10基因CDS区不同位点的siRNA序列并构建shRNA表达载体,脂质体法转染重组质粒至NCI-H226细胞。转染后48小时,RT-PCR,Western-blot检测细胞内UbcH10 mRNA及蛋白含量。使用有效siRNA序列（pshRNA2）转染细胞,转染后24、48小时CCK-8检测细胞活性。使用有效siRNA序列转染细胞,转染后48小时收集细胞,流式法检测细胞周期。结果：成功构建shRNA重组质粒并转染NCI-H226细胞。转染siRNA 48小时后,3组NCI-H226细胞中UbcH10基因的mRNA及蛋白含量均明显下降;其中2号siRNA序列的沉默效果最好,UbcH10基因剩余表达量为对照组的14%。使用有效序列转染NCI-H226细胞24、48小时,细胞增殖活性明显降低,与基因未干预组比较,差异显著（P＜0.05）。使用有效序列转染NCI-H226细胞48小时,细胞明显阻滞于G2期,与基因未干预组比较有显著差异（P＜0.05）。结论：UbcH10基因沉默,可显著抑制NCI-H226细胞增殖活性,并使肺癌细胞阻滞于细胞G2期。     

S 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因沉默抑制乳腺癌MCF7细胞生长的研究

目的探讨S 腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）基因沉默对乳腺癌MCF 7细胞增殖及侵袭能力的抑制作用。方法用特异性沉默SAMDC基因表达的RNA干扰真核表达载体SAMDC shRNA表达载体(pGPU6 SAMDC)转染乳腺癌MCF 7细胞,采用RT PCR和Western blot技术分别检测SAMDC mRNA和蛋白质表达水平;细胞增殖实验（CCK 8法）和细胞周期分析评价SAMDC基因沉默对乳腺癌MCF 7细胞增殖的影响,肿瘤侵袭实验观察SAMDC基因沉默对乳腺癌细胞MCF 7侵袭活性的影响。结果SAMDC shRNA表达载体转染后,MCF 7细胞SAMDC mRNA水平下调43.8％,蛋白表达水平下降66.5％;MCF 7细胞的增殖活性和侵袭能力均受到明显抑制,细胞增殖活性下降37%,细胞周期分析G1期细胞增加。结论SAMDC基因沉默可通过延长细胞周期的G1期而抑制乳腺癌MCF7细胞的增殖,并能降低癌细胞侵袭活性,提示SAMDC可作为乳腺癌基因治疗的靶分子。     

shRNA 沉默YAP基因对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨慢病毒干扰载体沉默Yes-相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法：用细胞免疫荧光法检测肾癌786-O细胞中YAP蛋白表达情况;构建针对YAP基因的shRNA慢病毒干扰载体转染786-O细胞。RT-PCR和Western blot分别检测干扰786-O细胞前后 YAP mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8（cell counting kit-8）法检测沉默YAP后细胞增殖的改变;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡和周期的变化。结果：786-O细胞中YAP蛋白表达于细胞浆和细胞核;shRNA-YAP慢病毒干扰载体转染4 d后,可明显下调786-O细胞YAP mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）,并且明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡（P=0.000）;细胞周期紊乱,G1 期细胞明显增加,S期细胞明显降低（P=0.000）。结论：YAP-shRNA慢病毒干扰载体能有效抑制YAP基因在786-O细胞中表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。     

siRNA沉默livin基因对食管癌细胞生长与凋亡的影响

目的观察小分子干扰RNA（siRNA）沉默livin基因在食管癌细胞中的表达情况,探讨livin基因对食管癌细胞生长、凋亡的影响。方法自行设计两条针对livin基因的siRNA：livin—sh-1,livin—sh-2,构建相应的表达载体分别转染至对数生长期的食管癌,经G418筛选后采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、MTT、TUNEL分别比较检测转染前后食管癌细胞livin基因的表达。结果siRNA对照组与空siRNA载体组的livinw／β mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05）;但转染siRNA组Livinl／2mRNA表达显著降低,明显低于siRNA对照组和空siRNA载体组（P〈0．05）。细胞生长曲线测定经F检验三组间差异无统计学意义。转染siRNA载体沉默livina／β表达,细胞凋亡率显著增加。结论siRNA沉默livin基因能抑制食管癌细胞的生长,促进食管癌细胞的凋亡,livin基因有可能成为食管癌治疗的新靶点。     

CHK1 shRNA对HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术沉默CHK1基因的表达,观察其对高表达CHK1的宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖、凋亡的影响.方法 构建针对CHK1的短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)真核表达质粒,将该质粒通过脂质体转染法导入HeLa细胞,以RT-PCR和Western blot法分别检测其CHK1基因和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化,MTT法检测细胞的增殖.结果 shRNA能明显降低HeLa细胞表面CHK1的表达,与对照组和空载体转染组相比, shRNA转染组HeLa细胞CHK1 mRNA水平下降了66%,蛋白水平下降了60%(P<0.05).此外,shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显增加,增殖活性明显降低, 而且G2/M期细胞百分率显著下降.对照组、空载体转染组和shRNA转染组的G2/M期细胞百分率分别为(53.96±1.35)%、(54.08±1.39)%和(15.10±0.87)%(P<0.05).结论 CHK1shRNA能明显增加HeLa细胞的凋亡,抑制该细胞的增殖,削弱其G2/M期阻滞,为进一步研究CHK1在肿瘤治疗中的作用机制提供实验基础.     

沉默id1基因表达对食道癌细胞Eca-109生物学行为的影响

目的 探讨靶向沉默分化抑制因子1基因(id1)的短发夹RNA(shRNA)表达质粒载体对食道癌细胞生物学行为的影响.方法 设计针对id1基因的shRNA序列,合成序列并克隆入pGFU6/neo质粒中.重组质粒转染食道癌细胞,RT-PCR检测id1基因mRNA的表达,Western blot检测Id1、p16及增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达.台盼蓝染色、克隆形成实验检测细胞生长,流式细胞仪检测细胞增殖以及各周期分布.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功.转染重组质粒的食道癌细胞id1 mRNA和蛋白的表达明显下降 (P<0.05),食道癌细胞增殖受到抑制,G0/G1期细胞比例增加,而S期的细胞比例明显下降(P<0.05).结论 构建的id1 shRNA表达质粒能有效下调id1基因的表达和抑制食道癌细胞增殖.     

ALCAM基因1沉默对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制

目的 探讨活化白细胞黏附分子(ALCAM)基因沉默对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,并对其分子机制进行初步研究.方法 将ALCAM 和对照shRNA转染至胃癌细胞SGC-7901中,建立稳定细胞系,分别采用实时荧光定量(RT-PCR)技术和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测转染后SGC-7901细胞中ALCAM mRNA和蛋白水平;采用CCK-8法检测转染后SGC-7901细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测转染后SGC-7901细胞凋亡情况.采用胃癌肿瘤模型分析ALCAM基因沉默对肿瘤生长的影响.结果 ALCAM shRNA稳定细胞系ALCAM mRNA(1.01 ±0.26)和蛋白质的表达水平(1.66 ±0.23)低于对照 shRNA组细胞ALCAM mRNA(0.12 ±0.06)和蛋白质水平(0.23 ±0.09),差异有统计学意义(P<0.05).与对照shRNA稳定细胞系比较,ALCAM shRNA 稳定细胞系细胞增殖活性下降(P<0.05)、凋亡水平升高(P<0.05)、荷瘤小鼠肿瘤生长速度减缓(P<0.05).ALCAM下调并不影响总蛋白激酶B(AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达,而降低了AKT和mTOR磷酸化水平,抑制了mTOR活性,此外,ALCAM蛋白敲低提高了Caspase-3蛋白的表达水平,激活了凋亡信号通路.结论 ALCAM基因沉默能够降低胃癌细胞中ALCAM的表达水平,抑制胃癌细胞的增殖,增加细胞凋亡.     

沉默ADRB2基因对卵巢上皮性癌细胞生物学特性及顺铂敏感性的影响

目的 探讨下调β2型肾上腺素受体(beta-2 adrenergic receptor,ADRB2)基因表达对卵巢上皮性癌细胞顺铂敏感性以及细胞增殖、凋亡的影响及机制。 方法 以人卵巢癌细胞株SKOV3/DDP为研究对象,采用小RNA干扰技术沉默ADRB2的表达,实验分为4组:ADRB2 shRNA1感染组、ADRB2 shRNA2感染组、阴性对照shRNA感染组、未感染的SKOV3/DDP细胞作为空白对照组。采用不同浓度(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)顺铂作用后,采用CCK-8法检测4组卵巢癌细胞的生长抑制率,流式细胞仪检测4组细胞的凋亡率,Western blot法检测4组卵巢癌细胞中caspase-9、Bcl-2及Bax蛋白的表达,采用单因素方差分析进行比较。 结果 不同浓度的顺铂处理后,4组细胞的生长抑制率均逐渐升高,且呈剂量依赖性。2组ADRB2 shRNA感染细胞的顺铂耐药IC50分别为(29±8)μmol/L和(32±11)μmol/L,明显低于阴性对照组[(104±15)μmol/L,P<0.01]和空白对照组[(112±10)μmol/L,P<0.01];4组细胞的凋亡率逐渐增加,且呈剂量依赖性。2组ADRB2 shRNA感染细胞的凋亡率均明显高于阴性对照组(P<0.01)。4组细胞的caspase-9、Bax蛋白的表达水平逐渐增加,且呈浓度依赖性,2组ADRB2 shRNA感染细胞的caspase-9、Bax蛋白水平均明显高于阴性对照组(均P<0.05)。4组细胞的Bcl-2蛋白的表达水平逐渐降低,且呈浓度依赖性,2组ADRB2 shRNA感染细胞的Bcl-2蛋白水平均明显低于阴性对照组(均P<0.05)。 结论 顺铂诱导可使ADRB2基因下调的顺铂耐药卵巢癌细胞的增殖减少、凋亡增加,其可能机制为通过调节caspase-9、Bcl-2和Bax凋亡家族蛋白的表达,从而增加细胞对顺铂的敏感性。      

RNAi抑制Survivin基因的表达对乳腺癌SKBr-3细胞的影响

目的 应用RNA干扰技术抑制人Survivin基因表达,观察其对乳腺癌SKBr-3细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计、合成靶向Survivin基因的siRNA基因片段,应用脂质体包埋转染乳腺癌SKBr-3细胞,采用MTT比色法检测细胞增殖率、RT-PCR和Western blot法观察乳腺癌细胞Survivin mRNA和蛋白质的表达、流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 MTt检测显示Survivin-siRNA组对细胞增殖有明显抑制作用(P<0.05),其细胞最高抑制率为(43.1±O.3)%;RT-PCR检测显示Survivin-siRNA组mRNA表达明显下调(P<0.01),其相对表达量分别为0.203 ±0.018、0.229±0.019,抑制率分别为55.2%、49.4%;Western blot检测显示Survivin-siRNA组蛋白表达下调(P<0.01),其蛋白相对表达量分别为0.702±0.007、0.684±0.016,抑制率分别为34.8%、36.4%;流式细胞仪检测显示Survivin-siRNA组细胞凋亡率明显增高(P<0.01),分别为(14.2±1.4)%、(16.8±0.6)%.结论 Survivin-siRNA能有效封闭Survivin的表达,抑制SKBr-3细胞增殖并诱导细胞凋亡,推测Sur-vivin基因可能成为乳腺癌基因治疗的一个新靶点.     

shRNA 介导GSTP1 基因沉默对激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145 的影响

目的:探讨谷胱甘肽巯基转移酶P1 (glutathione S-transferase P1,GSTP1) 基因沉默对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145 增殖活性和对化学治疗药物敏感性的影响。方法:根据选取靶序列形成短发卡状RNA(short hairpinRNA, shRNA) 的DNA 模板设计3 条表达载体(shRNA255, shRNA554, shRNA593),并克隆到质粒pGPU6/GFP/Neo。经酶切和测序鉴定,筛选转染率最高基因沉默效果最好的shRNA 作RNA 干扰。DU145 细胞株分为空白质粒转染组和shRNA 转染组。转染前后按化学治疗药物分为氟尿嘧啶(fluorouracil,FU) 组及紫杉醇(paclitaxel,PA) 组,并按作用浓度(FU:30,60,120,240 μg/mL;PA:0.2,2,10,20 μg/mL) 分别分成4 个亚组,并分别设有一个空白对照组。四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT] 比色法检测转染后细胞增殖活性的变化,MTT 及末端脱氧核苷酸转移酶介导脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法(terminal de-oxynucleotidyl transferasemediateddUTP nick end labeling,TUNEL) 检测转染前后不同浓度FU 和PA 对DU145 细胞抑制增殖及诱导凋亡的效果。结果:3 条表达载体(pGPU6/GFP/Neo-shRNA255, pGPU6/GFP/Neo-shRNA554, pGPU6/GFP/Neo-shRNA593) 的转染率分别为(63.3±1.04)%,(76.2±0.68)%,(72.7±0.33)%,shRNA554 转染率最高,三者之间比较差异有统计学意义(P<0.01)。转染后mRNA 含量分别为128.31±2.50,43.24±4.30 和85.62±6.30,GSTP1 蛋白含量分别为163.92±12.40,65.38±9.30和114.25±16.70,shRNA554 转染后GSTP1 基因mRNA 和蛋白含量均最低,三者比较差异有统计学意义(P<0.01)。MTT 检测转染前FU 不同浓度 (30, 60, 120, 240 μg/mL) 四个亚组作用后细胞存活率分别为(95.60±2.11)%,(90.20±0.86)%,(83.10±3.12)% 和(74.60±1.32)%;转染后存活率为(91.30±1.43)%,(84.6±2.13)%,(73.2±1.52)% 和(65.5±0.94)%。TUNEL 检测转染前FU 不同浓度(30, 60, 120, 240 μg/mL) 四个亚组作用后细胞凋亡率分别为(5.50±0.88)%,(10.20±1.64)%,(15.20±2.39)% 和(25.10±2.59)%;转染后凋亡率(10.80±0.62)%,(15.70±1.32)%,(20.40±1.89)% 和(34.90±2.54)%。转染后相同FU 浓度下细胞存活率降低,凋亡率增加,差异均具有统计学意义(P<0.01)。MTT 检测转染前PA 不同浓度(0.2, 2, 10, 20 μg/mL) 四个亚组作用后细胞存活率为(98.50±2.34)%,(95.20±1.32)%,(89.40±0.68)%和(82.70±1.73)%;转染后存活率为(94.2±0.78)%,(86.5±2.13)%,(78.7±1.34)% 和(70.1±0.76)%。TUNEL 检测转染前PA 不同浓度 (0.2, 2, 10, 20 μg/mL) 四个亚组作用后细胞凋亡率分别为(2.4±1.07)%,(5.2±1.33)%,(10.5±2.41)%和(20.7±1.92)%;转染后凋亡率(5.46±2.13)%,(13.8±1.24)%,(21.2±2.39)% 和(29.2±2.21)%。转染后相同PA浓度下细胞存活率降低,凋亡率增加,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:shRNA 介导的GSTP1 基因沉默可抑制雄激素非依赖型前列腺癌DUl45 细胞增殖活性,诱导凋亡,并且其作用呈现时间依赖性,可提高其对于化学治疗的药物敏感性。     

左金丸醇提物抑制幽门螺旋杆菌感染人胃癌细胞增殖及诱导凋亡的实验研究

目的研究左金丸醇提物对幽门螺旋杆菌感染人胃癌MKN45细胞生长及凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法以不同浓度(7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500μg/mL)的左金丸醇提物分别作用于幽门螺旋杆菌感染的人胃癌MKN45细胞,24、48、72h后用Western blot法检测不同浓度的左金丸醇提物作用于幽门螺旋杆菌感染人胃癌MKN45细胞时凋亡相关蛋白Bax、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的表达情况。结果幽门螺旋杆菌感染MKN45细胞组、左金丸醇提物低剂量(40μg/mL)组、左金丸醇提物高剂量(180μ/mL)组凋亡细胞百分比分别为:(0.28±0.105)%、(3.27±0.702)%、(7.7±0.721)%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05),凋亡率呈剂量依赖性;Western blot检测结果显示,左金丸醇提物低、高剂量作用幽门螺旋杆菌感染MKN45细胞24h后,PARP蛋白(89×103)、Bax蛋白表达明显增强,凋亡率上升,并呈现剂量依赖性。结论左金丸醇提物能抑制幽门螺旋杆菌感染人胃癌MKN45细胞的增殖并诱导细胞发生凋亡。调控凋亡相关基因Bax、PARP的表达可能是其诱导幽门螺旋杆菌感染的人胃癌MKN45细胞凋亡的分子机制之一。     

shRNA干扰沉默Mcl-1基因对淋巴瘤细胞系增殖的影响

目的研究慢病毒介导的髓细胞白血病基因(Mcl-1)短发夹状RNA(shRNA)干扰对淋巴瘤细胞系SNK-6增殖和凋亡的影响。方法设计以Mcl-1为靶点的shRNA并构建携带此shRNA的慢病毒载体,转染淋巴瘤细胞系SNK-6,荧光定量PCR(qPCR)及Western blot方法检测病毒感染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达变化,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)和流式细胞仪分析细胞增殖和凋亡变化的情况。结果成功构建Mcl-1-shRNA慢病毒表达载体,并可有效感染淋巴瘤细胞株SNK-6,感染后SNK-6细胞Mcl-1基因的mRNA水平及蛋白水平表达明显下调,MTT法检测显示慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰与对照病毒组相比可明显抑制SNK-6细胞增殖[(31.6±3.3)%vs(5.8±2.7)%,P<0.01],流式细胞仪测定感染后细胞凋亡明显高于对照病毒组[(28.9±2.1)%vs(5.3±1.5)%,P<0.01]。结论慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰技术可特异性阻断SNK-6细胞Mcl-1基因的表达,抑制细胞的增殖并促进细胞的凋亡。     

shRNA抑制survivin基因表达对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的：研究靶向存活素（survivin）的短发夹 RNA真核表达质粒（shRNA）对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响。方法合成靶向survivin的shRNA真核表达质粒及阴性对照质粒,用脂质体法将质粒转染至经 VEGF（50 ng／mL）处理的HUVEC细胞;转染48 h后,采用实时定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白印迹法检测 HUVEC中survivin的mRNA表达及蛋白水平。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖;TUNEL 法检测细胞凋亡。结果（1）survivin‐shRNA 质粒试验组与阴性对照shRNA质粒组及空白对照组比较,转染48 h后人脐静脉血管内皮细胞survivin的mRNA及蛋白表达水平明显下降（P＜0．05）。（2）与阴性对照shRNA组及空白对照组比较,转染后的人脐静脉血管内皮细胞增殖能力明显下降。转染后24、48、72 h生长抑制率分别为（13．53±3．91）％、（38．97±1．82）％、（65．75±1．83）％,于转染后72 h最为显著。（3）试验组凋亡率为（28．07±1．71）％,较阴性对照组（11．45±1．52）％和空白对照组（10．04±1．46）％显著增高（P＜0．05）。结论靶向survivin的shRNA质粒能通过下调survivin表达,进而抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖并促进其凋亡。